專利名稱：一種檢測馬立克氏腫瘤的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測馬立克氏腫瘤的方法。
背景技術(shù)：
馬立克氏病是一種淋巴組織增生性腫瘤病，目前是危害養(yǎng)雞業(yè)健康發(fā)展的三大主要疫病之一，引起雞群較高的發(fā)病率和死亡率，給養(yǎng)殖帶來極大地經(jīng)濟(jì)損失。因此，及早地進(jìn)行診斷有助于減少損失。通?？筛鶕?jù)臨床癥狀進(jìn)行初步診斷，但對(duì)于臨床上較難判斷的需送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病毒分離鑒定、血清學(xué)方法、組織學(xué)檢查以及核酸探針等方法進(jìn)行確診。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)方法是用馬立克氏病抗血清確定病雞羽毛囊中有無該病毒存在，但該方法只能確定是否感染，不能確定是否發(fā)生腫瘤。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)以上問題，本發(fā)明目的在于提供一種檢測馬立克氏腫瘤的方法。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案在于采用一種檢測馬立克氏腫瘤的方法，包括以下步驟
1)分離樣品抗凝血液中的淋巴細(xì)胞；
2)提取淋巴細(xì)胞中的基因組DNA；
3)設(shè)計(jì)微衛(wèi)星引物；
4)PCR擴(kuò)增目的片段；
5)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。步驟1)所述的淋巴細(xì)胞分離方法為先將淋巴分離液加于試管底部，然后沿試管壁加入抗凝血液，低速離心，吸取中間層到另一干凈于試管中，-20°C保存?zhèn)溆?。所述的淋巴分離液與抗凝血液體積比為2 :1。步驟4)所述的PCR擴(kuò)增的體系為模板1 μ L,Taq DNA聚合酶0. 4 μ L，上、下游引物各 ι μ L，dNTP 2 μ L，IOXbuffer :2. 5 μ L，最后蒸水補(bǔ)足 25 μ L。步驟4)所述的PCR擴(kuò)增采用降落PCR，PCR擴(kuò)增的程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min ；
94 °C 變性 30 s ； 55 退火 30 s ； 50 退火 30 s ； 45°C退火 30 s ； 68 0C 30 s 72 0C 7min ；
前兩步退火溫度各10個(gè)循環(huán)，最后一步退火為15個(gè)循環(huán)。步驟5)所述的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的濃度為12%，所述的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的變性劑為尿素。
本發(fā)明有益效果本發(fā)明方法操作靈敏，結(jié)果準(zhǔn)確，采用此方法在群體未發(fā)生馬立克氏腫瘤前就可以進(jìn)行基因組檢測，以基因組的變化結(jié)果來判定是否發(fā)生馬立克氏腫瘤， 減少雞群發(fā)病的機(jī)率，提高群體的安全性，通過這種方法發(fā)現(xiàn)病因，可及時(shí)地進(jìn)行針對(duì)性治療。


圖1為現(xiàn)有的診斷馬立克病的引物IPCS，目的條帶約為327bp，Marker 600bpr,以作為本發(fā)明的試驗(yàn)結(jié)果的對(duì)比；
圖2為微衛(wèi)星ABR107R MSI的變化的變性凝膠電泳圖，L 淋巴細(xì)胞，1、2、3、4 ；不同的個(gè)體，M:DNA Marker (PUC18 DNA/MspI)；
圖3為微衛(wèi)星ABR204R MSI的變化的變性凝膠電泳圖，L 淋巴細(xì)胞，1、2、3、4 ；不同的個(gè)體，M:DNA Marker (PUC18 DNA/MspI)；
圖4為微衛(wèi)星ABR495R MSI的變化的變性凝膠電泳圖，L 淋巴細(xì)胞，1、2、3、4 ；不同的個(gè)體，M:DNA Marker (PUC18 DNA/MspI)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，首先分離樣品抗凝血液中的淋巴細(xì)胞，再提取淋巴細(xì)胞中的基因組DNA ；然后設(shè)計(jì)微衛(wèi)星引物，PCR擴(kuò)增目的片段；最后對(duì) PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。下述實(shí)施例中所用方法如無特殊說明為常規(guī)方法。實(shí)施例1
1、淋巴細(xì)胞的分離選擇臨床癥狀表現(xiàn)比較明顯的雞群，主要有肉眼可見的腫瘤塊，采集Irnl抗凝血，保存在4°C冰箱，加入2ml淋巴分離液于試管底部，然后沿試管壁加入 Iml抗凝血液，在2500g/min條件下離心20min，用移液槍吸取中間層即淋巴細(xì)胞到另一干凈的試管中，-20°C保存；
2、DNA的提取用細(xì)胞提取核酸DAN試劑盒提取淋巴細(xì)胞的DNA，按照試劑盒的說明書進(jìn)行操作，并檢測DNA的含量及純度，提取的DNA的濃度為100 μ g / mL, 0D260/280為1. 7 ；
3、設(shè)計(jì)引物引物序列如下
上游引物 IPCS 5' -AAT GAG CGA ACT GCC TCA CAC AAC-3‘； 下游引物 IPCA 5' -GAT CGC CCA CCA CGA TTA CTA CCT-3‘； 引物是由上海英駿生物有限公司合成；
4、PCR擴(kuò)增目的片段PCR擴(kuò)增的體系為模板lyL，TaqDNA聚合酶0. 4 μ L，上、下游引物各1 μ L，dNTP 2 μ L，IOXbuffer :2. 5 μ L，最后蒸水補(bǔ)足25 μ L，PCR擴(kuò)增的程序?yàn)?br> 94°C預(yù)變性5min ； 94 °C 變性 30 s ； 55 退火 30 s ； 50 退火 30 s ； 45°C退火 30 s ； 68 0C 30 s72 °C 7min ；
前兩步退火溫度各10個(gè)循環(huán)，最后一步退火為15個(gè)循環(huán)。5、對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測采用濃度為12%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠液配制(1 mm厚4板，50 ml):45%丙烯酰胺溶液12 ml，10XTBE緩沖液 5 ml，去離子水34 ml;尿素40 g，在55°C水浴，使尿素溶解并冷卻至室溫后，加入3 ml新配制的1. 6%過硫酸銨，然后加入TEMED，充分混勻；電泳結(jié)束后，將凝膠置于盛200 ml固定液的瓷盤中，固定5-10 min，固定后，取出凝膠放入染色液中重染色15-30 min，然后用去離子水沖洗兩次，每次放在搖床上輕搖30 s ；最后用顯色液顯色直到條帶出現(xiàn)為止，顯色時(shí)間 5-10 min，用凝膠成像系統(tǒng)拍照，并分析各泳道情況，依據(jù)DNA Marker記錄條帶結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)預(yù)期條帶327bp。6、測序?qū)CR產(chǎn)物純化后測序，測序結(jié)果與Genbank上發(fā)表的馬立克病強(qiáng)毒株的基因序列同源性達(dá)到99. 5%，說明這群雞發(fā)生是馬立克病。實(shí)施例2
1、淋巴細(xì)胞的分離同實(shí)施例1 ；
2、DNA的提取同實(shí)施例1；
3、設(shè)計(jì)微衛(wèi)星引物根據(jù)選擇微衛(wèi)星位點(diǎn)ABR107進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物序列如下 上游引物 P1 5 ‘ -CCGTTACTGACTTCTGCTTT-3 ‘；
下游引物 p2:5' -TTTGTATTGGCTCCCTCATC-3‘； 引物是由上海英駿生物有限公司合成；
4、PCR擴(kuò)增目的片段PCR擴(kuò)增的體系為模板lyL，TaqDNA聚合酶0. 4 μ L，上、下游引物各1 μ L，dNTP :2 μ L，IOXbuffer :2. 5 μ L，最后蒸水補(bǔ)足25 μ L，PCR擴(kuò)增的程序?yàn)?br> 94°C預(yù)變性5min ； 94 °C 變性 30 s ； 55 退火 30 s ； 50 退火 30 s ； 45°C退火 30 s ； 68 0C 30 s 72 0C 7min ；
前兩步退火溫度各10個(gè)循環(huán)，最后一步退火為15個(gè)循環(huán)。5、對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測步驟同實(shí)施例1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，說明發(fā)生馬立克病時(shí)，雞群的基因序列的微位星點(diǎn)發(fā)生相應(yīng)的變化。實(shí)施例3
1、淋巴細(xì)胞的分離同實(shí)施例1 ；
2、DNA的提取同實(shí)施例1；
3、設(shè)計(jì)微衛(wèi)星引物根據(jù)選擇微衛(wèi)星位點(diǎn)ABR204進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物序列如下 上游引物 P3 5 ‘ -TAAATAAAGGTGTTGGCAGTT-3 ‘；
下游引物 P4 5 ‘ -CAGATTGTTAAAATAGTTGGGTT-3 ‘； 引物是由上海英駿生物有限公司合成；
4、PCR擴(kuò)增目的片段PCR擴(kuò)增的體系為模板lyL，TaqDNA聚合酶0. 4 μ L，上、下游引物各1 μ L，dNTP :2 μ L，IOXbuffer :2. 5 μ L，最后蒸水補(bǔ)足25 μ L，PCR擴(kuò)增的程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min ； 94 °C 變性 30 s ； 55 退火 30 s ； 50 退火 30 s ； 45°C退火 30 s ； 68 0C 30 s 72 0C 7min ；
前兩步退火溫度各10個(gè)循環(huán)，最后一步退火為15個(gè)循環(huán)。5、對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測步驟同實(shí)施例1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖 3所示說明發(fā)生馬立克病時(shí)，雞群的基因序列的微位星點(diǎn)發(fā)生相應(yīng)的變化。實(shí)施例4
1、淋巴細(xì)胞的分離同實(shí)施例1 ；
2、DNA的提取同實(shí)施例1；
3、設(shè)計(jì)微衛(wèi)星引物根據(jù)選擇微衛(wèi)星位點(diǎn)ABR495進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物序列如下 上游引物 p5 5 ‘ -TTGTACTGGGTAGCATTTGA-3 ‘；
下游引物 p6 5, -ACTCTTTGGCCTACTTTTCC-3 ‘； 引物是由上海英駿生物有限公司合成；
4、PCR擴(kuò)增目的片段PCR擴(kuò)增的體系為模板lyL，TaqDNA聚合酶0. 4 μ L，上、下游引物各1 μ L，dNTP :2 μ L，IOXbuffer :2. 5 μ L，最后蒸水補(bǔ)足25 μ L，PCR擴(kuò)增的程序?yàn)?br> 94°C預(yù)變性5min ； 94 °C 變性 30 s ； 55 退火 30 s ； 50 退火 30 s ； 45°C退火 30 s ； 68 0C 30 s 72 0C 7min ；
前兩步退火溫度各10個(gè)循環(huán)，最后一步退火為15個(gè)循環(huán)。5、對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測步驟同實(shí)施例1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，說明發(fā)生馬立克病時(shí)，雞群的基因序列的微位星點(diǎn)發(fā)生相應(yīng)的變化。
序列表
<110>鄭州后羿制藥有限公司 <120> 一種檢測馬立克氏腫瘤的方法 <160>8
<170> PatentIn Version3.5 <210> IPCS <211> 24 <212> DNA<213>人工序列 <400>IPCS
aatgagcgaa ctgcctcaca caac24
<210> IPCA
<211> 24
<212> DNA
<213>人工序列
<400>IPCA
gatcgcccac cacgattact acct24
<210> Pl
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<400>P1
ccgttactga cttctgcttt20
<210> P2
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<400>P2
tttgtattgg ctccctcatc20
<210> P3
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<400>P3
taaataaagg tgttggcagt t21
<210> P4
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列
<400>P4
cagattgtta aaatagttgg gtt23
<210> P5
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<400>P5
ttgtactggg tagcatttga20<210> P6 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <400>P6
actctttggc ctacttttcc20
權(quán)利要求
1.一種檢測馬立克氏腫瘤的方法，其特征在于所述的檢測方法包括以下步驟 1)分離樣品抗凝血液中的淋巴細(xì)胞；2)提取淋巴細(xì)胞中的基因組DNA；3)設(shè)計(jì)微衛(wèi)星引物；4)PCR擴(kuò)增目的片段；5)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測馬立克氏腫瘤的方法，其特征在于步驟1)所述的淋巴細(xì)胞分離方法為先將淋巴分離液加于試管底部，然后沿試管壁加入抗凝血液，低速離心， 吸取中間層到另一干凈于試管中，冷凍保存。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測馬立克氏腫瘤的方法，其特征在于所述的淋巴分離液與抗凝血液體積比為2:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測馬立克氏腫瘤的方法，其特征在于步驟4)所述的PCR 擴(kuò)增的體系為模板lPL，Taq DNA聚合酶0. 4 μ L，上、下游引物各1 μ L，dNTP :2yL, IOXbuffer :2. 5 μ L，最后蒸水補(bǔ)足 25 μ L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測馬立克氏腫瘤的方法，其特征在于步驟4)所述的PCR 擴(kuò)增采用降落PCR，PCR擴(kuò)增的程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min ；94 °C 變性 30 s ；55 退火 30 s ；50 退火 30 s ；45°C退火 30 s ；68 0C 30 s72 0C 7min ；前兩步退火溫度各10個(gè)循環(huán)，最后一步退火為15個(gè)循環(huán)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測馬立克氏腫瘤的方法，其特征在于步驟5)所述的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的濃度為12%，所述的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的變性劑為尿素。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測馬立克氏腫瘤的方法，其步驟為分離樣品抗凝血液中的淋巴細(xì)胞、提取淋巴細(xì)胞中的基因組DNA、設(shè)計(jì)微衛(wèi)星引物、PCR擴(kuò)增目的片段、對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，本發(fā)明方法操作靈敏，結(jié)果準(zhǔn)確，采用此方法在群體未發(fā)生馬立克氏腫瘤前就可以進(jìn)行基因組檢測，以基因組的變化結(jié)果來判定是否發(fā)生馬立克氏腫瘤，減少雞群發(fā)病的機(jī)率，提高群體的安全性，通過這種方法發(fā)現(xiàn)病因，可及時(shí)地進(jìn)行針對(duì)性治療。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102453750SQ20101051369
公開日2012年5月16日 申請(qǐng)日期2010年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月21日
發(fā)明者吳紅云, 李建正, 郭俊清 申請(qǐng)人:鄭州后羿制藥有限公司