專利名稱：重組人雌激素α受體配體結(jié)合域蛋白及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及如何快速、大量地獲取重組人雌激素α受體配體結(jié)合域蛋白并將其 固定化于載體表面，用于選擇性純化環(huán)境雌激素污染物的相關(guān)方法，屬于生物分析化學(xué)領(lǐng) 域。
背景技術(shù)：
環(huán)境雌激素是一類能夠模仿生物內(nèi)源性雌激素的功能而對生物內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生 干擾和破壞作用的外源性化合物，它們廣泛存在于環(huán)境中，對人類健康造成嚴(yán)重的威脅。近 十幾年來針對已發(fā)現(xiàn)的各種環(huán)境雌激素物質(zhì)，如雙酚Α、己烯雌酚、烷基苯酚、酞酸酯類化合 物和有機氯農(nóng)藥等已經(jīng)建立了各種各樣的分析檢測方法。但這些方法主要依賴于根據(jù)化合 物的極性特點進行提取和純化，選擇性不高，經(jīng)常由于樣品基體的嚴(yán)重干擾而無法準(zhǔn)確定 性和定量。免疫親和純化方法特異性好，但局限于識別抗體對應(yīng)的抗原分子，對雌激素類化 合物并沒有普適性，需要逐一制備各化合物的抗體，使用時也達不到高通量檢測的要求。為 了能夠快速了解環(huán)境樣品中雌激素污染的總體水平，并且及時發(fā)現(xiàn)目前未知的其它具有類 雌激素性質(zhì)的人工化學(xué)品，迫切需要開發(fā)能同時檢測樣品中所有環(huán)境雌激素污染物的組成 和含量的高通量、通用型檢測技術(shù)。研究表明，環(huán)境中的雌激素類污染物對生物體的作用途徑和生物效應(yīng)雖不完全相 同，但一般都是通過與雌激素受體結(jié)合而產(chǎn)生作用。因此，有效利用雌激素受體來構(gòu)建環(huán)境 雌激素類污染物的檢測方法是解決上述難題的一條重要途徑?，F(xiàn)有的環(huán)境雌激素污染物的 高通量預(yù)篩選方法有人體乳腺癌細(xì)胞增殖法(MCF-7cell proliferation，簡稱Ε-Screen) 和重組酵母檢測系統(tǒng)(Yeast estrogen screen，簡稱YES)。然而，實際體系中的環(huán)境雌激 素污染物與其他物質(zhì)之間常存在協(xié)同效應(yīng)或拮抗效應(yīng)，這種相互作用可對上述Elcreen 或YES方法造成嚴(yán)重干擾，從而限制了這兩種方法的廣泛應(yīng)用。與前述兩種方法相比，基于 雌激素受體蛋白對具有雌激素活性的化合物的特異性識別作用的體外分析法具有快速、可 靠、成本低、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，在實現(xiàn)高通量預(yù)篩選方面具有明顯的優(yōu)勢。目前獲得人雌激素受體的途徑主要有從子宮等組織樣品中提取及采用真核細(xì)胞 表達等，這兩類方法都存在過程繁瑣、耗時且產(chǎn)量低的缺點，無法滿足大量使用的需求，嚴(yán) 重制約了相關(guān)檢測方法的發(fā)展。人雌激素α受體蛋白可劃分為六個不同的功能結(jié)構(gòu)域，其 中能夠特異性地與內(nèi)源或外源性雌激素化合物相結(jié)合的配體結(jié)合域(LBD)含有約250個氨 基酸殘基，將包含此配體結(jié)合域的蛋白片段單獨克隆出來，則有望實現(xiàn)大批量的原核表達 并應(yīng)用于相關(guān)雌激素化合物的體外分析。大規(guī)模重組受體配體結(jié)合域的表達通常是在酵母和大腸桿菌中進行，例如，1996 年Siackleton等報道了重組人雌激素α受體配體結(jié)合域蛋白(rhERα-LBD) (303-553) 在啤酒酵母Mccharomyces cerevisiae BJ M60中的過表達，重組蛋白融合了泛素標(biāo) 簽(ffitkowska, H. Ε. , Green, B. N. , Carlquist, Μ. , and Shackleton, C. H. L. . Intact noncovalent dimer of estrogenreceptor ligand-binding domain can be detected byelectrospray ionization mass spectrometry. Steroids (1996),61 :433-438.)。1998 年，Greene等報道了 rhER α -LBD (四7_554)在大腸桿菌菌株BL21 (DE3) pLysS中的過表達， 重組蛋白通過雌二醇親和柱和離子交換柱層析得以純化，純化的蛋白用于研究受-配體復(fù) 合物的晶體結(jié)構(gòu)(Andrew K. Shiau, Danielle Barstad, PauIaM. Loria, Lin Cheng, Peter J. Kushner, David A. Agard, and Geoffrey L. Greene. The StructuralBasis of Estrogen Receptor/Coactivator Recognition and the Antagonism of This Interaction byTamoxifen. Cell (1998)，95 :927-937.)。2001 年 Ruff 科研組報道了四種 rhERa -LBD,即 (302-552)，(302-595)，(302-531)和(302-567)在大腸桿菌菌株 BL21 (DE3)中的過表達， 重組蛋白在N端設(shè)計有一個6XHis tag，所得可溶性重組蛋白通過親和、離子交換和凝膠 過濾三步層析得以純化(Sylvia Eiler,Monique Gangloff, Sylvie Duclaud，Dino Moras, and Marc Ruff. Overexpression, Purification, and Crystal Structure of Native ERa LBD. Protein Expression andPurification (2001)，22 :165-173.)。該科研組在蛋白 的表達和純化過程中都加入了配體雌二醇，純化后的蛋白用來結(jié)晶和分析結(jié)構(gòu)。從上述已報道的重組人雌激素α受體配體結(jié)合域蛋白(rhERa-LBD)的組成來 看，都是從LBD對應(yīng)的起始氨基酸302開始或只向N端延伸了 5個氨基酸(即從297位氨 基酸開始)，這對保護LBD的活性構(gòu)象是不足的；另外從制備方法上看，上述方法均只在蛋 白的一端融合了標(biāo)簽，純化過程中需要多個步驟，而且都需加入大量的雌二醇配體來保護 受體蛋白的活性和構(gòu)象，不僅耗時費力，而且增加了成本；尤其重要的是，到目前為止，國內(nèi) 外都還沒有研究小組報道利用rhERa LBD制備雌激素受體親和吸附劑并用于環(huán)境雌激素 污染物的選擇性純化富集。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的是提供一種重組人雌激素α受體配體結(jié)合域蛋白，以用于 環(huán)境雌激素類污染物的檢測。本發(fā)明的重組人雌激素α受體配體結(jié)合域蛋白，包括人雌激素α受體蛋白的 第270位氨基酸殘基至第5M-595位中任一氨基酸殘基的片段，以及連接于該片段N端的 6 X Hi s 標(biāo)簽(6 X Hi s tag)和 C 端的 Str 印 tag II 標(biāo)簽(Strep tag II tag)。人雌激素α受體蛋白(hERa (1-595))的氨基酸序列如序列表中SEQ No. 1所 示，其基因序列如序列表中SEQ No. 2所示。優(yōu)選的，所述片段為下列兩種片段之一 (1)人雌激素α受體蛋白的第270位氨基酸殘基至第5 位氨基酸殘基的片段，即 hERa (270-554) ； (2)人雌激素α受體蛋白的第270位氨基酸殘基至第595位氨基酸 殘基的片段，即hERa (270-595) 0相應(yīng)的重組人雌激素α受體配體結(jié)合域蛋白命名為 rhERa -LBD(270-554)和 rhERa -LBD(270-595)本發(fā)明的第二個目的是提供一種制備上述重組人雌激素α受體配體結(jié)合域蛋白 的方法，其包括以下步驟1)設(shè)計引物，通過PCR將人雌激素α受體蛋白的第270位氨基酸殘基至第 554-595位中任一氨基酸殘基的片段的DNA序列克隆出來；2)將步驟1)得到的DNA序列連接到雙標(biāo)簽表達質(zhì)粒載體中，使該DNA序列的5’ 端和3’端分別連接6XHis tag和Mi^p tag II tag的編碼序列，得到重組蛋白表達質(zhì)粒；3)將步驟幻獲得的重組蛋白表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞，表達重組人雌激素α受體蛋白 配體結(jié)構(gòu)域蛋白，該蛋白的N端帶有6XHis標(biāo)簽，C端帶有乂1~印tag II標(biāo)簽；4)裂解細(xì)胞，然后離心取上清5)上清液利用Ni-NTA親和層析柱進行第一步親和純化，收集洗脫物；6)在第一步親和純化的洗脫物中加入親和素(avidin)以屏蔽生物素；7)將步驟6)處理后的樣品用Mi^p-Tactin kpharose凝膠柱進行第二步親和層 析，收集洗脫物，濃縮保存。上述步驟2、所使用的雙標(biāo)簽表達質(zhì)粒載體優(yōu)選德國IBA公司的雙標(biāo)簽表達質(zhì)粒 pASK-IBA43plus (大腸桿菌表達載體)或pEXPR_IBA43 (哺乳動物細(xì)胞表達載體)。本發(fā)明的第三個目的是提供一種環(huán)境雌激素污染物的高通量檢測手段，將上述重 組人雌激素α受體配體結(jié)合域蛋白固定化于載體表面，制成雌激素受體親和吸附劑，用于 選擇性純化和富集環(huán)境中的雌激素污染物。上述載體可以是能夠固定化所述重組人雌激素α受體配體結(jié)合域蛋白的凝 膠，可以是Ni-NTA親和層析凝膠、Strep-Tactin Sepharose凝膠，也可以是CNBr活化的 Sepharose 4Β凝膠。將重組人雌激素α受體配體結(jié)合域蛋白偶聯(lián)到其中一種凝膠上，然后 裝柱制成雌激素受體親和柱，利用該雌激素受體親和柱純化和富集環(huán)境樣品中的雌激素污 染物，并可進行定量測定。該方法可檢測的雌激素污染物包括雌激素和雌激素結(jié)構(gòu)類似物，例如17β_雌 二醇、己烯雌酚、雙酚Α、烷基苯酚、香豆雌酚、大豆苷元、雌三醇和雌酮等。本發(fā)明的創(chuàng)新之處包括以下幾個方面(1)選擇克隆的包含人雌激素α受體配體 結(jié)合域的片段是從人雌激素α受體蛋白的第270位氨基酸殘基開始的，向LBD的N端延 伸了 32個氨基酸殘基，有效保護了 LBD的活性構(gòu)象。實驗表明rhERα -LBD(270-595)和 rhERα-LBD(270-554)在穩(wěn)定性和與雌激素化合物的結(jié)合活性方面均優(yōu)于已經(jīng)報道過的 rhERa-LBD097-554)。( 本發(fā)明的重組人雌激素α受體配體結(jié)合域蛋白均帶有雙標(biāo)簽 (N端的6XHis tag和C端的Mi^p tagll tag)，同時帶有這兩種標(biāo)簽的重組人雌激素α 受體配體結(jié)合域蛋白尚屬首次報道，融合的兩個標(biāo)簽不僅有利于蛋白純化，也為蛋白的后 續(xù)應(yīng)用提供了更多便利。( 本發(fā)明的蛋白表達和純化流程中都不需要另外加入配體來幫 助穩(wěn)定重組蛋白的結(jié)構(gòu)或幫助洗脫純化，這樣不僅簡化了操作，降低了成本，而且所得到的 重組受體配體結(jié)合域蛋白可直接用來測活。(4)本發(fā)明首次將重組人雌激素α受體配體結(jié) 合域蛋白固定化于載體表面，制成雌激素受體親和吸附劑，并用于環(huán)境雌激素污染物的選 擇性純化和富集，為這類環(huán)境污染物的高通量檢測提供了有力的手段。


圖1是人雌激素α受體蛋白(hERa (1-595))和三個不同的重組人雌激素α受 體配體結(jié)合域蛋白 rhER α -LBD (270-595) ,rhER α -LBD (270-554)和 rhER α -LBD (297-554) 的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2是ELRA法比較三種不同重組人雌激素α受體配體結(jié)合域蛋白配體結(jié)合活性 的結(jié)果圖，其中(a)三種不同重組人雌激素α受體配體結(jié)合域蛋白配體結(jié)合活性的比較圖；(b)hER α-LBD (270-595)與全長蛋白的活性比較圖。圖3是通過SDS-PAGE電泳檢驗幾種重組蛋白穩(wěn)定性的實驗結(jié)果。
具體實施例方式下面通過實施例對本發(fā)明做進一步描述，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，實施例 不應(yīng)解釋為對本發(fā)明的限制，在本發(fā)明的精神和實質(zhì)范圍內(nèi)，可以做各種修改和變動，本發(fā) 明的保護范圍應(yīng)視所附權(quán)利要求書而定。一、重組蛋白的制備1.構(gòu)建表達質(zhì)粒圖1顯示了本實驗克隆的三種包含人雌激素α受體的LBD的不同長度的片段，其 中第三種rhERa-LBD097-554)是現(xiàn)有文獻報道過的，在此用作對照?？寺〉木唧w方案是 以含有人雌激素受體acDNA序列的質(zhì)粒pcDNA3. l(-)-hERa (北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 尚永豐院士贈送)為PCR模板，設(shè)計特異引物對上述選擇區(qū)域進行擴增，合成的四條引物序 列如下正向O70-)引物5 ‘ -TGGAATTCCAGAGAGATGATGGGGAGGGCAG-3 ‘
正向 Q97-)引物 1 5 ‘ -GGAATTCATGATCAAACGCTCTAAGAAGAACAG-3 ‘反向(-554)引物5‘ -ATTAGCTCGAGGCTAGTGGGCGCATGTAGG-3 ‘反向(-59 引物5 ‘ -AATGCTCGAGGACTGTGGCAGGGAAACCCT-3 ‘在引物上設(shè)計了兩個限制性內(nèi)切酶酶切位點EcoR I和)(h0 I，為擴增片段在克隆 載體中的插入準(zhǔn)備條件。參照相關(guān)軟件計算，我們采用統(tǒng)一的PCR熱循環(huán)參數(shù)95°C變性 2min ；94°C 30s，60°C退火30s，72°C延伸4min，;35個循環(huán)；72°C延伸lOmin，不同長度的三種 克隆片段一起被成功地擴增出來。我們選擇德國IBA公司的雙標(biāo)簽表達質(zhì)粒pASK-IBA43plus為克隆載體，利用它克 隆表達的融合蛋白都有一個N端6XHis tag和一個C端Mi^p tag II tag，這兩種標(biāo)簽 可以用于融合蛋白的純化和識別，所以表達質(zhì)粒的選擇也基本決定了后續(xù)重組蛋白的表達 和純化步驟?？寺∑谓?jīng)電泳和測序等步驟檢驗正確后，再經(jīng)雙酶切獲得兩個粘性末端，并 在T4連接酶催化下連入上述雙標(biāo)簽表達載體。以TOP 10為轉(zhuǎn)化克隆菌，在氨芐青霉素平 板上篩選成功轉(zhuǎn)化的單克隆，并提取和檢驗質(zhì)粒。按照上述克隆方法成功構(gòu)建了重組人雌 激素α受體配體結(jié)合域蛋白的系列原核表達質(zhì)粒，包括pASK-IBA43plus-hERa-LBD(270 -595)，pASK-IBA43plus-hER a -LBD (270-554)和 pASK_IBA43plus_hERa -LBD(297-554)。2.表達重組蛋白將上述成功構(gòu)建的原核表達質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入表達菌株大腸桿菌BL21，然后進行原 核表達。原核表達過程包括如下步驟(1)將帶有原核表達質(zhì)粒的大腸桿菌BL21劃線接種于LB (Amp+)平板，37°C過夜培 養(yǎng)( 16h)；(2)從過夜培養(yǎng)平板上挑取一個單克隆并接入3 5毫升新鮮LB (Amp+)液體培養(yǎng) 基中，370C，250rpm,培養(yǎng)6 7小時；然后，吸取1微升該對數(shù)生長中期菌液轉(zhuǎn)接入200毫 升新鮮LB (Amp+)液體培養(yǎng)基中，30°C，220rpm，培養(yǎng)過夜(12 14h)；(3)按(1 50)的體積比將過夜培養(yǎng)物再次進行轉(zhuǎn)接，接入5. 5升新鮮LB(Amp+)液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，370C，250rpm,并小心監(jiān)測OD55tlnm值；當(dāng)OD55tlnm = 0. 5 0. 6時，迅速 加入誘導(dǎo)物脫氫四環(huán)素O00yg/L)進行誘導(dǎo)表達，此時的表達實驗條件是30°C，200rpm， 3h ；(4)表達結(jié)束后，將培養(yǎng)菌迅速降溫，然后離心收集菌體(7000rpm，10min,4°C )， 稱重，低溫凍存。3.純化重組蛋白鑒于重組蛋白兩端各帶有一個可用于純化的標(biāo)簽N端的6XHis tag和C端的 Strep tag Iltag，我們采用了相應(yīng)的蛋白純化步驟即兩步親和層析，具體如下(I)^M:將凍存的已表達菌解凍，加入細(xì)胞裂解液重懸，然后冰浴中靜置作用 30分鐘；用細(xì)胞破碎儀對重懸菌體進行超聲裂解OO 30min)；低溫離心(12，000Xg， 30min, 4°C )，棄沉淀，取上清，并加入DNase I (5 μ g/mL)室溫作用10 15分鐘以降低溶液 的粘稠度。(2)第一步親和層析取步驟(1)處理后上清樣品加入Ni-NTA柱，依次加入結(jié)合 緩沖液、洗滌緩沖液和洗脫緩沖液，收集洗脫物。(3)牛物素屏蔽匯集第一步純化洗脫物，加入avidin，混勻并低溫)靜置作 用1小時。(4)第二步親和層析取步驟(3)處理后樣品直接加入Mi^p-Tactin Sepharose 柱，依次加入洗滌緩沖液和洗脫緩沖液，收集洗脫物。(5)蛋白濃縮匯集第二步純化洗脫物，超濾濃縮，最后分裝凍存(_80°C )。上述重組人雌激素α受體配體結(jié)合域蛋白的純化過程，除了已特別說明的部分 外，都在0 4°C進行。其中步驟(1)所采用細(xì)胞裂解液的基本組成是300mM NaCl, 50mM Na&P04，IOmM咪唑 (imidazole), pH 8. 0，臨用前再加入溶菌酶(lmg/ml)，苯甲磺酰氟(PMSF) (ImM)，β _巰基 乙醇(20mM)和吐溫20(0. 1% ) ο步驟( 利用的是重組蛋白N端所帶6XHis tag。所用各緩沖液的基本組成是 300mMNaCl,50mM NaH2PO4,0. 吐溫20,0.05% β -巰基乙醇，結(jié)合緩沖液、洗滌緩沖液和 洗脫緩沖液中還分別加入了 10mM、20mM和250mM咪唑，緩沖液pH值均為8. 0。步驟(3)的目的是用親和素將樣品中混有的生物素酰化蛋白屏蔽，因為這些雜蛋 白不能經(jīng)步驟(4)去除。步驟(4)利用的是重組蛋白C端所帶乂1~印tag II tag。所有各緩沖液的基本組 成是100mM Tris-HCl pH 8. 0,150mM NaCl, ImM EDTA，其中洗脫緩沖液中還加入了 2. 5mM 脫硫生物素，脫硫生物素將和重組蛋白C端的Mi^p tag II tag競爭結(jié)合Mi^p-hctin 蛋白(德國IBA公司)，從而使得重組蛋白被洗脫。步驟( 進行超濾的目的不僅是為了濃縮蛋白，也是為了去掉脫硫生物素和更換 緩沖液，蛋白凍存緩沖液的組成是50mM Tris-HCl pH 8. 0,75mM NaCl，10%甘油。二、重組蛋白性質(zhì)的檢測1.檢測三種重組蛋白的配體結(jié)合活性采用酶聯(lián)受體分析法(ELRA)對重組蛋白的配體結(jié)合活性進行測定，并結(jié)合我們 所構(gòu)建重組蛋白的特點在已報道的ELRA分析法的基礎(chǔ)上加以了改進，具體步驟如下
(I)^tM 將一定濃度的17 β -雌二醇-BSA偶聯(lián)物(E2-BSA)溶液加入96孔酶標(biāo) 板，37°C保溫(彡2h)或4°C過夜；(2) JMk 用PBST洗板3次，每次5分鐘，在濾紙上拍干；(3)封閉將新鮮配制的2% BSA溶液加入測試板孔，37°C保溢(彡2h)或4°C過 夜；(4) mH 用PBST洗板3次，每次5分鐘，在濾紙上拍干；(5)警-配體相互作用分兩種情況若是直接測定與固定配體的結(jié)合，則將一定濃度重組受體蛋白溶液 直接加入測試板孔，20°C靜置作用1小時后再進行后續(xù)操作；若是通過競爭性結(jié)合來間接 比較受-配體親和力大小，則先將一定量不同游離配體分別加入重組受體蛋白溶液，混勻 并靜置作用(20°C，2h)，然后再加入測試板孔，20°C再靜置作用1小時，隨后進行后續(xù)操作。(6) mti 用PBST洗板3 4次，每次5 10分鐘，在濾紙上拍干；(T)JM 將一定稀釋度的識別蛋白Str印Tactin-HRP (辣根過氧化物酶HRP偶聯(lián) 的Mi^p-Tactin蛋白)溶液加入測試板孔，20°C靜置作用1小時；(S)JMk 用PBST洗板3 4次，每次5 10分鐘，在濾紙上拍干；(9)顯餼加入HRP底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，37°C保溫反應(yīng)15 20分鐘，然后加 入2M H2SO4終止反應(yīng)。(IO)^M 在酶標(biāo)儀上，于波長450nm處測定光吸收值。上述重組人雌激素α受體配體結(jié)合域蛋白的配體結(jié)合活性的測定過程，除了已 特別說明部分，都在20°C進行。其中步驟(1)包被的E2-BSA是采用碳二亞胺法偶聯(lián)而成，而包被緩沖液組成是 IOOmMNa2CO3-NaHCO3, pH 9.6。步驟(2)、(4)、(6)、(8)洗板步驟所用PBST洗滌液組成是10mM PBS, pH 7. 4， 0. 05% 吐溫 20。步驟(3)的目的是將測試板孔中的非特異性結(jié)合位點進行有效地屏蔽，所采用 BSA濃度為2%，封閉緩沖液組成同步驟(1)中包被緩沖液。步驟(5)受-配體相互作用反應(yīng)體系所采用緩沖組成是10mM Tris-HCl pH 7. 6， 10%甘油，0. 1% BSAo步驟(7)中所用識別蛋白Str印Tactin-HRP(德國IBA公司生產(chǎn))不僅可以特異 性地識別重組受體蛋白所帶的Mmp tag，而且可以進行后續(xù)酶催化底物反應(yīng)，從而達到識 別檢測的目的；所用Mi^pTactin-HRP的稀釋緩沖液組成是=IOmM PBS，pH 7.4,0. 1%BSA0步驟(9)中底物TMB反應(yīng)混和物的組成是100mM Na2HP04pH 6. 0,0. 25mM TMB, 0. 15% H2O2 ；TMB和H2A必須新鮮混和，而且H2A只能在臨用前才混入，隨即將反應(yīng)混和物 加入測試板孔。步驟(5)、(7)、(9)中靜置作用或保溫反應(yīng)時都應(yīng)采取避光措施。圖2是采用ELRA法比較三種不同重組人雌激素α受體配體結(jié)合域蛋白配體結(jié)合 活性的測試結(jié)果。圖3是用SDS-PAGE電泳法檢驗幾種重組蛋白穩(wěn)定性的實驗結(jié)果。從圖2可以看出，rhERα -LBD(270-595)的配體結(jié)合活性優(yōu)于其他兩種重組蛋白 (見圖2 (a))，且接近全長受體蛋白的配體結(jié)合活性(見圖2 (b))，說明該重組蛋白片段所含氨基酸序列對保持其活性構(gòu)象是非常有利的。因此我們選用rhERα-LBD(270-5%)重組蛋 白繼續(xù)下面的研究。2.測定重組蛋白與各雌激素化合物的結(jié)合活性采用間接競爭ELRA法比較重組人雌激素α受體配體結(jié)合域蛋白 rhERα-LBD(270-595)與幾種雌激素化合物及結(jié)構(gòu)類似物的結(jié)合活性。待測的配體分子(即雌激素和雌激素結(jié)構(gòu)類似物)包括17β_雌二醇、己烯雌 酚、雙酚Α、大豆苷元、己烯雌酚、萘酚和對苯二酚。各配體分子的測試濃度均為6 μ M ；重組 受體蛋白rhER α -LBD (270-595)的測試濃度為0. 25 μ M0在96孔酶標(biāo)板中，測試組和對照 組的每孔均用100 μ L 2μ g/mL的E2-BSA包被，然后再用2% BSA封閉。不同配體測試組樣品要進行一定時間預(yù)作用，具體操作如后在冰浴上分別加入 各待測配體分子，并與重組受體蛋白溶液充分混和，然后20°C靜置作用2小時。競爭結(jié)合 時，不同配體測試組各平行樣品孔中分別加入100 μ L預(yù)作用測試樣品，20°C靜置作用1小 時；洗板后，每孔再加入100 μ L合適濃度的Str印Tactin-HRP識別蛋白，又20°C靜置作用1 小時；洗板，加入HRP底物，在37°C溫育15 20分鐘后終止顯色反應(yīng)。對照組樣品和測試組樣品同時處理。對照組分陰性對照組和陽性對照組，陽性對 照組的各平行樣品孔中加入100 μ L0. 25 μ M重組受體蛋白，而陰性對照組中僅加入100 μ L 受-配體相互作用緩沖溶液。數(shù)據(jù)處理和分析對不同配體測試組和兩種對照組的測值分別取平均值，然后分 別從陽性對照組平均值和各測試組平均值中扣去陰性對照組平均值，前者所得是無游離配 體競爭情況下重組受體蛋白的相對陽性平均值(包括特異性和非特異性結(jié)合兩部分)，以 競爭前0D45(lnm(0D45(lmi, before)表示，后者所得是各游離配體競爭結(jié)合組中對保留住重組受體 蛋白的平均測值，以競爭后OD45tlnm(OD45tlmuafto)表示。貝1J，用以下公式計算各待測配體的競爭 抑制百分率(inhibition ratio, IR)IR(% ) = (OD450lmbefore-OD450nm,am,after)/OD450lmbeforeX 100,所得競爭抑制百分率值即反映了該配體分子的受體親和力大小。檢測結(jié)果是， 這幾種雌激素及雌激素結(jié)構(gòu)類似物的競爭抑制百分率值如下17β-雌二醇(52.5% 士 2. 7 % )、己烯雌酚(52. 2 % 士 4. 5%)、香豆雌酚3 % 士 3. 7%)、大豆苷元 (38. 5士4. 5% )、雙酚 Α(35·0% 士4.8% )、萘酚(17. 2% ±4. 3% )以及對苯二酚(7.0% 士2. 9% )，測試次數(shù)η = 3 ；對它們的受體親和力大小進行比較，如下17β -雌二醇彡己烯 雌酚>香豆雌酚>大豆苷元>雙酚A >萘酚>對苯二酚。三、重組蛋白的利用1.制備受體親和柱并檢測其性質(zhì)制備受體親和柱可以采用Ni-NTA親和層析凝膠，通過與重組蛋白N端的6XHis 標(biāo)簽的配位作用使抗體固定化，也可以使用Mi^p-hctin kpharose凝膠，通過與重 組蛋白C端的Mmp tag II標(biāo)簽間的特異性相互作用使抗體固定化，兩種方法均為非 共價、定向化的受體固定化方法，操作簡便，但存在成本相對較高、可重復(fù)使用次數(shù)少 等不足之處。為此我們使用成本較低的CNBr活化的kpharose 4B凝膠作為載體，將 hER α-LBD (270-595)通過共價固定化方法制備受體親和柱，步驟如下1)重組受體蛋白與凝膠的準(zhǔn)備將純化后的重組受體蛋白(約0. 7mg/mL)對偶
9聯(lián)緩沖液(0. ImoVLNaHCO3,0. 5mol/LNaCl, pH 8. 3)透析24小時，其間換4次液，待用；在 20mL小燒杯中加入0. 33g CNBr活化的S印harose 4B凝膠固體和IOmL lmmol/L HC1，使 凝膠完全溶脹、懸浮，并以玻棒輕輕攪拌均勻；然后將凝膠溶液轉(zhuǎn)移到G4玻璃濾器中，用 200mL lmmol/L HCl溶液配合水泵抽濾，沖洗，接著再用偶聯(lián)緩沖液沖洗幾遍，抽至近干，用 封口膜封住濾器下部出口，待用；2)重組受體蛋白與凝膠的偶聯(lián)將重組受體蛋白溶液倒入濾器，混合均勻后將液 體轉(zhuǎn)入50mL具塞錐形瓶，并以IOmL左右的偶聯(lián)緩沖液分三次涮洗濾器，涮洗液一并加入錐 形瓶中，加塞后置于20°C溫箱，100-120rpm振蕩2_3小時；3)填柱將偶聯(lián)完畢的凝膠溶液轉(zhuǎn)入玻璃層析柱中，使凝膠在柱中自然沉降，流 出液用在線紫外檢測儀于^Onm檢測并收集(檢測儀預(yù)先用偶聯(lián)緩沖液平衡)，用偶聯(lián)緩沖 液淋洗凝膠柱至紫外信號回至基線，用量筒量取流出蛋白溶液的體積，并測量該溶液的紫 外吸收值，計算重組受體蛋白的偶聯(lián)率；4)封閉用2-3倍凝膠柱床體積的封閉液(0. lmol/L Tris-HCl, pH 8. 0)洗滌柱 子，然后關(guān)閉止水閥，使凝膠處于封閉液中，室溫靜置2hr ；5)平衡接著用 0. Imol/LpH 4. 0 的醋酸緩沖液(含 0. 5mol/LNaCl)和 0. Imol/LpH 8. 0的Tris-HCl緩沖液(含0. 5mol/LNaCl)交替沖洗凝膠柱，每次每種緩沖液的用量不少 于5倍柱床體積，共洗3個循環(huán)；最后用0. 01mol/L PBS溶液平衡，將柱子置于4°C待用。根據(jù)固定化反應(yīng)前后受體蛋白溶液的濃度差可估算出在0. 33g (約1. 2mL)凝膠載 體上的固定化hER α -LBD (270-595)的量為0. 68mg。利用以上受體親和柱對含雌二醇(E2)、 己烯雌酚(DES)和雙酚A(BPA)的標(biāo)準(zhǔn)混和液(10mL，50ng/mL)進行了親和萃取，上樣和淋 洗溶劑均為純水，之后采用ImL 80%甲醇洗脫，最后使用0. 01mol/L PBS(pH= 7. 4)使親和 柱再生。收集到的上樣流出液、淋洗液和洗脫液均在Agilent 6510Q-T0F LC/MS/MS液質(zhì)聯(lián) 用系統(tǒng)上進行定量測定。確定的色譜條件為色譜柱Agilent ZORBAX Extend-C18, 5 μ m, 3. OX 150mm ；流動相ACN H2O = 1 1，流速0. 4ml/min ；質(zhì)譜條件負(fù)離子模式，E2m/z = 271. 17，DES m/z = 267. 16，BPAm/z = 227. 10。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在上樣流出液和淋洗溶液中均 未見各化合物的分子離子峰出現(xiàn)，說明都被保留。洗脫溶液中檢出了三種化合物，回收率在 85%以上。為了證實以上實驗中對三種代表性雌激素化合物的保留是由于受體蛋白的特異 性識別作用，我們設(shè)計進行了兩組對照實驗，一是以結(jié)構(gòu)類似但無雌激素活性的芳香化合 物萘酚作為參照物進行以上實驗，質(zhì)譜檢測m/z = 143. 05，結(jié)果發(fā)現(xiàn)萘酚在上樣時直接 流出，說明所制得的受體親和柱對非雌激素結(jié)構(gòu)類似物的保留可以忽略；另外我們使用 與hER α-LBD (270-595)分子量相近的卵清蛋白分子OVA同時制備了對照柱，并采用與上 述親和純化相同的操作步驟進行測試，上樣0. 50μ g E2，測得在淋洗溶液中氏的含量為 0. 47 μ g，而在洗脫溶液中，E2含量僅約為16ng，表明氏在柱基質(zhì)上的非特異性吸附是可以 忽略的。上述實驗結(jié)果充分證明了本發(fā)明制備的重組受體蛋白對雌激素化合物具有高特異 性識別活性，受體親和柱可用于雌激素化合物的高選擇性純化和富集。2.利用受體親和柱測定自來水樣品中的環(huán)境雌激素污染物利用上述方法制備的rhER α -LBD (270-595)受體凝膠親和柱選擇性純化和富 集自來水樣品中的環(huán)境雌激素污染物。收集約IOOmL自來水樣品，取出相同體積(均為40mL)的兩份，一份用于直接檢測，另一份用于測定加標(biāo)回收率。樣品流過裝載1.2mL固 定化0.68mgrhER α LBD (270-59 的受體親和柱，上樣結(jié)束后用IOmL純水淋洗，之后加入 ImL 80%甲醇的水溶液洗脫。洗脫液經(jīng)氮氣吹干后定容于0.5mL流動相溶液，在Agilent 6510Q-T0FLC/MS/MS液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)上進行定量測定。色譜柱Agilent ZORBAX Extend_C18， 5 μ m，3. OX 150mm ；流動相 ACN H2O=I 1，流速 0. ;3ml/min ；質(zhì)譜條件負(fù)離子模式，E2m/ ζ = 271. 17,DES m/z = 267. 16，BPAm/z = 227. 10。測定結(jié)果表明，自來水樣品中的雙酚A 含量約為22ng/L，雌二醇和己烯雌酚均未檢出。本方法測定自來水中雙酚A含量的最低檢 出限為9ng/L，回收率大于82%。
權(quán)利要求
1.一種重組人雌激素α受體配體結(jié)合域蛋白，包括人雌激素α受體蛋白的第270位 氨基酸殘基至第陽4-595位中任一氨基酸殘基的片段，以及連接于該片段N端的6XHis標(biāo) 簽和C端的Str印tag II標(biāo)簽。
2.如權(quán)利要求1所述的重組人雌激素α受體配體結(jié)合域蛋白，其特征在于，所述片段 選自下述片段之一 1)人雌激素α受體蛋白的第270-5 位氨基酸殘基的片段；幻人雌激 素α受體蛋白的第270-595位氨基酸殘基的片段。
3.—種重組人雌激素α受體配體結(jié)合域蛋白的制備方法，包括以下步驟1)通過PCR將人雌激素α受體蛋白的第270位氨基酸殘基至第554-595位中任一氨 基酸殘基的片段的DNA序列克隆出來；2)將步驟1)得到的DNA序列連接到雙標(biāo)簽表達質(zhì)粒載體中，使該DNA序列的5’端和 3’端分別連接6XHis標(biāo)簽和乂1~印tag II標(biāo)簽的編碼序列，得到重組蛋白表達質(zhì)粒；3)將步驟幻獲得的重組蛋白表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞，表達重組人雌激素α受體蛋白配體 結(jié)構(gòu)域蛋白，該蛋白的N端帶有6XHis標(biāo)簽，C端帶有Mmp tag II標(biāo)簽；4)裂解細(xì)胞，然后離心取上清；5)上清液利用Ni親和層析柱進行第一步親和純化，收集洗脫物；6)在第一步親和純化的洗脫物中加入親和素以屏蔽生物素；7)將步驟6)處理后的樣品用Str印-Tactinkpharose柱進行第二步親和層析，收集 洗脫物，濃縮保存。
4.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟1)將人雌激素α受體蛋白的第 270-554位或第270-595位氨基酸殘基的片段的DNA序列克隆出來。
5.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟幻所使用的雙標(biāo)簽表達質(zhì)粒載體 為 pASK-IBA43plus 或 pEXPR_IBA43。
6.權(quán)利要求1所述重組人雌激素α受體配體結(jié)合域蛋白在檢測環(huán)境雌激素污染物中 應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，將所述重組人雌激素α受體配體結(jié)合域蛋 白固定化于載體表面，制成雌激素受體親和吸附劑，用該雌激素受體親和吸附劑選擇性純 化和富集環(huán)境中的雌激素污染物。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述載體是能夠固定化所述重組人雌激素 α受體配體結(jié)合域蛋白的凝膠，將重組人雌激素α受體配體結(jié)合域蛋白偶聯(lián)到凝膠上，然 后裝柱制成雌激素受體親和柱，利用該雌激素受體親和柱純化和富集環(huán)境樣品中的雌激素 污染物。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述載體是M-NTA親和層析凝膠、 Strep-TactinSepharose 疑月交或 CNBr 舌U白勺 Sepharose 4Β 疑月交。
10.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述雌激素污染物為下列物質(zhì)中的一種或 多種17 β -雌二醇、己烯雌酚、雙酚Α、烷基苯酚、大豆苷元、香豆雌酚、雌三醇和雌酮。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組人雌激素α受體配體結(jié)合域蛋白，以及該重組蛋白的制備方法和應(yīng)用。該重組蛋白包括人雌激素α受體蛋白的第270位氨基酸殘基至第554-595位中任一氨基酸殘基的片段，以及連接于該片段N端的6×His標(biāo)簽和C端的Strep tag II標(biāo)簽，其在穩(wěn)定性和與雌激素化合物的結(jié)合活性方面均優(yōu)于已經(jīng)報道過的同類蛋白。且本發(fā)明的重組人雌激素α受體配體結(jié)合域蛋白帶有雙標(biāo)簽，便于純化和后續(xù)應(yīng)用。將該重組蛋白固定化于載體表面，制成雌激素受體親和吸附劑，可用于環(huán)境雌激素污染物的選擇性純化和富集，為這類環(huán)境污染物的高通量檢測提供了有力的手段。
文檔編號C12N15/12GK102060922SQ201010554288
公開日2011年5月18日 申請日期2010年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月19日
發(fā)明者李金秋, 欒書, 王丹, 謝江碧, 趙美萍 申請人:北京大學(xué)