專利名稱：制備雞馬立克氏病毒感染檢測抗原的新原料及其篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及禽病檢測試劑領(lǐng)域，尤其是雞馬立克氏病毒感染檢測抗原的 新原料及其篩選方法。
背景技術(shù)：
馬立克氏病(MD)是世界上首例通過疫苗控制的倍受獸醫(yī)界、醫(yī)學(xué)界和 生物界關(guān)注的致瘤性和免疫抑制性傳染病，其病原為馬立克氏皰疹病毒 (MDV)。由于該病嚴(yán)重?fù)p害雞免疫系統(tǒng)，除本身可招致長達(dá)數(shù)月及累計(jì)高達(dá) 70%以上的致死外，常導(dǎo)致各種"雞瘟"疫苗的免疫失敗或繼發(fā)感染而造成 重大損失。鑒于MDV污染嚴(yán)重，毒力不斷增強(qiáng)，加之MD致瘤潛伏期長和隱 蔽性極強(qiáng)，即使免疫后也不能阻斷其侵人與傳播，因此，MDV強(qiáng)毒污染監(jiān)測 不僅是MD防制的源頭，也是確保其它禽用疫苗免疫效果的前提和評價(jià)養(yǎng)禽生 物安全狀況有效方法。
檢測雞群MDV強(qiáng)毒感染的方法有多種，如病毒的分離與鑒定、血清學(xué)檢 查及MDV特異DNA的檢測等。MDV的分離與鑒定，雖有其特別的用途，但 其分離的難度較大，易受污染的影響且費(fèi)時(shí)，故不適于常規(guī)檢測和流行病 學(xué)調(diào)查。MDV分子水平的特異性檢測，如核酸探針和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)， 雖然由于其特異性強(qiáng)、敏感性高等優(yōu)點(diǎn)已成功地用于MDV的檢測，但其嚴(yán) 格的物質(zhì)技術(shù)條件限制和高昂的檢測費(fèi)用，因而難以推廣和普及。
雞MDV強(qiáng)毒感染的血清學(xué)檢查，特別是瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)即簡稱為 瓊擴(kuò)試驗(yàn)，因特異、敏感、簡便、直觀和可重復(fù)性強(qiáng)及檢測費(fèi)用相對低廉 而廣泛應(yīng)用(NY/T 905-2004)。其主要是用標(biāo)準(zhǔn)MDV陽性抗原和MDV陽性 抗體，來檢測雞群體內(nèi)有無明顯反應(yīng)性的MDV抗體和/或MDV抗原，從而得 出雞群是否有MDV強(qiáng)毒的感染或污染。目前，國內(nèi)外制備的MDV陽性瓊擴(kuò) 抗原，主要是源于MDV強(qiáng)毒細(xì)胞培養(yǎng)后的感染細(xì)胞及其培養(yǎng)液，或是源于 MDV強(qiáng)毒感染雞羽囊液及皮膚，或源于MDV抗原基因(gC、 gB )的原核或真 核表達(dá)產(chǎn)物。這種方法進(jìn)行生產(chǎn)的主要缺點(diǎn)是需要有一定的生產(chǎn)工藝、流程 和周期，即都需要有細(xì)胞生長的條件與MDV強(qiáng)毒增殖的過程，或含目的抗原
基因的原核或真核表達(dá)條件與過程，從而才能在培養(yǎng)細(xì)胞中產(chǎn)生出MDV的 病毒性抗原，并須對生產(chǎn)過程中的生物安全控制要求很嚴(yán)，進(jìn)一步加大了 生產(chǎn)成本。而標(biāo)準(zhǔn)MDV陽性抗原的生產(chǎn)成本，則是構(gòu)成雞MDV強(qiáng)毒感染的 血清學(xué)檢測成本的主要因素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是根據(jù)MD疫苗能夠產(chǎn)生可與致病性MDV強(qiáng)毒抗原具有交 叉反應(yīng)性的主要可溶性分泌抗原，以該MD疫苗的培養(yǎng)廢棄液作為制備MDV 檢測抗原的原料。
本發(fā)明的另一目的在于提供這種新原料的篩選方法。 MDV是細(xì)胞結(jié)合性病毒，其有三個(gè)血清型，從溫和型到毒力很強(qiáng)的致瘤 株及其致弱株，均歸為血清1型MDV，天然不致瘤的病毒株為血清2型，異 源的火雞皰疹病毒(HVT)則屬于血清3型。三個(gè)血清型中只有血清1型中 的強(qiáng)毒株對雞是致瘤或致病性的，且三個(gè)血清型的非致病毒株都可用作MD 的疫苗。由于MD疫苗的廣泛使用，不同血清型MD疫苗均有不同程度的商 業(yè)化生產(chǎn)。鑒于三個(gè)血清型MDV之間存在很強(qiáng)的群特異性抗原，并且這種 群特異性抗原是可溶性分泌抗原。因此，在其增殖或疫苗生產(chǎn)過程中，是 能夠產(chǎn)生與MDV強(qiáng)毒抗原具有交叉反應(yīng)性的病毒性抗原，如能從以上各種 商業(yè)化生產(chǎn)的MD疫苗中，篩選出可替代MDV強(qiáng)毒的增殖來制備MDV陽性抗 原的疫苗培養(yǎng)棄液，將是一種十分經(jīng)濟(jì)、安全和有效制備MDV抗原的原料 來源。
本發(fā)明采用馬立克氏病疫苗培養(yǎng)廢棄液作為制備雞馬立克氏病毒感染檢 測抗原的原料。
本發(fā)明以MDV血清1型的CVl988/Rispens株及其低代次種毒進(jìn)行疫苗 毒的增殖培養(yǎng)，在收獲合格的感染細(xì)胞后，其病毒培養(yǎng)的上清液即培養(yǎng)后的 廢棄液作為制備雞馬立克氏病毒感染檢測抗原的原料。
本發(fā)明以MDV血清3型的火雞皰疹病毒Fc-126株及其低代次種毒進(jìn)行 HVT疫苗的增殖培養(yǎng)，在收獲合格的感染細(xì)胞后，其培養(yǎng)上清廢棄液作為制 備雞馬立克氏病毒感染檢測抗原的原料。
本發(fā)明以CVI988作為重組疫苗的載體，若其增殖培養(yǎng)液中分泌有一定
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含量的目的MDV抗原，其細(xì)胞培養(yǎng)上清廢棄液可作為制備雞馬立克氏病毒感 染撿測抗原的原料。
本發(fā)明所提供的新原料的篩選方法是應(yīng)用免疫學(xué)檢測技術(shù)和/或蛋白質(zhì) 電泳分析技術(shù)對馬立克氏病疫苗株合格培養(yǎng)后的廢棄液進(jìn)行檢測評價(jià)和篩
選o
上述篩選方法中所述的免疫學(xué)檢測技術(shù)和/或蛋白質(zhì)電泳分析技術(shù)是指
采用瓊擴(kuò)試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫試驗(yàn)、SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳技 術(shù)分析和/或結(jié)合固定化蛋白質(zhì)的免疫學(xué)測定(Western印跡法)進(jìn)行檢測 評價(jià)與篩選。 . .
其中瓊擴(kuò)試驗(yàn)篩選法的具體篩選步驟如下
a. 對不同血清型馬立克氏病毒疫苗株進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，收集其細(xì)胞培養(yǎng)后 的廢棄液；
b. 將疫苗株細(xì)胞培養(yǎng)棄液或棄液中的主要可溶性分泌物濃縮1Q~100
倍；
c. 以單純馬立克氏病毒致病株感染雞或細(xì)胞而制備的馬立克氏病毒瓊擴(kuò) 陽性抗原和馬立克氏病毒瓊擴(kuò)陽性抗體，作為陽性反應(yīng)體系的對照，采用瓊 擴(kuò)試驗(yàn)并以馬立克氏病毒瓊擴(kuò)陽性抗體檢測上述各濃縮液中馬立克氏病毒 抗原的有無及其含量；
d. 能夠與馬立克氏病毒陽性抗體形成明顯的瓊擴(kuò)沉淀線，并且該沉淀 線與陽性反應(yīng)體系或MDV致病株的沉淀線完全吻合并能融合的濃縮液，判定 為馬立克氏病毒抗原陽性，其所源于的疫苗株為馬立克氏病毒抗原生產(chǎn)的候 選株；
e. 以上述檢測結(jié)果作為初選依據(jù)，實(shí)地收集候選疫苗株的細(xì)胞培養(yǎng)棄 液，即已收獲疫苗病毒后的細(xì)胞培養(yǎng)液，按b 、 c和d步驟^f疫苗生產(chǎn)棄液 中有無MDV抗原再進(jìn)行檢測與含量評價(jià)，以單位棄液中的目的抗原含量高者 為佳，進(jìn)而最終確定出雞馬立克氏病毒感染檢測抗原的生產(chǎn)原料。
將收集來的疫苗細(xì)胞培養(yǎng)廢棄液，經(jīng)適當(dāng)純化分離和濃縮與定量后，即 可作為MDV感染免疫學(xué)檢測試劑盒和檢測試紙的反應(yīng)組份，如瓊擴(kuò)試驗(yàn)、酶 聯(lián)免疫試驗(yàn)、試紙條等的檢測抗原或試劑組分。 由于本發(fā)明利用MD疫苗商業(yè)化培養(yǎng)后的廢棄液作為MDV檢測抗原的生 產(chǎn)原料，降低了對環(huán)境的污染，提高了資源利用率，同時(shí)也消除了致病性MDV 的散毒威脅，大大簡化了生產(chǎn)工藝與流程，縮短了生產(chǎn)周期，并可節(jié)約原料 液生產(chǎn)成本50%以上。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明是是根據(jù)MD疫苗能夠產(chǎn)生可與致病性MDV強(qiáng)毒具有交叉反應(yīng)性 的病毒性抗原，以該MD疫苗的生產(chǎn)培養(yǎng)廢棄液替代MDV強(qiáng)毒的感染物或病 毒性抗原的各種表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)產(chǎn)物，來作為制備MDV檢測抗原的原料。
本發(fā)明所提供的篩選方法是應(yīng)用免疫學(xué)檢測技術(shù)和/或蛋白質(zhì)電泳分析 技術(shù)，即瓊擴(kuò)試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫試驗(yàn)、SDS-PAGE電泳技術(shù)分析和/或結(jié)合 Western印跡法，對馬立克氏病疫苗株合格培養(yǎng)后的廢棄液進(jìn)行檢測評價(jià)和
篩選o
下面以瓊擴(kuò)試驗(yàn)法為例(其它方法均為行業(yè)技術(shù)人員熟知的經(jīng)典方法，
因而不再一一舉例描述)進(jìn)行詳細(xì)描述，具體步驟如下
a. 對不同血清型MDV疫苗株進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，收集其細(xì)胞培養(yǎng)后的棄液 (含血清和無血清的)。
b. 采用物理和/或化學(xué)的方法，將疫苗株細(xì)胞培養(yǎng)棄液或棄液中的主要 可溶性分泌物濃縮1Q ~ 1QQ倍。
c. 以單純MDV致病株感染雞或細(xì)胞而制備的MDV瓊擴(kuò)陽性抗原(羽囊 抗原)和MDV瓊擴(kuò)陽性抗體(血清)，作為陽性反應(yīng)體系的對照，采用瓊擴(kuò) 試驗(yàn)并以MDV瓊擴(kuò)陽性抗體檢測上述各濃縮液中MDV抗原的有無及其含量。
d. 能夠與MDV陽性抗體形成明顯的瓊擴(kuò)沉淀線，并且該沉淀線與陽性 反應(yīng)體系或源于MDV致病株的陽性抗原的沉淀線完全吻合并能融合的濃縮 液，判定為MDV抗原陽性，其所源于的疫苗株為MDV抗原生產(chǎn)的候選株。
e. 以上述檢測結(jié)果作為初選依據(jù)，實(shí)地收集候選疫苗株(含其重組疫 苗)的細(xì)胞培養(yǎng)棄液，即已收獲疫苗病毒后的細(xì)胞培養(yǎng)液，按b 、 c和d步 驟對疫苗生產(chǎn)棄液中有無MDV抗原再進(jìn)行檢測與含量評價(jià)，以單位液體中的 目的抗原含量高者為佳，進(jìn)而最終確定出MDV抗原的生產(chǎn)原料來源。
采用酶聯(lián)免疫試驗(yàn)，或采用SDS-PAGE電泳技術(shù)分析和/或結(jié)合Western
印跡法進(jìn)行檢測與評價(jià)，同樣可以確定出MDV抗原的生產(chǎn)原料來源。 實(shí)施例一
以MDV血清1型的CVI988/Rispens株及其低代次種毒進(jìn)行疫苗毒的增 殖培養(yǎng)，在收獲合格的感染細(xì)胞后，其病毒培養(yǎng)的上清液即培養(yǎng)后的廢棄液 (含血清或無血清)，采用過濾或離心等方法，以除去廢棄液中細(xì)胞碎片等 而使之澄清，將已澄清的液體或直接將上清液，經(jīng)物理法(如超濾法、凍干 法)和/或化學(xué)法(如2Q ~ 60%的飽和硫酸銨，等)進(jìn)行初步除雜，并濃縮10 ~ 100倍后，以MDV瓊擴(kuò)陽性抗原和MDV瓊擴(kuò)陽性抗體作為陽性反應(yīng)體系的對 照，采用瓊擴(kuò)試驗(yàn)并以MDV瓊擴(kuò)陽性抗體檢測上述各濃縮液中MDV抗原的有 無及其含量，以單位棄液中的目的抗原含量高者為佳(也可采用酶聯(lián)免疫試 驗(yàn)進(jìn)行更為準(zhǔn)確的定量)。此外，也可以采用SDS-PAGE電泳技術(shù)分析和/ 或結(jié)合Western印跡法，對疫苗培養(yǎng)后的廢棄液或其縮液處理液進(jìn)行目的 抗原的檢測，通過目的抗原蛋白的分子量分析、識(shí)別和/或陽性對照的比較， 從而確定被檢液中有無目的抗原及其含量的高低。若待檢液中含有可檢出
的目的抗原成分，即為本發(fā)明所需要的可進(jìn)行生產(chǎn)MDV檢測抗原的原料液。
實(shí)施例二
以MDV血清3型的火雞皰疹病毒(HVT ) Fc-126株及其低代次種毒進(jìn)行 HVT疫苗的增殖培養(yǎng)，其病毒培養(yǎng)合格后的培養(yǎng)上清廢棄液。采用與實(shí)施例 1同樣的處理、檢測與判定。
實(shí)施例三
以CVI988作為重組疫苗的載體，若其增殖培養(yǎng)液中分泌有一定含量的 目的MDV抗原，采用與實(shí)施例1同樣的處理與檢測，并判定其中確有一定含 量的目的MDV抗原存在，其細(xì)胞培養(yǎng)上清液也可作為進(jìn)行生產(chǎn)MDV檢測抗原 的原料液。
將收集來的疫苗細(xì)胞培養(yǎng)廢棄液，經(jīng)適當(dāng)純化分離和濃縮與定量后，即 可作為MDV感染免疫學(xué)檢測試劑盒和檢測試紙的反應(yīng)組份，如瓊擴(kuò)試驗(yàn)、
酶聯(lián)免疫試驗(yàn)、檢測試紙條等的檢測抗原或試劑組分。
權(quán)利要求
1、制備雞馬立克氏病毒感染檢測抗原的新原料，其特征在于采用馬立克氏病疫苗培養(yǎng)廢棄液作為制備雞馬立克氏病毒感染檢測抗原的原料。
2、 制備雞馬立克氏病毒感染檢測抗原新原料的篩選方法，其特征在于應(yīng)用免疫學(xué)檢測技術(shù)和/或蛋白質(zhì)電泳分析技術(shù)對馬立克氏病疫苗株合格培 養(yǎng)后的廢棄液進(jìn)行檢測評價(jià)和篩選。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的篩選方法，其特征在于所述的免疫學(xué)檢測技 術(shù)和/或蛋白質(zhì)電泳分析技術(shù)是指采用瓊擴(kuò)試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫試驗(yàn)、SDS-聚丙烯 酰胺凝膠電泳技術(shù)分析和/或結(jié)合固定化蛋白質(zhì)的免疫學(xué)測定進(jìn)行檢測評價(jià) 與篩選。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的篩選方法，其特征在于所述瓊擴(kuò)試驗(yàn)篩選 法的具體步驟如下a. 對不同血清型馬立克氏病毒疫苗株進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，收集其細(xì)胞培養(yǎng)后 的廢棄液；b. 將疫苗株細(xì)胞培養(yǎng)棄液或棄液中的主要可溶性分泌物濃縮10 ~ 100倍；c. 以單純馬立克氏病毒致病株感染雞或細(xì)胞而制備的馬立克氏病毒瓊擴(kuò) 陽性抗原和馬立克氏病毒瓊擴(kuò)陽性抗體，作為陽性反應(yīng)體系的對照，采用瓊 擴(kuò)試驗(yàn)并以馬立克氏病毒瓊擴(kuò)陽性抗體檢測上述各濃縮液中馬立克氏病毒 抗原的有無及其含量；d. 能夠與馬立克氏病毒陽性抗體形成明顯的瓊擴(kuò)沉淀線，并且該沉淀 線與陽性反應(yīng)體系或MDV致病株的沉淀線完全吻合并能融合的濃縮液，判定 為馬立克氏病毒抗原陽性，其所源于的疫苗株為馬立克氏病毒抗原生產(chǎn)的候 選株；e. 以上述檢測結(jié)果作為初選依據(jù)，實(shí)地收集候選疫苗株的細(xì)胞培養(yǎng)棄 液，即已收獲疫苗病毒后的細(xì)胞培養(yǎng)液，按b 、 c和d步驟對疫苗生產(chǎn)棄液 中有無MDV抗原再進(jìn)行檢測與含量評價(jià)，以單位棄液中的目的抗原含量高者 為佳，進(jìn)而最終確定出雞馬立克氏病毒感染檢測抗原的生產(chǎn)原料。
5、 根據(jù)權(quán)利要求l所述制備雞馬立克氏病毒感染檢測抗原的新原料，其 特征在于以馬立克氏病毒血清1型的CVI988/Rispens株及其低代次種毒 進(jìn)行疫苗毒的增殖培養(yǎng)，在收獲合格的感染細(xì)胞后，其病毒培養(yǎng)的上清液 即培養(yǎng)后的廢棄液，作為雞馬立克氏病毒感染檢測抗原制備的原料。
6、 根據(jù)權(quán)利要求l所述制備雞馬立克氏病毒感染檢測抗原的新原料，其 特征在于以馬立克氏病毒血清3型的火雞皰疹病毒Fc-126株及其低代次 種毒進(jìn)行火雞皰疹病毒疫苗的增殖培養(yǎng)，在收獲合格的感染細(xì)胞后，其上 清廢棄液作為雞馬立克氏病毒感染檢測抗原制備的原料。
7、 根據(jù)權(quán)利要求l所述制備雞馬立克氏病毒感染檢測抗原的新原料，其 特征在于以CVI988作為重組疫苗的載體，若其增殖培養(yǎng)液中分泌有一定 含量的目的馬立克氏病毒抗原，其細(xì)胞培養(yǎng)上清廢棄液作為雞馬立克氏病毒 感染檢測抗原制備的原料。
全文摘要
本發(fā)明提供一種制備雞馬立克氏病毒感染檢測抗原的新原料及其篩選方法，采用馬立克氏病疫苗培養(yǎng)廢棄液作為制備雞馬立克氏病毒感染檢測抗原的原料，應(yīng)用免疫學(xué)檢測技術(shù)和/或蛋白質(zhì)電泳分析技術(shù)對馬立克氏病疫苗株合格培養(yǎng)后的廢棄液進(jìn)行檢測評價(jià)和篩選，篩選出可采用能夠分泌與MDV強(qiáng)毒抗原具有交叉反應(yīng)性病毒性抗原的MD疫苗CVI988/Rispens株、HVT Fc-126株等商業(yè)化培養(yǎng)后的廢棄液作為MDV檢測抗原的生產(chǎn)原料，從而大大簡化了生產(chǎn)工藝與流程，縮短了生產(chǎn)周期，并可節(jié)約原料液生產(chǎn)成本50％以上，同時(shí)消除了致病性MDV的散毒威脅，提高了資源利用率，降低了對環(huán)境的污染。
文檔編號(hào)G01N33/531GK101377489SQ20071011372
公開日2009年3月4日 申請日期2007年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月31日
發(fā)明者張訓(xùn)海 申請人:張訓(xùn)海