專利名稱：烏賊墨寡肽及其酶解制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種烏賊墨寡肽，本發(fā)明還公開了利用胰蛋白酶進(jìn)行烏賊墨寡肽酶解 的制備方法，本發(fā)明進(jìn)一步還公開了該烏賊墨寡肽在人前列腺癌上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
烏賊(Si5Pia)屬于軟體動(dòng)物門頭足綱烏賊目烏賊科。烏賊的營養(yǎng)豐富，除可食 用外，還具有很好的藥用價(jià)值。尤其是烏賊的墨汁，早在《本草拾遺》中就有“腹中墨， 主治血刺心痛”的記載。烏賊墨囊一般是作為廢棄物，自從日本表森縣產(chǎn)業(yè)技術(shù)開發(fā)中 心和弘前大學(xué)醫(yī)學(xué)部發(fā)現(xiàn)烏賊墨含有抗腫瘤物質(zhì)以來，科學(xué)家們對其抗腫瘤活性進(jìn)行 研究，發(fā)現(xiàn)其具有多種抗腫廇機(jī)制，如烏賊墨有提高免疫功能，誘生細(xì)胞因子，抑制癌細(xì) 胞生長的作用。國內(nèi)的公開文獻(xiàn)可以參考《現(xiàn)代食品科技》Vol 21 No. 1，文章篇號為 1007-2764(2005)01-0069-21，杜鐵平等著的“烏賊墨抗菌活性的分離與研究”，又可以參考 《中國腫瘤》2005年第14卷第3期，劉淑萍所著的“烏賊墨抗腫瘤作用研究進(jìn)展”，再可以參 考《中國藥師》2003年第6卷第10期，李孝東和袁建華所著的“烏賊墨抗腫瘤機(jī)制研究進(jìn) 展”。這些充分顯示了烏賊墨在抗腫瘤藥物開發(fā)具有十分顯著的潛在價(jià)值，因此挖掘其潛在 的藥用價(jià)值對充分利用海洋資源、擴(kuò)大藥源也有深遠(yuǎn)意義。生物活性肽的制備主要有三條途徑一是從自然界的生物體中提取其本身固有的 各種天然活性肽類物質(zhì)；二是通過蛋白質(zhì)降解的途徑可以獲得具有各種生理功能的生物活 性物質(zhì)；三是應(yīng)用合成方法來制備生物活性肽。將這三種方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行比較，蛋白質(zhì)酶 降解法生產(chǎn)活性肽安全性極高，能在溫和的條件下進(jìn)行定位水解分裂產(chǎn)生特定的肽，且水 解過程易控制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對上述的技術(shù)現(xiàn)狀而提供一種活性高、抗腫瘤顯 著的烏賊墨寡肽。本發(fā)明所要解決的又一個(gè)技術(shù)問題是提供一種活性高、反應(yīng)條件易于控制的烏賊 墨寡肽酶解制備方法。本發(fā)明所要解決的再一個(gè)問題是提供一種烏賊墨寡肽在人前列腺癌上的應(yīng)用。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為烏賊墨寡肽，其特征在于該烏賊 墨寡肽的N端氨基酸序列為Gln-Pro-Lys。一種烏賊墨寡肽酶解制備方法，其特征在于包括如下步驟①樣品的制備，將鮮烏賊墨原料勻漿，烏賊墨勻漿后原料與超純水的比值1 0 1 3，調(diào)節(jié)PH值至7.0 8. 5 ；②加入胰蛋白酶，加酶量為0. 032g/ml 0. 096g/ml，在水浴箱中酶解，酶解溫度 為35 53°C，滅活，離心，取上清液；③分離與純化，經(jīng)過超濾和S印hadex G_25層析分離；
④收集，于280nm處檢測，收集各峰洗脫液。作為優(yōu)選，步驟③所述的超濾為將樣品清液加入超濾杯，收集3KD分子量以下的 酶解液，進(jìn)行冷凍干燥。作為優(yōu)選，步驟③所述的Si^phadex G-25層析分離為將樣品用蒸餾水進(jìn)行溶解，離 心，取上清液，過0. 45 μ m微孔濾膜，取樣品溶液過S印hadex G-25柱，用蒸餾水為洗脫液， 平衡和洗脫。作為優(yōu)選，步驟①中料液比為1 1，ρΗ值為8，步驟②中的酶解時(shí)間為8 20小 時(shí)，酶解溫度為45 51 °C，加酶量為0. 064g/ml。進(jìn)一步，還包括步驟⑤對收集后的樣品進(jìn)行純度檢測。烏賊墨寡肽在人前列腺癌上的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于采用胰蛋白酶進(jìn)行酶解，結(jié)合優(yōu)化的反應(yīng)條 件，所得產(chǎn)物氨基氮含量高，即代表所得寡肽含量高，純度高，并且，整個(gè)過程易于控制，同 時(shí)，所得的酶解物寡肽對人前列腺癌細(xì)胞DU-145有明顯的抑制增殖作用，且隨著藥物濃度 和作用時(shí)間的增加，細(xì)胞抑制率也明顯增加，因此具有醫(yī)學(xué)藥用價(jià)值。


圖1為不同時(shí)間各酶氨基氮生成比較柱狀圖。圖2為G-25洗脫峰值圖。圖3為胰蛋白酶酶解后樣品的高效液相檢測烏賊墨寡肽純度檢測圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。1、材料1. 1動(dòng)物烏賊購于舟山南珍菜場1. 2細(xì)胞株人前列腺癌細(xì)胞株DU-145株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所 細(xì)胞庫。1. 3主要試劑HamF12培養(yǎng)基，Gibco公司；胎牛血清(FBS)，杭州四季青生物制 品有限公司；CCK-8，杭州昊天生物技術(shù)有限公司；胰蛋白酶，北京西美杰科技公司；胃蛋白 酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶，亞太恒信生物科技有限公司；福林酚，上海如吉生物發(fā)展有限 公司1. 4主要儀器SSW-420-2S恒溫水浴鍋，上海民儀電子有限公司；BSW-100-Z⑶自動(dòng)部分收集器，上海琪特分析儀器有限公司；BT1-IOO恒流泵，上海琪特分析儀器有限公司；
PHS-250PH計(jì)，上海理達(dá)儀器廠；CF16RXII日立低溫離心機(jī)，日本日立公司；DS-I組織搗碎機(jī)，上海標(biāo)本模型廠；752FC紫外分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司LGJ-18冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司
4
高效液相色譜儀(P1201依利特)，大連依利特分析儀器有限公司G-25分子篩凝膠，上海如吉生物發(fā)展有限公司超濾杯、超濾膜，上海摩速科學(xué)器材有限公司；超凈臺F0rma3111，上海智城分析儀器制造有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱ZHJM-C12090，杭州寶城生物科技有限公司；酶標(biāo)儀(美國BI0-RAD)；杭州寶城生物科技有限公司；微量震蕩器，上海精密儀器有限公司2、方法2. 1細(xì)胞培養(yǎng)人前列腺癌DU-145細(xì)胞接種于含10% (體積分?jǐn)?shù))FBS、雙抗溶液 (青霉素G 100IU/mL、鏈霉素100IU/mL)的HamF12培養(yǎng)基中，置于37°C、5% C02、95%飽和 濕度條件下的孵箱中常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長，每2 3天換液1次，當(dāng)細(xì)胞生長匯合時(shí)，按 1 3傳代，每周傳代1 2次。用0.25%胰蛋白酶/0.02% EDTA混合消化液消化，收集對 數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2. 2細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)(CCK-8法)將DU-145細(xì)胞以每孔5 X IO3個(gè)細(xì)胞數(shù)接種 于96孔培養(yǎng)板中，每孔培養(yǎng)液200 μ L0貼壁生長后，每組細(xì)胞分別加入藥物濃度5mg/ml， 10mg/ml, 15mg/ml, 20mg/ml, 25mg/ml, 30mg/ml烏賊墨提取物，對照組加入等體積培養(yǎng)液，每 個(gè)藥物濃度設(shè)8個(gè)復(fù)孔。置于37°C，5% C02條件下分別孵育24h。每孔加入CCK-8溶液 IOy L，置37°C，5% C02條件下繼續(xù)孵育4h終止培養(yǎng)。選擇450nm波長，在酶標(biāo)儀上測定 各孔光密度值D450，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。按下列公式計(jì)算細(xì)胞抑制率腫瘤細(xì)胞抑制率(％)= (對照組D45tl-用藥組D45tl) /對照組D45tlX 100%。2. 3氨基態(tài)氮以及酶活力的測定氨基態(tài)氮采用中性甲醛滴定法。于250ml燒杯 中加個(gè)60蒸餾水，加入酶解上清液5ml，開動(dòng)磁力攪拌器，用0. 05M的NaOH標(biāo)準(zhǔn)液滴定到 酸度計(jì)指示PH8. 2，記錄消耗NaOH的ml數(shù)；再加入10ml40%的中性甲醛，混勻。用上述的 NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液繼續(xù)滴定到pH9. 2，記錄消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的ml數(shù)，同時(shí)做空白試驗(yàn)。
權(quán)利要求
一種烏賊墨寡肽，其特征在于該烏賊墨寡肽的N端氨基酸序列為Gln Pro Lys。
2.一種烏賊墨寡肽酶解制備方法，其特征在于包括如下步驟①樣品的制備，將鮮烏賊墨原料勻漿，烏賊墨勻漿后原料與超純水的比值1 0 1 3，調(diào)節(jié)pH值至7.0 8.5 ；②加入胰蛋白酶，加酶量為0.032g/ml 0. 096g/ml，在水浴箱中酶解，酶解溫度為 35 53°C，滅活，離心，取上清液；③分離與純化，經(jīng)過超濾和Si^phadexG-25層析分離；④收集，于280nm處檢測，收集各峰洗脫液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟③所述的超濾為將樣品清液加入 超濾杯，收集3KD分子量以下的酶解液，進(jìn)行冷凍干燥。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟③所述的Si^phadexG-25層析 分離為將樣品用蒸餾水進(jìn)行溶解，離心，取上清液，過0. 45 μ m微孔濾膜，取樣品溶液過 Sephadex G_25柱，用蒸餾水為洗脫液，平衡和洗脫。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟①中料液比為1 1，pH值為8， 步驟②中的酶解時(shí)間為8 20小時(shí)，酶解溫度為45 51°C，加酶量為0. 064g/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于還包括步驟⑤對收集后的樣品進(jìn)行純 度檢測。
7.—種如權(quán)利要求1所述的烏賊墨寡肽在人前列腺癌上的應(yīng)用。
全文摘要
一種烏賊墨寡肽，其特征在于該烏賊墨寡肽的N端氨基酸序列為Gln-Pro-Lys。本發(fā)明還公開了烏賊墨寡肽利用胰蛋白酶進(jìn)行酶解制備的方法，本發(fā)明還公開了該烏賊墨寡肽在人前列腺癌上的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于采用胰蛋白酶進(jìn)行酶解，結(jié)合優(yōu)化的反應(yīng)條件，所得產(chǎn)物氨基氮含量高，即代表所得寡肽含量高，純度高，并且，整個(gè)過程易于控制，同時(shí)，所得的酶解物寡肽對人前列腺癌細(xì)胞DU-145有明顯的抑制增殖作用，且隨著藥物濃度和作用時(shí)間的增加，細(xì)胞抑制率也明顯增加，因此具有醫(yī)學(xué)藥用價(jià)值。
文檔編號C12P21/06GK101983968SQ20101029612
公開日2011年3月9日 申請日期2010年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月26日
發(fā)明者丁國芳, 莊黛娜, 徐銀峰, 楊最素, 楊永芳, 郁迪, 鄭玉寅, 黃芳芳 申請人:浙江海洋學(xué)院