一種裂谷熱病毒rt-lamp的檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種裂谷熱病毒RT-LAMP的檢測(cè)方法檢測(cè)過(guò)程中：步驟a，建立如下擴(kuò)增反應(yīng)體系：5μl?RNA樣品、2.5μl?Bst?DNA聚合酶緩沖液(10x)、1μl?Bst?DNA聚合酶(8U/μl)、1μl?AMV反轉(zhuǎn)錄酶(10U/μl)、1μld?NTP(25mmol/μl)、5μl?Betaine(5μmol/μl)、1μl?Mg?SO4(100nmol/μl)、對(duì)應(yīng)于L基因的四條引物各1μl引物濃度為F3與B3：5pmol/μl、BIP與FIP：70pmol/μl、H2O補(bǔ)足至25μl；步驟b，將上述各組分混勻后，在65℃水浴中反應(yīng)1.5～2h；步驟c，用1.5％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，然后觀察結(jié)果。本發(fā)明新型的RT-LAMP技術(shù)具有快速靈敏、操作簡(jiǎn)單，安全性高，價(jià)格低廉，不需要特殊儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，特別適用于基層檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)普及應(yīng)用，為裂谷熱病毒早期診斷提供了一種快速、使用的診斷方法。
【專利說(shuō)明】—種裂谷熱病毒RT-LAMP的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及疾病的組織樣品和蟲(chóng)媒早期診斷和監(jiān)測(cè)，尤其涉及一種裂谷熱病毒RT-LAMP的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]裂谷熱(RiftValley fever,RVF)是由裂谷熱病毒(Rift Valley fever virus,RVFV)引起的，由節(jié)肢動(dòng)物傳播的熱性、急性的一種人獸共患病，該病對(duì)全球其他地區(qū)如歐洲、亞洲等的動(dòng)物和人類健康的構(gòu)成嚴(yán)重的威脅。在裂谷熱感染區(qū)，RVF的流行引起家畜的流產(chǎn)和死亡，對(duì)家畜造成難以估量的損失，病毒感染人后，臨床表現(xiàn)為腦炎、視網(wǎng)膜炎(導(dǎo)致失眠)等癥狀，個(gè)別病例表現(xiàn)為出血熱癥狀。RVFV是一種單股負(fù)鏈RNA病毒，RNA分為L(zhǎng) (大)、M (中)、S (小)三個(gè)片段，RVFV為布尼安病毒科白蛉熱病毒屬。通過(guò)冷凍電子斷層掃描RVFV呈多晶狀，呈T = 12正20面體結(jié)構(gòu)。
[0003]在RVF流行地區(qū)，通常用臨床診斷和兩種以上實(shí)驗(yàn)室診斷方法對(duì)RVFV進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)家畜出現(xiàn)有流產(chǎn)病例，除了考慮RVFV外，這種癥狀容易和彎曲桿菌病、牛傳染性鼻氣管炎、藍(lán)舌病、布氏桿菌病等引起的癥狀相似。RVFV病毒的培養(yǎng)需要在生物安全4級(jí)實(shí)驗(yàn)室，診斷檢測(cè)需要在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。常用的檢測(cè)方法如病毒分離，核酸檢測(cè)和抗體檢測(cè)。然而病毒分離法時(shí)間周期長(zhǎng)且費(fèi)用昂貴，血清學(xué)方法主要是ELISA方法，如檢測(cè)IgM和IgG抗體，但這些試驗(yàn)的結(jié)果與白蛉熱病毒屬的其他血清型有交叉性。核酸檢測(cè)方法如RT-PCR，多重RT-PCR，實(shí)時(shí)熒光RT-PCR都已經(jīng)建立和應(yīng)用。PCR方法敏感、特異、結(jié)果可靠，節(jié)省時(shí)間，適用于臨床確診，但實(shí)驗(yàn)儀器和檢測(cè)費(fèi)用較貴，對(duì)人員的操作技能也有一定的要求。
[0004]鑒于上述缺陷，本發(fā)明創(chuàng)作者經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的研究和實(shí)踐終于獲得了本創(chuàng)作。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種裂谷熱病毒RT-LAMP的快速檢測(cè)方法，用以克服上述技術(shù)缺陷。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種裂谷熱病毒RT-LAMP的檢測(cè)方法，根據(jù)GenBank中登錄的裂谷熱L片段基因分析其保守序列，采用的RT-LAMP引物序列如下:
[0007]F3:5/ -CCCCCAATAAAGTGAAAATTCC-3'
[0008]B3:5/ -ACATCCCCTAATGATCAGTG-3'
[0009]FIP(Flc+F2):
[0010]5' -TGTTGCACAAGTCCACACAG-GAGACACATGGCATCAGG-3'
[0011]BIP(Blc+B2):
[0012]5' -TCAGATGATG CAAG GAAGTG GA-TTTAG GAGAG GTGAACTCACA-3'
[0013]F2:5/ -GAGACACATGGCATCAGG-3'
[0014]Flc:5/ -TGTTGCACAAGTCCACACAG-3'
[0015]B2:5/ -TTTAGGAGAGGTGAACTCACA-3'[0016]Blc:5/ -TCAGATGATGCAAGGAAGTGGA-3'。
[0017]進(jìn)一步，檢測(cè)過(guò)程中:
[0018]步驟a，建立如下擴(kuò)增反應(yīng)體系:5 μ I RNA樣品、2.5 μ I Bst DNA聚合酶緩沖液(IOx)、I μ IBst DNA 聚合酶(8U/ μ I)、I μ IAMV 反轉(zhuǎn)錄酶(IOU/ μ I)、I μ IdNTP (25mmol/μ 1)、5μ IBetaine (5 μ mol/μ 1)、1μ lMgS04 (IOOnmol/μ I)、對(duì)應(yīng)于 L 基因的四條引物各I μ I 引物濃度為 F3 與 Β3:5pmol/y 1、BIP 與 FIP:70pmol/y 1、H2O 補(bǔ)足至 25 μ I ；
[0019]步驟b，將上述各組分混勻后，在65°C水浴中反應(yīng)1.5~2h ;
[0020]步驟c，用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，然后觀察結(jié)果。
[0021]與現(xiàn)有技術(shù)相比較本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明新型的RT-LAMP技術(shù)具有快速靈敏、操作簡(jiǎn)單，安 全性高，價(jià)格低廉，不需要特殊儀器等優(yōu)點(diǎn)，特別適用于基層檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)普及應(yīng)用。本發(fā)明建立的RT-LAM P方法特異性和敏感性方面不亞于熒光RT-PCR方法，在快速檢測(cè)方面起到一定的作用。檢測(cè)RVFV核酸技術(shù)能夠用于臨床診斷、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和風(fēng)險(xiǎn)因子的研究。在符合流行病學(xué)的情況下，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)、血清學(xué)技術(shù)、病毒分離等診斷技術(shù)進(jìn)行綜合檢測(cè)，這樣保證檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確和可靠。
【具體實(shí)施方式】
[0022]以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明上述的和另外的技術(shù)特征和優(yōu)點(diǎn)作更詳細(xì)的說(shuō)明。
[0023]本發(fā)明參照OIE推薦的RT-PCR方法擴(kuò)增的靶序列設(shè)計(jì)RT-LAMP引物，并優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了一種更加穩(wěn)定的檢測(cè)方法。
[0024]根據(jù)GenBank中登錄的裂谷熱L片段基因分析其保守序列，設(shè)計(jì)RT-LAMP擴(kuò)增所用引物FIP、BIP、F3、B3由本發(fā)明設(shè)計(jì)。RT-LAMP引物序列如下:
[0025]F3:5/ -CCCCCAATAAAGTGAAAATTCC-3'
[0026]B3:5/ -ACATCCCCTAATGATCAGTG-3'
[0027]FIP(Flc+F2):
[0028]5' -TGTTGCACAAGTCCACACAG-GAGACACATGGCATCAGG-3'
[0029]BIP(Blc+B2):
[0030]5' -TCAGATGATGCAAGGAAGTGGA-TTTAGGAGAGGTGAACTCACA-3'
[0031 ] F2:5/ -GAGACACATGGCATCAGG-3'
[0032]FlC:5/ -TGTTGCACAAGTCCACACAG-3'
[0033]B2:5/ -TTTAGGAGAGGTGAACTCACA-3'
[0034]BlC:5/ -TCAGATGATGCAAGGAAGTGGA-3'
[0035]在檢測(cè)過(guò)程中:
[0036]步驟a，建立如下擴(kuò)增反應(yīng)體系:5μ I RNA樣品、2.5 μ IBst DNA聚合酶緩沖液(IOx)、I μ IBstDNA 聚合酶(8U/ μ I)、I μ IAMV 反轉(zhuǎn)錄酶(10U/ μ I)、I μ IdNTP (25mmol/μ 1)、5μ I Betaine (5 μ mol/μ 1)、1μ lMgS04 (IOOnmol/μ I)、對(duì)應(yīng)于 L 基因的四條引物各I μ I 引物濃度為 F3 與 Β3:5pmol/y 1、BIP 與 FIP:70pmol/y 1、H20 補(bǔ)足至 25 μ I。
[0037]步驟b，將上述各組分進(jìn)行混勻后，在65°C水浴中反應(yīng)1.5~2h ;
[0038]步驟c，用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，然后觀察結(jié)果。
[0039]本發(fā)明新型的RT-LAMP技術(shù)具有快速靈敏、操作簡(jiǎn)單，安全性高，價(jià)格低廉，不需要特殊儀器等優(yōu)點(diǎn)，特別適用于基層檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)普及應(yīng)用。本發(fā)明建立的RT-LAMP方法特異性和敏感性方面不亞于熒光RT-PCR方法，在快速檢測(cè)方面起到一定的作用。檢測(cè)RVFV核酸技術(shù)能夠用于臨床診斷、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和風(fēng)險(xiǎn)因子的研究。在符合流行病學(xué)的情況下，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)、血清學(xué)技術(shù)、病毒分離等診斷技術(shù)進(jìn)行綜合檢測(cè)，這樣保證檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確和可靠。
[0040]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，對(duì)發(fā)明而言僅僅是說(shuō)明性的，而非限制性的。本專業(yè)技術(shù)人員理解，在發(fā)明權(quán)利要求所限定的精神和范圍內(nèi)可對(duì)其進(jìn)行許多改變，修改，甚至等效，但都將落 入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種裂谷熱病毒RT-LAMP的檢測(cè)方法，其特征在于，根據(jù)GenBank中登錄的裂谷熱L片段基因分析其保守序列，采用的RT-LAMP引物序列如下:
F3:5/ -CCCCCAATAAAGTGAAAATTCC-3'
B3:5/ -ACATCCCCTAATGATCAGTG-3'
FIP(Flc+F2):
.5' -TGTTGCACAAGTCCACACAG-GAGACACATGGCATCAGG-3'
BIP(Blc+B2):
.5' -TCAGATGATGCAAGGAAGTGGA-TTTAGGAGAGGTGAACTCACA-3'
F2:5' -GAGACACATGGCATCAGG-3'
FlC:5/ -TGTTGCACAAGTCCACACAG-3'
B2:5/ -TTTAGGAGAGGTGAACTCACA-3' BlC:5' -TCAGATGATGCAAGGAAGTGGA-3'。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裂谷熱病毒RT-LAMP的檢測(cè)方法，其特征在于，檢測(cè)過(guò)程中: 步驟a，建立如下擴(kuò)增反應(yīng)體系:5 μ IRNA樣品、2.5 μ IBst DNA聚合酶緩沖液(IOx)、.1 μ IBst DNA 聚合酶(8U/ μ I)、I μ IAMV 反轉(zhuǎn)錄酶(10U/ μ I)、I μ IdNTP (25mmol/μ I)、.5 μ IBetaine (5 μ mol/μ 1)、1μ lMgS04 (IOOnmol/μ I)、對(duì)應(yīng)于 L基因的四條引物各 I μ I 引物濃度為 F3 與 Β3:5pmol/y 1、BIP 與 FIP:70pmol/y 1、H2O 補(bǔ)足至 25 μ I ； 步驟b，將上述各組分混勻后，在65°C水浴中反應(yīng)1.5~2h ; 步驟C，用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，觀察結(jié)果。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103952494SQ201410078254
【公開(kāi)日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年3月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月6日
【發(fā)明者】王 華, 吳曉東, 徐天剛, 王淑娟, 李林, 王志亮 申請(qǐng)人:中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心