專利名稱：一種opn基因的克隆、表達(dá)與蛋白純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種骨橋蛋白(OPN)基因的克隆、表達(dá)與蛋白純化方法。
背景技術(shù)：
骨橋蛋白(osteopontin,0PN)于1983年由Herring等在骨基質(zhì)中分離出來(lái),是一種具有多種功能分泌型鈣結(jié)合磷酸化糖蛋白。OPN屬于小整合素結(jié)合配體N端聯(lián)接糖蛋白家方矣(small integrin binding ligand, N-Iingked glycoproteins ,SIBLING)中的一員，其相對(duì)分子量約為41-75 kD。人類OPN基因定位于4ql3，是一個(gè)獨(dú)立編碼基因，由7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子組成。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，其外顯子有3個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNPs)區(qū)域，其中2個(gè)、分別位于6號(hào)和7號(hào)外顯子，另一個(gè)位于7號(hào)外顯子翻譯區(qū)。人的OPN分子一般由信號(hào)肽序列、7-10個(gè)連續(xù)ASP序列、GRGDS (甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-絲氨酸)結(jié)構(gòu)域、α 9β I、α 4β I結(jié)構(gòu)域和肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。研究表明，OPN參與了胰腺癌，宮頸癌，前列腺癌等癌癥的發(fā)生、轉(zhuǎn)移，尤其引人關(guān)注的是，近年研究發(fā)現(xiàn)，OPN在胰腺癌腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)，并與胰腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，胰腺癌是一種惡性程度很高的腫瘤，在美國(guó)占癌癥死亡原因的第五位，其發(fā)病率和死亡率幾乎相同，未經(jīng)治療者一年生存率大約20%，5年生存率不到4%。在我國(guó)，胰腺癌發(fā)病率呈逐步上升趨勢(shì)，是導(dǎo)致人口死亡的十大惡性腫瘤之一。研究表明，侵襲(invasion)和轉(zhuǎn)移(metastasis)是目前胰腺癌患者治療失敗的主要原因。因此，OPN蛋白的表達(dá)純化用于研究和治療胰腺癌已成為近年來(lái)的熱點(diǎn)。由于OPN蛋白主要為分泌型蛋白，在細(xì)胞外作用，含量極少，因此從生物體中直接純化得率低，純度不高，操作繁瑣，成本也較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種克隆、表達(dá)、分離純化骨橋蛋白(osteopontin, 0ΡΝ)的方法,該方法包括如下步驟
(1)重組克隆載體TA-OPN的構(gòu)建；
(2)重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-0PN的構(gòu)建；
(3)OPN蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定；
(4)OPN蛋白的純化和鑒定。具體地，上述方法步驟(I)分為如下步驟
(I)OPN的引物設(shè)計(jì)
以pET28a (+) -OPN為模板，通過(guò)拼接PCR擴(kuò)增0ΡΝ，設(shè)計(jì)出4條引物OPNp I、0PNp2、0PNpl-G-3，、 0PNp2-G-5，。上游引物OPNpl含有內(nèi)切酶位點(diǎn)I，下游引物mE7p2含有內(nèi)切酶位點(diǎn)歷·/ (!III,OPNpl :5’ -CGCATATGGCTAGCATGACTGGTGGA-3’
OPNpI-G-3’ 5’ -TAATTGCTCATAACCGTAGAGATCAGTTG-3’
0PNp2-G-5’ 5’ -CAACTGATCTCTACGGTTATGAGCAATT-3’
0PNp2 :5’ -CGAAGCTTTTAGATGGGGCACACAATTC-3>
(2)拼接PCR擴(kuò)增OPN基因片段 以pET28a (+) -OPN為模板，通過(guò)拼接PCR擴(kuò)增OPN基因片段，先擴(kuò)增Nde I與OPN基因第76堿基中間的片段(138bp，稱為I-OPN84)和OPN基因第56-297位堿基序列(稱為OPN56^297)ο PCR反應(yīng)體系(Pyrobest 酶):41. 25 μ L無(wú)菌水，5 μ L IOXbuffer(含MgCl2), I μ LIOmM dNTPs,I μ L OPNpl/OPNpl-G-3’，I μ L 0PNp2_G_5，/0ΡΝρ2，0· 5 μ L pET28a(+)-OPN,O. 25 μ L Pyrobest酶，混勻后立即進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3min ;然后進(jìn)行以下35 個(gè)循環(huán)94°C 45s, 56°C lmin,72°C 45s ;最后在 72°C延伸 3min。上述PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠90V恒壓電泳20min，切膠后用膠回收試劑盒回收目的片段，再拼接PCR擴(kuò)增I-OPN序列。PCR反應(yīng)體系(Pyrobest酶)39. 75μ L無(wú)菌水，5 μ L IOXbuffer (含 MgCl2), IyL IOmM dNTPs, I μ L OPNpl, I μ L 0PNp2, ImL NdeI-OPN84,1 μ L 0ΡΝ56_297，O. 25 μ L Pyrobest酶，混勻后立即進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3min ;然后進(jìn)行以下35個(gè)循環(huán)94°C 45s, 56°C lmin，72°C 45s ;最后在72°C延伸3min。瓊脂糖凝膠電泳、膠回收DNA片段，為便于用Taq酶延伸加A，膠回收的洗脫緩沖液使用含MgCl2的Taq酶緩沖液，用25 μ L膠回收洗脫緩沖液洗脫P(yáng)CR擴(kuò)增的DNA片段，取13. 7μ L 的膠回收洗脫液，加入 I. 2μ L IOmM dOTl^PO.lyL Taq 酶，72°C 延伸 6min，PCR 產(chǎn)物延伸A。(3) TA克隆連接
取I μ L PMD18-T載體，加入2 μ L延伸過(guò)A的OPN片段，再加入5 μ L的連接緩沖液，2 μ L無(wú)菌水補(bǔ)足至10 μ L體系，于16°C連接2hr。(4) TA克隆轉(zhuǎn)化
將上述TA連接產(chǎn)物IOyL轉(zhuǎn)移到DH5a感受態(tài)細(xì)胞中；冰上靜置30min ；42 °C熱激90s ;冰上再靜置5min ;加入800 μ L LB, 37 V搖床120rpm搖lhr ；4000rpm離心3min ;在超凈臺(tái)中移去大部分上清，輕懸沉淀，涂布于含50 μ g/mL氨節(jié)青霉素(Amp)的LB (Luria-Bertani)平板中；LB平板倒置于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜。(5) TA克隆的鑒定
隨機(jī)挑取4個(gè)TA陽(yáng)性克隆，接入4mL LB (Amp+)中；37°C搖床220rpm搖過(guò)夜；抽提質(zhì)粒ΤΑ-0ΡΝ，保存于-80°C，并進(jìn)行雙酶切和PCR鑒定，選取雙酶切和PCR都為陽(yáng)性的TA克隆質(zhì)粒測(cè)序。具體地，上述方法步驟(2)具體分為如下步驟
(O酶切與回收
OPN基因序列中有I酶切位點(diǎn)(0ΡΝ上游引物中引入)，用I/Hind III雙酶切TA-OPN及pET-28a(+)質(zhì)粒，用1%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收目標(biāo)片段。(2 ) T4 DNA連接酶連接及轉(zhuǎn)化
連接體系為=IuL IOX連接酶緩沖液，lμL雙酶切pET-28a(+)質(zhì)粒，7 μ L OPN片段，IuL Τ4 DNA連接酶，16°C連接過(guò)夜。
將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5a感受態(tài)，轉(zhuǎn)化后涂布于含50 μ g/mL卡那霉素(Kan)的LB平板上，37 °C倒置培養(yǎng)過(guò)夜。(3)陽(yáng)性克隆鑒定
隨機(jī)挑取4個(gè)陽(yáng)性克隆，接入4mL的LB (Kan+)中；37°C搖床220rpm搖過(guò)夜；抽提質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切(&oR l/Η η III)和PCR鑒定。具體地，上述方法步驟(3)具體分為如下步驟
(I)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌
將上述鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒pET_28a(+) -OPN轉(zhuǎn)入感受態(tài)Rosetta，涂布于LB平板(Kan+)上，37°C倒置培養(yǎng)過(guò)夜。(2)異丙基硫代半乳糖昔(IPTG)誘導(dǎo)蛋白表達(dá)
挑單克隆于LB (Kan+)中，37°C搖床，220rpm培養(yǎng)過(guò)夜，以1:50接過(guò)夜菌于20 mL LB(Kan+)中，繼續(xù)培養(yǎng)3hr左右，OD6tltol達(dá)到O. 6-0. 8時(shí)加入IPTG至ImM誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，分別于 Ohr、lhr、2hr、3hr、4hr、5hr、6hr 后收集 ImL 菌液。(3)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定
取ImL菌液12000rpm離心Imin收集菌體,加入100 μ L的I X上樣緩沖液,煮沸5min,冷卻后12000rpm離心lmin,取10 μ L樣品進(jìn)行12% SDS-PAGE,電泳條件為18mA, I. 5hr。取下凝膠在考馬斯亮藍(lán)染液中搖動(dòng)染色lhr，移入洗脫液中搖動(dòng)洗脫過(guò)夜。觀察誘導(dǎo)前后蛋白條帶的變化，結(jié)果顯示誘導(dǎo)4hr后蛋白表達(dá)到達(dá)高峰。
具體地，上述方法步驟(4)具體分為如下步驟
(I)OPN蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
將過(guò)夜培養(yǎng)已轉(zhuǎn)入pET-28a(+)-OPN的Rosseta菌液以1:50接于IL LB(Kan+)中，37 °C搖床，220rpm培養(yǎng)2hr左右，OD600nm達(dá)到O. 6-0. 8時(shí)，加入IPTG至ImM，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)4hr，4°C, 7000rpm離心6min，收集菌體，-8CTC保存。(2)細(xì)菌蛋白表達(dá)形式的分析
-80°C凍存菌體按每克濕菌5-10mL的比例加入細(xì)菌裂解液(O. 5M NaCl, 20mM Tris,IOmM巰基乙醇，ImM PMSF,pH7. 9),超聲破菌,4°C, 8000rpm離心20min,包涵體沉淀在底部，分別取上清、包涵體做SDS-PAGE，結(jié)果顯示OPN蛋白主要存在于包涵體中。(3) OPN蛋白的純化
超聲破菌后，4°C，8000rpm離心20min，棄上清，沉淀用50mL溶液(O. 5M NaCl, 20mMTris, O. 5% Triton, ρΗ7· 9)超聲洗漆一次；4°C, 8000rpm離心20min,棄上清。沉淀即包涵體加入 30mL 溶液(0.5M NaCl, 20mM Tris，6M 鹽酸胍，ρΗ7· 9)，置 37°C溶解 2hr 以上。4°C，16000rpm離心20min，取上清上樣至預(yù)先用O. 5M NaCl, 20mM Tris，6M鹽酸胍，pH7. 9的溶液平衡好的鎳柱，分別用溶液A、B、C (溶液A :0. 5M NaCl, 20mM Tris，5mM巰基乙醇，5mM咪唑，6M鹽酸胍，ρΗ7· 9 ;溶液B : O. 5Μ NaCl, 20mM Tris，5mM巰基乙醇，5mM咪唑，8M尿素，ρΗ7· 9 ;溶液C :0. 5M NaCl, 20mM Tris，5mM巰基乙醇，20mM咪唑，8M尿素，pH7. 9)洗滌10個(gè)柱床體積，再用洗脫緩沖液(O. 5M NaCl, 20mM Tris, 5mM巰基乙醇，200mM咪唑，8M尿素，pH7. 9)洗脫，收集蛋白液，置4°C對(duì)I XPBS充分透析，40C，16000rpm離心20min，取上清液。收獲的蛋白用SDS-PAGE進(jìn)行純度分析，結(jié)果顯示純化的蛋白分子量約為20kDa。(4) OPN蛋白的鑒定Western blot鑒定SDS_PAGE電泳結(jié)束后取下凝膠，電轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上(4°C，100V，lhr)，取膜，于室溫用5%脫脂奶粉封閉2hr，加入鼠抗人OPN抗體，室溫孵育2hr，用PBST洗膜3次，每次lOmin，加入羊抗鼠抗體室溫孵育I. 5hr，再用PBST洗膜3次，每次IOmin,加入底物液顯色，在暗室內(nèi)顯影、定影，結(jié)果顯示約40kDa處出現(xiàn)了 OPN的目標(biāo)條帶。本發(fā)明還提供利用所述的骨橋蛋白基因的克隆、表達(dá)與蛋白純化方法獲得的骨橋蛋白在制備預(yù)防或治療腸癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌和肝癌藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)建立原核生物基因表達(dá)系統(tǒng)，可以大量表達(dá)OPN蛋白，并建立高純度蛋白純化流程，獲得量多純度高且制備方法簡(jiǎn)單可行的OPN蛋白。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述。實(shí)施例I OPN某閔克降、表汰與蛋白鈍化
I.重組克隆載體TA-OPN的構(gòu)建
(1)OPN的引物設(shè)計(jì)
以pET28a (+) -OPN為模板，通過(guò)拼接PCR擴(kuò)增0ΡΝ，設(shè)計(jì)出4條引物OPNp I、0PNp2、0PNpl-G-3，、 0PNp2-G-5，。上游引物OPNpl含有內(nèi)切酶位點(diǎn)I，下游引物mE7p2含有內(nèi)切酶位點(diǎn)歷·/ (!III,
OPNpl :5’ -CGCATATGGCTAGCATGACTGGTGGA-3，
0PNpl-G-3’ 5’ -TAATTGCTCATAACCGTAGAGATCAGTTG-3’
0PNp2-G-5’ 5’ -CAACTGATCTCTACGGTTATGAGCAATT-3’
0PNp2 :5’ -CGAAGCTTTTAGATGGGGCACACAATTC-3>
(2)拼接PCR擴(kuò)增OPN基因片段
以pET28a (+) -OPN為模板，通過(guò)拼接PCR擴(kuò)增OPN基因片段，先擴(kuò)增Nde I與OPN基因第76堿基中間的片段(138bp，稱為I-OPN84)和OPN基因第56-297位堿基序列(稱為OPN56^297)ο PCR反應(yīng)體系(Pyrobest 酶):41. 25 μ L無(wú)菌水，5 μ L IOXbuffer(含MgCl2), I μ LIOmM dNTPs, I μ L OPNpl/OPNpl-G-3’，I μ L 0PNp2_G_5，/0ΡΝρ2，0· 5 μ L pET28a (+) -OPN,
O.25 μ L Pyrobest酶，混勻后立即進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3min ;然后進(jìn)行以下35 個(gè)循環(huán)94°C 45s, 56°C lmin,72°C 45s ;最后在 72°C延伸 3min。上述PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠90V恒壓電泳20min，切膠后用膠回收試劑盒回收目的片段，再拼接PCR擴(kuò)增I-OPN序列。PCR反應(yīng)體系(Pyrobest酶)39. 75μ L無(wú)菌水，5 μ L IOXbuffer (含 MgCl2), IyL IOmM dNTPs, I μ L OPNpl, I μ L 0PNp2, ImL NdeI-OPN84,1 μ L 0ΡΝ56_297，O. 25 μ L Pyrobest酶，混勻后立即進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3min ;然后進(jìn)行以下35個(gè)循環(huán)94°C 45s, 56°C lmin，72°C 45s ;最后在72°C延伸3min。瓊脂糖凝膠電泳、膠回收DNA片段，為便于用Taq酶延伸加A，膠回收的洗脫緩沖液使用含MgCl2的Taq酶緩沖液。用25 μ L膠回收洗脫緩沖液洗脫P(yáng)CR擴(kuò)增的DNA片段，取13. 7μ L 的膠回收洗脫液，加入 I. 2μ L IOmM dOTl^PO.lyL Taq 酶，72°C 延伸 6min，PCR 產(chǎn)物延伸A。(3) TA克隆連接取I μ L PMD18-T載體，加入2 μ L延伸過(guò)A的OPN片段，再加入5 μ L的連接緩沖液，
2μ L無(wú)菌水補(bǔ)足至10 μ L體系，于16°C連接2hr。(4) TA克隆轉(zhuǎn)化
將上述TA連接產(chǎn)物1(^1^轉(zhuǎn)移到0冊(cè)(1感受態(tài)細(xì)胞中；冰上靜置30min ;42°C熱激90s ;冰上再靜置 5min ;加入 800 μ L LB, 37°C搖床 120rpm 搖 lhr ；4000rpm 離心 3min ;在超凈臺(tái)中移去大部分上清，輕懸沉淀，涂布于含50 μ g/mL氨節(jié)青霉素(Amp)的LB平板中；LB平板倒置于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜。
(5) TA克隆的鑒定
隨機(jī)挑取4個(gè)TA陽(yáng)性克隆，接入4mL LB (Amp+)中；37°C搖床220rpm搖過(guò)夜；抽提質(zhì)粒ΤΑ-0ΡΝ，保存于-80°C，并進(jìn)行雙酶切和PCR鑒定，選取雙酶切和PCR都為陽(yáng)性的TA克隆質(zhì)粒測(cè)序。2.重組表達(dá)質(zhì)粒pET_28a(+)-OPN的構(gòu)建 (O酶切與回收
OPN基因序列中有I酶切位點(diǎn)(0ΡΝ上游引物中引入)，用I/Hind III雙酶切TA-OPN及pET-28a(+)質(zhì)粒，用1%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收目標(biāo)片段。(2 ) T4 DNA連接酶連接及轉(zhuǎn)化
連接體系為=IuL IOX連接酶緩沖液，lμL雙酶切pET-28a(+)質(zhì)粒，7 μ L OPN片段，I μ L Τ4 DNA連接酶，16°C連接過(guò)夜；
將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5 α感受態(tài)，轉(zhuǎn)化后涂布于含50 μ g/mL卡那霉素(Kan)的LB平板上，37 °C倒置培養(yǎng)過(guò)夜。(3)陽(yáng)性克隆鑒定
隨機(jī)挑取4個(gè)陽(yáng)性克隆，接入4mL的LB (Kan+)中；37°C搖床220rpm搖過(guò)夜；抽提質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切(&oR Ι/Η η III)和PCR鑒定。3. OPN蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定 (I)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌
將上述鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒pET_28a(+) -OPN轉(zhuǎn)入感受態(tài)Rosetta，涂布于LB平板(Kan+)上，37°C倒置培養(yǎng)過(guò)夜。(2) IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)
挑單克隆于LB (Kan+)中，37°C搖床，220rpm培養(yǎng)過(guò)夜，以1:50接過(guò)夜菌于20 mL LB(Kan+)中，繼續(xù)培養(yǎng)3hr左右，OD6tltol達(dá)到O. 6-0. 8時(shí)加入IPTG至ImM誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，分別于 Ohr、lhr、2hr、3hr、4hr、5hr、6hr 后收集 ImL 菌液。(3) SDS-PAGE 鑒定
取ImL菌液12000rpm離心Imin收集菌體,加入100 μ L的I X上樣緩沖液,煮沸5min,冷卻后12000rpm離心lmin,取10 μ L樣品進(jìn)行12% SDS-PAGE,電泳條件為18mA, I. 5hr。取下凝膠在考馬斯亮藍(lán)染液中搖動(dòng)染色lhr，移入洗脫液中搖動(dòng)洗脫過(guò)夜。觀察誘導(dǎo)前后蛋白條帶的變化，結(jié)果顯示誘導(dǎo)4hr后蛋白表達(dá)到達(dá)高峰。4. OPN蛋白的純化和鑒定 (I) OPN蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
將過(guò)夜培養(yǎng)已轉(zhuǎn)入pET-28a(+)-OPN的Rosseta菌液以1:50接于IL LB(Kan+)中，37 °C搖床，220rpm培養(yǎng)2hr左右，OD600nm達(dá)到O. 6-0. 8時(shí)，加入IPTG至ImM，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)4hr，4°C, 7000rpm離心6min，收集菌體，-8CTC保存。(2)細(xì)菌蛋白表達(dá)形式的分析
-80°C凍存菌體按每克濕菌5-10mL的比例加入細(xì)菌裂解液(O. 5M NaCl, 20mM Tris,IOmM巰基乙醇，ImM PMSF,pH7. 9),超聲破菌,4°C, 8000rpm離心20min,包涵體沉淀在底部，分別取上清、包涵體做SDS-PAGE，結(jié)果顯示OPN蛋白主要存在于包涵體中。(3) OPN蛋白的純化
超聲破菌后，4°C，8000rpm離心20min，棄上清，沉淀用50mL溶液(O. 5M NaCl, 20mMTris, O. 5% Triton, ρΗ7· 9)超聲洗漆一次；4°C, 8000rpm離心20min,棄上清。沉淀即包涵體加入 30mL 溶液(0.5M NaCl, 20mM Tris，6M 鹽酸胍，ρΗ7· 9)，置 37°C溶解 2hr 以上。4°C， 16000rpm離心20min，取上清上樣至預(yù)先用O. 5M NaCl, 20mM Tris，6M鹽酸胍，pH7. 9的溶液平衡好的鎳柱，分別用溶液A、B、C (溶液A:0. 5M NaCl, 20mM Tris，5mM巰基乙醇，5mM咪唑，6M 鹽酸胍，ρΗ7· 9 ;溶液 B: O. 5Μ NaCl, 20mM Tris，5mM 巰基乙醇，5mM 咪唑，8M 尿素，ρΗ7· 9 ;溶液C: O. 5Μ NaCl, 20mM Tris，5mM巰基乙醇，20mM咪唑，8M尿素，pH7. 9)洗滌10個(gè)柱床體積，再用洗脫緩沖液(O. 5M NaCl, 20mM Tris，5mM巰基乙醇，200mM咪唑，8M尿素，pH7. 9)洗脫，收集蛋白液，置4°C對(duì)I XPBS充分透析，40C，16000rpm離心20min，取上清液。收獲的蛋白用SDS-PAGE進(jìn)行純度分析，結(jié)果顯示純化的蛋白分子量約為20kDa。(4) OPN蛋白的鑒定
Western blot鑒定SDS_PAGE電泳結(jié)束后取下凝膠，電轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上(4°C，100V，lhr)，取膜，于室溫用5%脫脂奶粉封閉2hr，加入鼠抗人OPN抗體，室溫孵育2hr，用PBST洗膜3次，每次lOmin，加入羊抗鼠抗體室溫孵育I. 5hr，再用PBST洗膜3次，每次IOmin,加入底物液顯色，在暗室內(nèi)顯影、定影，結(jié)果顯示約40kDa處出現(xiàn)了 OPN的目標(biāo)條帶。實(shí)施例2 =OPN蛋白預(yù)防免疫抗腫瘤作用
I.5nmol蛋白(0ΡΝ蛋白，PBS組為對(duì)照)皮下免疫C57BL/6小鼠，兩周后腹腔加強(qiáng)免疫I次，一周后皮下接種IXIO5PANc-I細(xì)胞(人胰腺癌細(xì)胞)(接種前，經(jīng)胰酶消化，PBS洗滌2次)。之后每天觀察腫瘤生長(zhǎng)狀況，12d后用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤長(zhǎng)徑和垂直徑(每3d測(cè)量I次)，持續(xù)觀測(cè)直至對(duì)照組小鼠開始死亡為止，繼續(xù)觀察直到荷瘤小鼠全部死亡，記錄其荷瘤情況及存活時(shí)間，結(jié)果全部PBS組小鼠長(zhǎng)出了腫瘤，而OPN蛋白免疫組則有效地保護(hù)了小鼠不生成腫瘤。植瘤40d時(shí)未長(zhǎng)瘤小鼠皮下再接種2 X IO5 PANC-I細(xì)胞，以未免疫小鼠作為對(duì)照組，之后每天觀察腫瘤生長(zhǎng)狀況，直到對(duì)照組小鼠全部死亡，記錄其荷瘤情況及存活時(shí)間，結(jié)果顯示對(duì)照組小鼠6d后全部長(zhǎng)瘤，而OPN蛋白免疫組50d后仍無(wú)瘤體生長(zhǎng)。用同樣的方法分別接種CCL_227(人結(jié)腸癌細(xì)胞)、0VCAR3 (人卵巢癌細(xì)胞)、NCI-H226 (人肺癌細(xì)胞系)，并觀測(cè)和評(píng)估結(jié)果，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組小鼠6d全部長(zhǎng)瘤，而OPN蛋白免疫組30 50d后仍無(wú)瘤體生長(zhǎng)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用OPN蛋白免疫機(jī)體，可以有效預(yù)防腫瘤的發(fā)生。應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明的范圍，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作出的任何修改、等同的替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種骨橋蛋白基因的克隆、表達(dá)與蛋白純化方法，其特征在于，該方法包括如下步驟 (1)重組克隆載體TA-OPN的構(gòu)建； (2)重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-0PN的構(gòu)建； (3)OPN蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定； (4)OPN蛋白的純化和鑒定。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的骨橋蛋白基因的克隆、表達(dá)與蛋白純化方法，其特征在于，步驟(I)具體分為如下步驟 (1)OPN的引物設(shè)計(jì) 以pET28a (+) -OPN為模板，通過(guò)拼接PCR擴(kuò)增0ΡΝ，設(shè)計(jì)出4條引物OPNp I、0PNp2、0PNpl-G-3，、 0PNp2-G-5，； 上游引物OPNpl含有內(nèi)切酶位點(diǎn)I，下游引物mE7p2含有內(nèi)切酶位點(diǎn)歷id III， OPNpl :5’ -CGCATATGGCTAGCATGACTGGTGGA-3，0PNpl-G-3’ 5’ -TAATTGCTCATAACCGTAGAGATCAGTTG-3’0PNp2-G-5’ 5’ -CAACTGATCTCTACGGTTATGAGCAATT-3’0PNp2 :5’ -CGAAGCTTTTAGATGGGGCACACAATTC-3> ； (2)拼接PCR擴(kuò)增OPN基因片段 以pET28a(+)-OPN為模板，通過(guò)拼接PCR擴(kuò)增OPN基因片段，先擴(kuò)增I與OPN基因第76堿基中間的片段和OPN基因第56-297位堿基序列； 上述PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，再拼接PCR擴(kuò)增Nde I-OPN序列； (3)TA克隆連接 取I μ L pMD18-T載體，加入2 μ L延伸過(guò)A的OPN片段，再加入5 μ L的連接緩沖液，2 μ L無(wú)菌水補(bǔ)足至10 μ L體系，于16°C連接2hr ； (4)TA克隆轉(zhuǎn)化 將上述TA連接產(chǎn)物10 μ L轉(zhuǎn)移到DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，冰上靜置30min，42°C熱激90s，冰上再靜置5min ;加入800 μ L LB, 37。。搖床120rpm搖lhr, 4000rpm離心3min ;在超凈臺(tái)中移去大部分上清，輕懸沉淀，涂布于含50 μ g/mL氨芐青霉素的LB平板中，LB平板倒置于37 °C培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜； (5)TA克隆的鑒定 隨機(jī)挑取4個(gè)TA陽(yáng)性克隆，接入4mL含氨芐青霉素LB中；37°C搖床220rpm搖過(guò)夜；抽提質(zhì)粒ΤΑ-0ΡΝ，保存于-80°C，并進(jìn)行雙酶切和PCR鑒定，選取雙酶切和PCR都為陽(yáng)性的TA克隆質(zhì)粒測(cè)序。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的骨橋蛋白基因的克隆、表達(dá)與蛋白純化方法，其特征在于，步驟(2)具體分為如下步驟 (1)酶切與回收 OPN基因序列中有&oR I酶切位點(diǎn)，用&oR I/Nind III雙酶切ΤΑ-0ΡΝ及pET_28a(+)質(zhì)粒，用1%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收目標(biāo)片段； (2)T4 DNA連接酶連接及轉(zhuǎn)化 將OPN片段和T4 DNA連接酶在連接體系中16°C連接過(guò)夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5 α感受態(tài)，轉(zhuǎn)化后涂布于含50 μ g/mL卡那霉素的LB平板上，37°C倒置培養(yǎng)過(guò)夜； (3)陽(yáng)性克隆鑒定 隨機(jī)挑取4個(gè)陽(yáng)性克隆，接入4mL的含卡那霉素LB板中，37°C搖床220rpm搖過(guò)夜，抽提質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切I/Hind III和PCR鑒定。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的骨橋蛋白基因的克隆、表達(dá)與蛋白純化方法，其特征在于，步驟(3)具體分為如下步驟 (1)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 將上述鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒pET_28a(+) -OPN轉(zhuǎn)入感受態(tài)Rosetta，涂布于含卡那霉素的LB平板上，37 °C倒置培養(yǎng)過(guò)夜； (2)IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá) 挑單克隆于含卡那霉素LB中，37°C搖床，220rpm培養(yǎng)過(guò)夜，以1:50接過(guò)夜菌于20 mL含卡那霉素LB板中，繼續(xù)培養(yǎng)3hr左右，OD6tltol達(dá)到O. 6 O. 8時(shí)加入IPTG至ImM誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，分別于Ohr、lhr、2hr、3hr、4hr、5hr、6hr后收集ImL菌液；(3)SDS-PAGE 鑒定 取ImL菌液12000rpm離心Imin收集菌體,加入100 μ L的I X上樣緩沖液,煮沸5min,冷卻后12000rpm離心lmin，取10 μ L樣品進(jìn)行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，取下凝膠在考馬斯亮藍(lán)染液中搖動(dòng)染色lhr，移入洗脫液中搖動(dòng)洗脫過(guò)夜，觀察誘導(dǎo)前后蛋白條帶的變化，結(jié)果顯示誘導(dǎo)4hr后蛋白表達(dá)到達(dá)高峰。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的骨橋蛋白基因的克隆、表達(dá)與蛋白純化方法，其特征在于，步驟(4)具體分為如下步驟 (1)OPN蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將過(guò)夜培養(yǎng)已轉(zhuǎn)入pET_28a (+) -OPN的Rosseta菌液以1:50接于IL含卡那霉素LB中，37°C搖床，220rpm培養(yǎng)2hr左右，OD6tltlnm達(dá)到O. 6-0. 8時(shí)，加入IPTG至ImM，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)4hr, 4°C, 7000rpm離心6min,收集菌體，-8CTC保存； (2)細(xì)菌蛋白表達(dá)形式的分析 -80°C凍存菌體按每克濕菌5-10mL的比例加入細(xì)菌裂解液，超聲破菌，4°C，8000rpm離心20min，包涵體沉淀在底部，分別取上清、包涵體做SDS-PAGE，結(jié)果顯示OPN蛋白主要存在于包涵體中； (3)OPN蛋白的純化 超聲破菌后，4°C，8000rpm離心20min，棄上清，沉淀用50mL溶液超聲洗滌一次；4°C，8000rpm離心20min，棄上清，沉淀即包涵體加入30mL溶液，置37°C溶解2hr以上；4°C，16000rpm離心20min，取上清上樣至預(yù)先用O. 5M NaCl, 20mM Tris，6M鹽酸胍，pH7. 9的溶液平衡好的鎳柱，分別用三種溶液洗滌10個(gè)柱床體積，再用洗脫緩沖液洗脫，收集蛋白液，置4°C對(duì)I XPBS充分透析，40C，16000rpm離心20min，取上清液；收獲的蛋白用SDS-PAGE進(jìn)行純度分析； (4)OPN 蛋白的 Western blot 鑒定 SDS-PAGE電泳結(jié)束后取下凝膠，電轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，取膜，于室溫用5%脫脂奶粉封閉2hr，加入鼠抗人OPN抗體，室溫孵育2hr，用PBST洗膜3次，每次lOmin，加入羊抗鼠抗體室溫孵育I. 5hr，再用PBST洗膜3次，每次lOmin，加入底物液顯色，在暗室內(nèi)顯影、定影。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的骨橋蛋白基因的克隆、表達(dá)與蛋白純化方法，其特征在于，步驟(3)中所述的三種溶液分別為，溶液A :0. 5M NaCl, 20mM Tris，5mM巰基乙醇，5mM咪唑，6M鹽酸胍，ρΗ7· 9 ;溶液B : O. 5Μ NaCl, 20mM Tris，5mM巰基乙醇，5mM 咪唑，8M尿素，ρΗ7· 9 ;溶液 C:0. 5M NaCl, 20mM Tris，5mM 巰基乙醇，20mM 咪唑，8M 尿素，ρΗ7· 9。
7.利用權(quán)利要求I 6中任一項(xiàng)所述的骨橋蛋白基因的克隆、表達(dá)與蛋白純化方法制得的骨橋蛋白在制備預(yù)防或治療腸癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌或肝癌藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了OPN蛋白的方法首先構(gòu)建OPN的克隆載體TA-OPN和表達(dá)載體pET-28a(+)-OPN，并原核表達(dá)、分離純化了OPN蛋白。利用該方法制備骨橋蛋白具有產(chǎn)量高、純度好、成本較低的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明還提供利用所述的骨橋蛋白基因的克隆、表達(dá)與蛋白純化方法獲得的骨橋蛋白在制備預(yù)防或治療腸癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌和肝癌藥物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K1/36GK102719470SQ20121023573
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月10日
發(fā)明者張峰, 梁靜, 蔣晟, 陳愛萍, 顧傳虎 申請(qǐng)人:南京新港醫(yī)藥有限公司