專利名稱：一種烏賊墨肽聚糖的制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種烏賊墨肽聚糖的制備方法，尤其是ー種采用水提法提取烏賊墨肽聚糖的制備方法，本發(fā)明還公開了該烏賊墨肽聚糖在人前列腺癌上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
烏賊(Sepia)屬于軟體動物門頭足綱烏賊目烏賊科。烏賊的營養(yǎng)豐富，除可食用夕卜，還具有很好的藥用價(jià)值。尤其是烏賊的墨汁，含有多糖類活性物質(zhì)黑色蛋白，有明顯的抗腫瘤活性。現(xiàn)有研究表明，烏賊墨具有抗腫瘤、提高免疫、抗菌、止血和延緩衰老等作用。烏賊墨作為ー種廢棄物，國內(nèi)外的科學(xué)家們對其抗腫瘤活性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)具有多種抗腫瘤機(jī)制，如提高免疫，誘生細(xì)胞因子，抑制癌細(xì)胞增長的作用。國內(nèi)的文獻(xiàn)可以參考《中醫(yī)中 藥》2002年第19卷第10期，張永軍等著的“復(fù)方烏賊墨膠囊對小鼠細(xì)胞免疫功能的促進(jìn)作用”，又可以參考《福建中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)》2004年第14卷第I期，黃枚所著的“烏賊墨抗癌活性的實(shí)驗(yàn)研究”，再可以參考《臨床藥物學(xué)》2005年第11卷第9期，王欣等所著的“烏賊墨的藥理作用研究進(jìn)展”。這些充分說明了烏賊墨中含有顯著的抗腫瘤活性物質(zhì)，且在抗腫瘤藥物和功能產(chǎn)品開發(fā)中具有明顯的潛在價(jià)值，也為充分利用海洋生物資源提供了有意義的途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供ー種操作方便的烏賊墨肽聚糖的制備方法，所制備的烏賊墨肽聚糖活性高、抗腫瘤效果顯著。本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是提供一種烏賊墨肽聚糖在人前列腺癌上的應(yīng)用。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為一種烏賊墨肽聚糖的制備方法，其特征在于包括如下步驟I)取新鮮烏賊墨勻漿，用丙酮脫脂；2)加入2 5倍體積的0. 08 0. 12M濃度的Tris-Hcl緩沖液在3-5°C下浸泡8 24h進(jìn)行提取，離心后超濾，或者多次上述重復(fù)提取、離心，然后合并每次上清液、再超濾；こ醇沉淀和sevag試劑除蛋白，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，冷凍干燥；3)DEAE-52離子交換層析柱分離，將步驟2)中的冷凍干燥物分別用Tri S-Hcl緩沖液，NaCL溶液0. lmol/L lmol/L進(jìn)行梯度洗脫，紫外280nm檢測吸光度，同時(shí)采用苯酚-硫酸法檢測糖峰，收集峰值洗脫液，在490nm處檢測糖峰，收集最佳峰的洗脫液，透析除鹽，冷凍干燥；4)采用S印hadex G-75凝膠柱色譜分離純化，于280nm處檢測，收集洗脫液，冷凍
干燥；5)將步驟4)所得樣品進(jìn)行純度檢測，通過高效液相和SDS-PAGE凝膠電泳。作為優(yōu)選，所述步驟I中的丙酮脫脂為在勻漿液中加入2 4倍體積的丙酮于-15 -25°C中進(jìn)行脫脂。作為優(yōu)選，所述步驟2)中的sevag試劑的配比為氯仿與正丁醇的體積比例3 I。進(jìn)ー步優(yōu)選,所述步驟3)中的梯度洗脫的洗脫速度Iml I. 5ml/min,姆管4 6ml o最后，所述步驟4)所述的S印hadex G_75凝膠柱色譜分離的步驟為將步驟②所得樣品溶于蒸懼水，過G-75凝膠柱,洗脫速度0. 8ml I. 5ml/min,與280nm處檢測，收集洗脫液，冷凍干燥。一種烏賊墨肽聚糖在人前列腺癌上的應(yīng)用。如在抗前列腺癌DU-145細(xì)胞抑制增殖上的應(yīng)用，或者，在抗前列腺癌PC-3細(xì)胞抑制増殖上的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于提取條件簡便、操作易控制，且制備成本較低，同時(shí)所制得的肽聚糖對人前列腺癌細(xì)胞DU-145、PC-3具有很強(qiáng)的細(xì)胞抑制増殖作用， 并且隨藥物濃度及作用時(shí)間的増加，細(xì)胞抑制率也明顯增加，與為抗前列腺癌提供了一條可行性研究途徑，因此具有醫(yī)學(xué)藥用價(jià)值，易于推廣應(yīng)用。


圖I為DEAE-52洗脫峰值圖；圖2為G-75洗脫峰值圖；圖3為柱子洗脫后樣品的高效液相檢測烏賊墨肽聚糖純度檢測圖；圖4為SDS-PAGE電泳條帶圖；圖5紫外全波長掃描圖；圖6為紅外光譜掃描具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)ー步詳細(xì)描述。I 材料I. I動物烏賊購自舟山菜場，剝下墨囊_20°C冷藏備用。I. 2細(xì)胞株人前列腺癌細(xì)胞DU-145和PC_3均購自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫。I. 3主要試劑HamF12培養(yǎng)基，Gibco公司；胎牛血清(FBS)，杭州四季青生物制品有限公司；萄聚糖凝膠S印hadex G-75和DEAE-52陰離子交換柱均購自于上海源葉生物科技有限公司；MTT均購自美國SIGMA公司；ニ甲基亞砜購自美國AMRESC0公司；こ腈購自寧波海曙恒隆實(shí)驗(yàn)器材有限公司；其余試劑均為分析純。I. 4主要儀器DS-I組織搗碎機(jī)，上海標(biāo)本模型廠；BSA124S型電子天平，德國Sartorius AG公司；SSW-420-2S恒溫水浴鍋，上海民儀電子有限公司；BSW-100-Z⑶自動部分收集器，上海琪特分析儀器有限公司；BT1-100恒流泵，上海琪特分析儀器有限公司；PHS-250PH計(jì)，上海理達(dá)儀器廠；
CF16RX TI日立低溫離心機(jī)，日本日立公司；752FC紫外分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；LGJ-18冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；高效液相色譜儀(P1201依利特)，大連依利特分析儀器有限公司；MSC300超濾杯(超濾膜3KDa)，上海摩速科學(xué)器材有限公司；超凈臺Forma3111，上海智城分析儀器制造有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱ZHJM-C12090，杭州寶城生物科技有限公司； 酶標(biāo)儀(美國BI0-RAD)，杭州寶城生物科技有限公司；微量震蕩器，上海精密儀器有限公司。2 方法2. I肽聚糖制備和質(zhì)構(gòu)研究2. I. I樣品提取從烏賊中取出墨囊，破壞墨囊，用組織搗碎機(jī)搗碎，收集烏賊墨，然后向?yàn)踬\墨中加入2倍體積的丙酮置于-20°C中脫脂12h，過濾，收集殘留物，冷凍干燥備用。向?yàn)踬\墨加中入3倍體積的Tris-Hcl緩沖液(PH6. 8)，在4°C下浸泡24h，然后在IOOOOrpm下離心25min,去上清液，再將沉淀物中加入3倍體積的Tris-Hcl緩沖液(PH6. 8)，在4°C下浸泡24h，然后在IOOOOrpm下離心25min，去上清液，合并2次上清。用3000的超濾膜超濾，除去部分雜質(zhì)，加入5倍體積的無水こ醇沉淀，在4°C下浸泡12h，去掉上清液，收集沉淀，將肽聚糖提取物溶于Tris-Hcl緩沖液中，加入sevag試劑(氯仿與正丁醇的比例為3 1)，4°C過夜分層，倒出上清液，重復(fù)操作2次，去除游離的蛋白等雜質(zhì)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，冷凍干燥備用。2. I 2樣品分離純化將上述冷凍干燥物過DEAE-52離子交換層析柱(I. 6*40cm)，分別用Tris-Hcl緩沖液，NaCL溶液0. Imol/L、0. 3mol/L和0. 5mol/L4個(gè)梯度進(jìn)行梯度洗脫，洗脫速度lml/min，每管4ml，紫外280nm檢測吸光度，同時(shí)采用苯酚-硫酸法檢測糖峰，收集峰值洗脫液，在490nm處檢測糖峰，收集最佳峰的洗脫液，透析除鹽，冷凍干燥。將上述冷凍干燥后的樣品溶于蒸餾水，過S印hadex G_75 (3. 6*50cm)，洗脫速度0. 8ml/min,6min/管,與280nm處檢測，收集洗脫液,冷凍干燥。2. 1.3高效液相檢測肽聚糖純度色譜條件=IOOO-IO-C18 (10 X 250mm)色譜樣；流動相こ睛-水(I 4);體積流量:1. Oml/min ;上樣量20u L ;檢測波長:280nm。2. I. 4聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析采用15%的SDS-PAGE電泳膠，考察純化后肽聚糖的電泳行為，用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行染色。2. I. 5紫外全波長掃描和紅外光譜測定將樣品在190-400nm之間掃描，檢測峰值的波長。采用KBr壓片，在400-4000CHT1之間掃描，測定紅外光譜2. 2抗前列腺癌活性研究2. 2. I細(xì)胞培養(yǎng)人前列腺癌DU-145和PC3細(xì)胞接種于含10% (體積分?jǐn)?shù))FBS、雙抗溶液(青霉素G100IU/mL、鏈霉素100IU/mL)的HamF12培養(yǎng)基中，置于37°C、5% C02、95%飽和濕度條件下的孵箱中常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長，每2 3天換液I次，當(dāng)細(xì)胞生長匯合時(shí)，按I : 3傳代，每周傳代I 2次。用0. 25%胰蛋白酶/0. 02% EDTA混合消化液消化，收集對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2. 2. 2細(xì)胞增殖抑制率的測定采用MTT法進(jìn)行檢測。配制PBS溶液(PH值為7. 2)和一定濃度的酶解多肽溶液。取對數(shù)生長期的前列腺癌細(xì)胞制成懸液，接種至96孔板，每孔200 ii L，于5% CO2, 37°C貼壁4h，然后分別加入酶解多肽溶液，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行孔，同時(shí)設(shè)不加藥對照組，置5% CO2, 37°C培養(yǎng)箱中孵育，培養(yǎng)結(jié)束加入180 u LMTT和20 y L PBS繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸棄96孔板的液體，加入150 ii L的DMS0，充分混合。置酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm測吸光度,計(jì)算細(xì)胞增埴抑制指數(shù)(IR)，按下列公式計(jì)算。 IR =[(對照組A值-藥物組A值)/對照組A值]X 100 %
3 結(jié)果3. I分離純化如圖I所示，肽聚糖粗提物經(jīng)過DEAE-52纖維素離子交換柱，經(jīng)Tris-HCl緩沖液和NaCl溶液洗脫得到的蛋白峰和糖峰，其中第3個(gè)峰的蛋白峰和糖峰重疊性最好，且峰值最高，為0. 3MNaCl溶液洗脫得到，收集該組分冷凍干燥。如圖2所示，將干燥物經(jīng)S印hadex G-75凝膠柱后，得到的洗脫峰，為ー個(gè)明顯單一大峰。3. 2高效液相純度測定結(jié)果如圖3和4所示，高效液相純度檢測的結(jié)果顯示，通過超濾、DEAE-52和G_75分離純化得烏賊墨肽聚糖單ー組分，且條帶在分子量約130kD處顯示。3. 3紫外和紅外掃描譜圖如圖5所示，樣品在199nm和280nm處各有ー吸收峰，說明其中含有糖和蛋白成分。如圖6所示，紅外光譜掃描顯示，在3398. 31CHT1處，有-OH伸縮振動，在2933. SOcnT1處，是C-H伸縮振動，在1395. 19cm1也有峰，這些均為糖類物質(zhì)的特征峰；1654. 21cm1處有強(qiáng)吸收峰為酰胺鍵C = 0伸縮振動，1534. 6(311^4為N-H鍵的變腳振動；1034. &lcm\1062. 63CHT1，1126. 75cm_1,在 1000-1200cm_1 范圍內(nèi)，這組峰為 C-O-C 伸縮振動和 C-O-H 伸縮振動；另外，可以初步確定糖苷鍵的類型，若在840cm—1附近有吸收峰為a構(gòu)型，若在SSOcnT1附近有吸收峰為P構(gòu)型。由光譜掃描可知，本樣品為糖和蛋白的復(fù)合物。3. 5MTT檢測烏賊墨肽聚糖對DU-145和PC3細(xì)胞增殖活性的影響將肽聚糖設(shè)置5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml 和 25mg/ml 五個(gè)濃度組，分別測定作用 24h 和 48h 后，對DU-145和PC-3細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明，烏賊墨肽聚糖對DU-145和PC-3都具有增殖抑制活性，且呈現(xiàn)時(shí)效和量效關(guān)系。(表I)表I烏賊墨肽聚糖對人前列腺癌DU-145和PC-3細(xì)胞増殖的影響(ズ土、n = 3)
權(quán)利要求
1.一種烏賊墨肽聚糖的制備方法，其特征在于包括如下步驟 1)取新鮮烏賊墨勻漿，用丙酮脫脂； 2)加入2 5倍體積的0.08 0. 12M濃度的Tris-Hcl緩沖液在3_5°C下浸泡8 24h進(jìn)行提取，離心后超濾，或者多次上述重復(fù)提取、離心后，然后合并、超濾；再こ醇沉淀和sevag試劑除蛋白，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，冷凍干燥； 3)采用DEAE-52離子交換層析柱分離，將步驟2)中的冷凍干燥物分別用Tris-Hcl緩沖液，NaCL溶液0. lmol/L lmol/L進(jìn)行梯度洗脫，紫外280nm檢測吸光度，同時(shí)采用苯酚-硫酸法檢測糖峰，收集峰值洗脫液，在490nm處檢測糖峰，收集最佳峰的洗脫液，透析除鹽，冷凍干燥； 4)采用SephadexG-75凝膠柱色譜分離純化，于280nm處檢測，收集洗脫液,冷凍干燥； 5)將步驟③所得樣品進(jìn)行純度檢測，通過高效液相和SDS-PAGE凝膠電泳。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于所述步驟I中的丙酮脫脂為在勻漿液中加入2 4倍體積的丙酮于-15 _25°C中進(jìn)行脫脂。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于所述步驟2)中的sevag試劑的配比為氯仿與正丁醇的體積比例3 I。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于所述步驟3)中的梯度洗脫的洗脫速度Iml I. 5ml/min, %管 4 6mlml。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于所述步驟4)所述的S印hadexG_75凝膠柱色譜分離的步驟為將步驟②所得樣品溶于蒸餾水，過G-75凝膠柱，洗脫速度0. 8ml I.5ml/min,與280nm處檢測，收集洗脫液,冷凍干燥。
6.ー種根據(jù)權(quán)利要求I至5任ー權(quán)利要求所述的制備方法所制備的烏賊墨肽聚糖在人前列腺癌上的應(yīng)用。
7.ー種根據(jù)權(quán)利要求I至5任ー權(quán)利要求所述的制備方法所制備的烏賊墨肽聚糖在抗前列腺癌DU-145細(xì)胞抑制増殖上的應(yīng)用。
8.ー種根據(jù)權(quán)利要求I至5任ー權(quán)利要求所述的制備方法所制備的烏賊墨肽聚糖在抗前列腺癌PC-3細(xì)胞抑制増殖上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種烏賊墨肽聚糖的制備方法和應(yīng)用，其特征在于步驟為將烏賊墨勻漿，丙酮脫脂，用Tris-Hcl緩沖液提取，離心后超濾，然后乙醇沉淀和sevag試劑除蛋白，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，冷凍干燥；接著分別采用DEAE-52離子交換層析柱和Sephadex G-75凝膠柱色譜進(jìn)行分離純化，收集洗脫液，冷凍干燥得到烏賊墨肽聚糖。本發(fā)明提取條件簡便、操作易控制，制備成本較低，同時(shí)所制得的肽聚糖對人前列腺癌細(xì)胞DU-145、PC-3具有很強(qiáng)的細(xì)胞抑制增殖作用，并且隨藥物濃度及作用時(shí)間的增加，細(xì)胞抑制率也明顯增加，與為抗前列腺癌提供了一條可行性研究途徑，因此具有醫(yī)學(xué)藥用價(jià)值，易于推廣應(yīng)用。
文檔編號C07K1/16GK102757476SQ201110112848
公開日2012年10月31日 申請日期2011年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月26日
發(fā)明者丁國芳, 莊黛娜, 李 榮, 楊最素, 楊永芳, 王加斌, 郁迪, 鄭玉寅, 黃芳芳 申請人:浙江海洋學(xué)院