專利名稱：用于馬鹿茸真?zhèn)舞b別的引物及探針、試劑盒和方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體而言，本發(fā)明涉及用于馬鹿茸真?zhèn)舞b別的特異性 寡核苷酸引物及探針，用于鑒別馬鹿茸真?zhèn)蔚膶崟r熒光PCR檢測方法，以及所述特異性寡 核苷酸引物和探針或試劑盒在鑒別馬鹿茸真?zhèn)沃械膽谩?br> 背景技術：
jfg ^ (Cornu Cervi Pantotrichum) i jfg 禾斗云力· _ jfg (Cervus nippon Temminck)或馬鹿(Cervus elaphus Linnaeus)雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，習稱花鹿茸、 馬鹿茸。鹿茸始載于《神農本草經》，列為中品，具有壯腎陽、益精血、強筋骨等功效，是我 國名貴的動物藥之一?，F(xiàn)市售種類規(guī)格較多，由于原動物不同，分花鹿茸和馬鹿茸兩種；由 于采收方法不同，又分砍茸、鋸茸和鹿茸片三種；由于叉枝多少及老嫩不同，又分為鞍子、二 杠、三岔、蓮花等多種。鹿的種類甚多，但有藥用價值的主要指梅花鹿和馬鹿。馬鹿是僅次于駝鹿的大型 鹿類，因為體形似駿馬而得名。馬鹿的種類主要有挪威馬鹿、巴巴里馬鹿、科西嘉馬鹿、西 非馬鹿、中歐馬鹿、蘇格蘭馬鹿、西班牙馬鹿、東歐馬鹿、大夏馬鹿、塔里木馬鹿、克什米爾馬 鹿、西藏馬鹿、白臂鹿。由于馬鹿價格昂貴，一些不法分子采用以假亂真的手段謀取暴利，不僅危害了 消費者的利益，而且對構建和諧的市場秩序造成了嚴重的影響。市場上常有偽品制成的 切片出售。主要為美洲鹿亞科的狍(Capreolus capreolus)、馴鹿(Alces alces)、馴鹿 (Rangifer tarandus)等角以及其他動物的骨塊或動物膠用動物皮包埋后切制成的偽品。為了維護消費者的利益以及良好的市場秩序，國內外許多學者研究了多種方法對 鹿茸的真?zhèn)芜M行鑒別。常用的方法有性狀鑒別、顯微鑒別、薄層色譜法鑒別、光譜法鑒別、紫 外光譜法鑒別等。但是傳統(tǒng)的檢測方法易受不同品種及產地的鹿茸中所含有的化學成分的 影響，由于現(xiàn)在的摻偽水平和手段越來越高明，摻偽成分越來越復雜，嚴重限制了傳統(tǒng)的檢 測方法應用空間。分子生物學技術以其方便、準確、迅速、簡潔的特點，已成為近年來國內外學者研 究的熱點，其為證明食品的真?zhèn)翁峁┝苏鎸崱⒖煽康囊罁?jù)，給食品種類鑒別、產品溯源等食 品鑒偽研究注入了新鮮血液。但是，截至目前，分子生物學技術在中藥材馬鹿茸鑒偽方面的 應用尚處于初步研究階段。目前，國內外少見報道能快速、簡單、特異且靈敏地鑒別中藥材馬鹿茸的方法。因此，本領域需要一種快速、特異性好、靈敏度高的中藥材馬鹿茸的真?zhèn)舞b別方 法，進行中藥材馬鹿茸真?zhèn)蔚蔫b別。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的在于，提供快速鑒別馬鹿茸的特異性寡核苷酸引物及探針。本發(fā)明的另一個目的在于，提供快速鑒別馬鹿茸真?zhèn)蔚膶崟r熒光PCR檢測方法。
本發(fā)明的再一個目的在于，提供用于快速鑒別馬鹿茸真?zhèn)蔚脑噭┖?。本發(fā)明的再一個目的在于，提供本發(fā)明的特異性寡核苷酸引物和探針在鑒別馬鹿 茸真?zhèn)沃械膽谩ａ槍ι鲜霭l(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術方案根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，本發(fā)明提供用于馬鹿茸真?zhèn)舞b別的特異性寡核 苷酸引物對和探針。本發(fā)明以馬鹿的DNA為檢測基礎，根據(jù)線粒體DNA(mtDNA)D-環(huán) (Displancement loop, D-Loop)區(qū)序列在不同鹿科物種中具有差異性的特點，克隆了馬鹿 線粒體DNA D-環(huán)區(qū)序列。根據(jù)這些序列設計引物及探針，利用實時熒光PCR法檢測樣品中 的馬鹿茸成分。本發(fā)明的寡核苷酸引物對和探針是根據(jù)不同鹿科物種的線粒體DNAD-環(huán)區(qū)具有 差異性的特點而設計的。在一個實施方案中，所述引物對由上游引物和下游引物組成， 所述上游引物為 Marlu-F :AACACGTGATATAACCTTATGCGC(SEQ ID No. 1)，所述下游引物為 Marlu-R :TATGTCCTATACACTAACTCATGTGC (SEQ ID No. 2)；所述探針為 Marlu-P :TGTGCTAGAA CACGCATGTATAACAGCAC (SEQ ID No. 3)，在探針的3，端連接有一個熒光淬滅基團BHQ1，5，端 連接有一個熒光報告基團FAM。使用本發(fā)明的引物對和探針的組合，在樣品量極少的情況 下，相對于其他弓I物對仍能特異、靈敏地擴增出目的片段。根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，本發(fā)明提供鑒別馬鹿茸真?zhèn)蔚膶崟r熒光PCR檢測 方法，所述方法包括使用針對馬鹿茸的特異性寡核苷酸引物對和探針，所述引物對是根據(jù) 不同鹿科物種的線粒體DNA D-環(huán)區(qū)序列具有差異性的特點而設計的。在一個實施方案中， 在本發(fā)明的馬鹿茸真?zhèn)舞b別的實時熒光PCR檢測方法中，所使用的特異性寡核苷酸引物對 由上游引物和下游引物組成，所述上游引物的堿基序列為SEQ ID No. 1，所述下游引物的堿 基序列為SEQ ID No. 2 ；所述探針的堿基序列為SEQ ID No. 3，在探針的3’端連接有一個熒 光淬滅基團BHQ1，5’端連接有一個熒光報告基團FAM。本發(fā)明的發(fā)明人通過大量的篩選工 作確定了本發(fā)明的特異性寡核苷酸引物對和探針，并建立了穩(wěn)定的PCR體系，從而特異且 靈敏地鑒別馬鹿茸的真?zhèn)巍Ｔ谝粋€實施方案中，本發(fā)明的馬鹿茸實時熒光PCR檢測方法還進一步包括提取鹿 茸樣品總DNA的步驟。在一個實施方案中，在所述DNA提取步驟中，通過檢測鹿科動物線粒 體DNA D-環(huán)區(qū)序列，來測試樣品總DNA的提取質量。在一個優(yōu)選的實施方案中，檢測線粒 體DNA D-環(huán)區(qū)序列的通用引物對由上游引物和下游引物組成，所述上游引物的堿基序列為 Luke-F :CATACGCAATYCTACGATCAATTCC(SEQ ID No. 4)，所述下游引物的堿基序列為 Luke-R GCTACTARGATTCAGAATAGGCATTG (SEQ ID No. 5)；所述探針的堿基序列為 Luke-P :TGGTCGGAAT ATYATGCTGCGTTGTTTGG(SEQ ID No. 6)，在探針的3，端連接有一個熒光淬滅基團BHQ2，5，端 連接有一個熒光報告基團TAMRA。所述PCR擴增條件是95°C，IOmin ；95°C 15s ；60°C，Imin, 40個循環(huán)。根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，本發(fā)明提供用于快速鑒別馬鹿茸真?zhèn)蔚脑噭┖校?所述試劑盒包括本發(fā)明的用于實時熒光PCR方法鑒別馬鹿茸真?zhèn)蔚奶禺愋怨押塑账嵋?對以及探針和使用說明書。在本發(fā)明的試劑盒的優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的特異性寡核苷 酸引物對是根據(jù)不同鹿科物種的線粒體DNA D-環(huán)區(qū)序列具有差異性的特點而設計的。在一 個優(yōu)選的實施方案中，所述試劑盒中包含的特異性寡核苷酸引物對由上游引物和下游引物組成，所述上游引物的堿基序列為SEQ ID No. 1，所述下游引物的堿基序列為SEQ ID No. 2 ； 所述試劑盒中包含的探針的堿基序列為SEQ ID No. 3，在探針的3’端連接有一個熒光淬滅 基團BHQ1，5’端連接有一個熒光報告基團FAM。在優(yōu)選的實施方案中，所述試劑盒還包括 用于樣品DNA提取的試劑和用于PCR反應的試劑。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述試劑盒 的使用說明書中包括對用于快速鑒別馬鹿茸真?zhèn)蔚腜CR擴增的條件的描述。在一個優(yōu)選的 實施方案中，所述試劑盒的說明書中給出的PCR擴增條件是95°C，IOmin ；95°C 15s ；60°C, lmin，40個循環(huán)。根據(jù)本發(fā)明的再一個實施方案，本發(fā)明提供本發(fā)明的特異性寡核苷酸引物對和探 針在鑒別馬鹿茸真?zhèn)沃械膽?。在根?jù)本發(fā)明的應用的優(yōu)選實施方案中，所述特異性寡核 苷酸引物對由上游引物和下游引物組成，所述上游引物的堿基序列為SEQ ID No. 1，所述下 游引物的堿基序列為SEQ IDNo. 2 ；所述探針的堿基序列為SEQ ID No. 3，在探針的3’端連 接有一個熒光淬滅基團BHQ1，5’端連接有一個熒光報告基團FAM。在另一個實施方案中，本 發(fā)明還提供本發(fā)明的試劑盒在鑒別馬鹿茸真?zhèn)沃械膽?。?yōu)選地，在本發(fā)明的上述應用中， 所述試劑盒包括本發(fā)明的特異性寡核苷酸引物對和探針。本發(fā)明以馬鹿茸的DNA為檢測基礎，根據(jù)不同鹿科物種中線粒體DNAD-環(huán)區(qū)序列 具有差異性的特點，克隆了馬鹿線粒體DNA D-環(huán)區(qū)序列，根據(jù)這些序列設計引物及探針，利 用實時熒光PCR法鑒別馬鹿茸的真?zhèn)?。實時熒光定量PCR即在常規(guī)PCR方法的基礎上，加入熒光標記的探針或者熒光染 料，隨著PCR產物的積累，探針或染料發(fā)出的熒光信號增強，而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光 信號，即每產生一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產物形 成完全同步。因此可以實時監(jiān)控整個PCR反應過程，并最終檢測出待測樣品的初始拷貝數(shù)， 從而可檢測待測馬鹿茸成分。本發(fā)明的實時熒光PCR檢測方法采用完全閉管檢測，無需PCR后處理，避免了交叉 污染和假陽性。本發(fā)明的方法巧妙地運用了 PCR技術的DNA高效擴增、核酸雜交的特異性和 熒光檢測技術的快速和敏感性，具有操作簡單、省時省力、結果可靠和準確靈敏等優(yōu)點。使 用本發(fā)明的實時熒光PCR檢測方法，其簡單、快速、特異且靈敏的特點適合用于國內外市場 上馬鹿茸成分真?zhèn)蔚蔫b別。


圖1是顯示待測樣品DNA提取效果的實時熒光PCR結果，其中使用鹿科動物通用 引物對SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5及探針SEQ ID No. 6檢測，其中熒光曲線的樣品依次 為1.梅花鹿(1) ；2.梅花鹿⑵；3.梅花鹿(3) ；4.梅花鹿(4) ；5.梅花鹿(5) ；6.梅花鹿 (6) ；7.梅花鹿(7) ；8.梅花鹿(8) ；9.梅花鹿(9) ；10.梅花鹿(10) ；11.梅花鹿(11) ；12.梅 花鹿(12) ；13.梅花鹿(13) ； 14.梅花鹿(14) ；15.梅花鹿(15) ；16.梅花鹿(16) ；17.梅花 鹿(17) ；18.梅花鹿(18) ；19.梅花鹿(19) ；20.梅花鹿(20) ；21.梅花鹿(21) ；22.梅花鹿 (22) ；23.梅花鹿(23) ；24.馬鹿(1) ；25.馬鹿(2) ；26.馬鹿(3) ；27.馬鹿(4) ；28.馬鹿 (5) ；29.馬鹿(6) ；30.馬鹿(7) ；31.黃占鹿(1) ；32.黃占鹿(2) ；33.空白對照(ddH20)。圖2是顯示實時熒光PCR特異性鑒別馬鹿茸的結果，其中使用特異性寡核苷酸引 物對SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2及探針SEQ ID No. 3檢測，其中熒光曲線的樣品依次為1.馬鹿(1) ；2.馬鹿(2) ；3.馬鹿(3) ；4.馬鹿(4) ；5.馬鹿(5) ；6.馬鹿(6) ；7.馬鹿(7)； 8.梅花鹿(1) ；9.梅花鹿(2) ； 10.梅花鹿(3) ； 11.梅花鹿(4) ； 12.梅花鹿(5) ；13.梅花鹿 (6) ； 14.梅花鹿(7) ；15.梅花鹿(8) ；16.梅花鹿(9) ；17.梅花鹿(10) ；18.梅花鹿(11)； 19.梅花鹿(12) ；20.梅花鹿(13) ；21.梅花鹿(14) ；22.梅花鹿(15) ；23.梅花鹿(16)； 24.梅花鹿(17) ；25.梅花鹿(18) ；26.梅花鹿(19) ；27.梅花鹿(20) ；28.梅花鹿(21)； 29.梅花鹿(22) ；30.梅花鹿(23) ；31.點鹿(1) ；32.點鹿⑵；33.空白對照(ddH20)。圖3是以馬鹿茸為例，鑒別馬鹿茸的特異性引物和探針組合的靈敏度的結果，其 中1-7為進行實時熒光PCR擴增的DNA溶液的濃度，依次為IOng/μ L、lng/μ L、100pg/μ L、 10pg/yLUpg/yL,0. lpg/μ L以及空白對照，重復3次。圖4是以馬鹿茸、梅花鹿茸為例，確定馬鹿茸特異性引物和探針組合的相對檢測 限，其中1-5為用梅花鹿茸DNA將馬鹿茸DNA以10倍稀釋，使其PCR反應體系中馬鹿茸DNA 含量分別為10ng、lng、lOOpg、10pg、lpg,重復三次，然后進行檢測的結果。圖5是市售鹿茸樣品檢測結果，其中熒光曲線1為馬鹿陽性對照品、熒光曲線2-21 依次為市售馬鹿茸樣品(1)_(20)、熒光曲線22-38依次為市售馬鹿茸樣品(1)_(16)及空白 對照(無菌水)。
具體實施例方式通過實施例的方式對本發(fā)明作進一步的說明，但是本發(fā)明并不僅僅局限于以下實 施例。實施例1本發(fā)明的發(fā)明人首次通過PCR克隆并測序了馬鹿的線粒體DNA D-環(huán)區(qū)序列。本實施例為通過PCR克隆測序獲得的馬鹿線粒體DNA D-環(huán)區(qū)序列。根據(jù)線粒體DNA D-環(huán)區(qū)序列在不同鹿科動物中具有差異性的特點，設計上下游引 物擴增馬鹿線粒體DNA D-環(huán)區(qū)序列。按照Wizard GelExtraction Kit (Promega，美國)的 操作說明對馬鹿PCR產物進行純化、回收。按TaKaRa pMD19_T Vector試劑盒(TaKaRa，日 本)的說明書將純化產物與PMD19-T Vector連接，連接體系10 μ L，其反應組分為pMD19_T Vector 1 μ L、PCR 產物 2 μ L、ddH20 2 μ L、Solution I 5 μ L，同時設置陽性和陰性對照。 將連接體系置于室溫(22-37°C)反應30min，反應結束后，立即置于冰上。加連接產物于 50 μ LTOP感受態(tài)細胞中，輕彈混勻，冰浴30min，42°C準確熱激90s，立即置于冰上2min，然 后加入800 μ L已滅過菌的腦心浸液，37°C、200r/min振蕩培養(yǎng)Ih0 5000r/min低速離心 Imin,棄600 μ L上清，將沉淀混勻，取100 μ L混合液涂于Amp+、X-Gal和IPTG處理的營養(yǎng) 瓊脂平板上，37°C過夜培養(yǎng)后置于4°C冰箱中4h。挑取單菌落白斑，在含有終濃度200 μ g/ mL的Amp的腦心浸液中在37°C、200r/min振蕩過夜培養(yǎng)。(1)陽性克隆鑒定挑取單個白色克隆，進行菌落PCR反應，體系為25yL，其組份 為反應IOXBuffer 2. 5μ L.dNTPs 1 μ L、上下游引物各0. 5 μ L、Taq酶0. 2 μ L，挑取單菌 落作為模板，加水補至25 μ L。反應程序為94°C 5min，94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin，40個 循環(huán)。PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定。(2)測序確定陽性克隆后，挑取該菌落，在含有終濃度200 μ g/mL Amp的5 μ L腦 心浸液中在37°C、200r/min振蕩過夜培養(yǎng)。取ImL菌液送生物公司進行測序鑒定。
PCR克隆測序得到的馬鹿的線粒體DNA D-環(huán)區(qū)序列如下
AGACTCAAGGAAGAAGCCATAGCCCCACTATCAACACCCA
AAGCTGAAGTTCTATTTAAACTATTCCCTGACGCTTATTA
ATATAGTTCCATAAAAATCAAGAACTTTATCAGTATTAAA
TTTCCAAAAAATCT-AATATTTTAATACAGCTTTCTACTC
AACATCCAATTTACATTTTACGTCCTACTAATTACACAGC
AAAACACGTGATATAACCTTATGCGCTTGTAGTACATAAA
ATCAATGTGCTAGAACACGCATGTATAACAGCACATGAG
TTAGTGTATAGGACATATTATGTATAATAGTACATAAATC
AATGTATTAGGACATATTATGTATAATAGTACATTATATT
ATATGCCCCATGCATAAACCATGGTTACA(SEQ ID No. 7)。
實施例2
本實施例為通過使用通用引物對及探針測試樣品總DNA的提取質量。
通過檢測線粒體DNA D-環(huán)區(qū)序列，可以測試樣品總DNA的提取質量。Taqman熒光探針法= TaqMan技術是一種對單售^ PCR產物進行實時熒光定量檢測的技術，在普通PCR擴增系統(tǒng)中，加入一個與靶基因序列特異互補的雙熒光標記探針，利用熒光信號積累實時監(jiān)
測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析。定量步驟①確定CT值(C 表示循環(huán)數(shù)(Cycle)，T表示熒光域值(Threshold)，即每個反應管內的熒光信號到達設定 的域值時所經歷的循環(huán)數(shù)；②利用標準曲線對未知樣品進行定量測定。獲得未知樣品的CT 值后，從標準曲線計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。每個模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的 對數(shù)存在線性關系，即起始拷貝數(shù)越多，CT值越小。反應體系為Mastermix 12.5yL;探 針(10 μ Μ) 0. 5 μ L ；上、下游引物(10 μ Μ)各0. 5 μ L ；模板DNA 5 μ L ；力口 ddH20至總體積為 25 μ L0 反應程序為 95°C IOmin ；95°C 15s ；60°C lmin，40 個循環(huán)。本實施例中所使用的用于檢測馬鹿茸總DNA提取質量的通用引物對由上游引物 和下游引物組成，所述上游引物的堿基序列為SEQ ID No. 4，所述下游引物的堿基序列為 SEQ ID No. 5 ；所使用的探針的堿基序列為SEQ IDNo. 6，在探針的3’端連接有一個熒光淬 滅基團BHQ2，5’端連接有一個熒光報告基團TAMRA。在本實施例中，檢測了 7份馬鹿樣本、23份梅花鹿樣本、2份點鹿樣本。所使用的檢測主要儀器微量移液器(10μ LUOOy LUOOOy L, Eppendorf)、熒光定量 PCR 儀(ABI 7700 Applied Biosystems, USA)、高速臺式離心機(Picol7 Thermo)、高速粉碎機(IKA-ffEARKE GERMANY)、核酸蛋白分析儀(DYY-6C北京六一儀器廠)等檢測主要試劑氯仿、異丙醇分別購于北京六合通公司；CTAB裂解液(20g/L CTAB, 1. 4mol/L NaCl，0. lmol/L Tris、0. 02mol/L Na2-EDTA)、CTAB 沉淀液(5g/LCTAB，0. 04mol/L NaCl)、 1. 2mol/L NaCl 均為本實驗自行配制；Fast Start Universal Probe MasterMix (Rox)購于 羅氏公司；引物及探針由上海奧科生物科技有限公司合成等。檢測主要步驟IDNA 提取
待測鹿茸樣品為7份馬鹿茸、23份梅花鹿茸、2份點鹿茸。稱取0. Ig鹿茸粉末至一潔凈2. OmL離心管中，加入1. 5mLCTAB裂解液，65°C 2h，間期不斷混勻幾次；8000rpm 15min，取ImL上清液至1只潔凈2. OmL離心管中，加入700 μ L 氯仿，劇烈混勻30s, 14500rpm IOmin,分別取650 μ L上清液至潔凈2. OmL離心管中，加入 1300 μ L CTAB沉淀液，劇烈混勻30s，室溫靜置Ih ； 14500rpm 20min，棄上清液，加入350 μ L 1. 2Μ NaCl，劇烈振蕩30s,再加入350 μ L氯仿，劇烈混勻30s, 14500rpm IOmin ；分別取上 清液320 μ L，加入0. 8倍體積異丙醇，混勻后，-200C lh, 14500rpm 20min,棄上清液，加入 500 μ L70%乙醇，混勻后，14500rpm 20min,棄上清液，晾至風干，加入100 μ L ddH20溶解， 4°C儲存?zhèn)溆谩?實時熒光PCR檢測所用引物和探針引物序列為SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5，探針序列為SEQ ID No. 6，3，端連接有 一個熒光淬滅基團BHQ2，5’端連接有一個熒光報告基團TAMRA。3實時熒光PCR反應體系Fast Start Universal Probe MasterMix(Rox)12. 5 μ L探針(10μΜ)0·5μ L上游引物(10μΜ)0·5μ L下游引物(10μΜ)0·5μ L模板 DNA 5μ L力卩ddH20至總體積為25 μ L注每次PCR檢測均設立相應的空白對照(用配制反應體系的超純水代替DNA模 板，檢測試劑是否受到污染)；4實時熒光PCR反應參數(shù)95 "C IOmin95 "C 15s60 °C Imin40個循環(huán)。注不同儀器應將PCR各試劑及反應參數(shù)做適當調整。如圖1所示，用鹿科動物通用引物擴增待測樣品的DNA時均能在基線以上出現(xiàn)熒 光擴增曲線，表明所有待測樣品DNA提取成功。實施例3本實施例通過如下試驗對馬鹿的引物對和探針進行了特異性和靈敏度驗證。通過檢測線粒體DNA D-環(huán)區(qū)序列，可以確定馬鹿引物和探針組合的特異性和檢 IlJ靈敏度。反應體系為Fast Start Universal Probe MasterMix(Rox) 12. 5 μ L ；探針 (10μΜ)0·5μ ;上、下游引物(10 μ Μ)各0.5yL;模板DNA 5 μ L ；加ddH20至總體積為 25 μ L0 反應程序為 95°C IOmin ；95°C 15s ；60°C lmin，40 個循環(huán)。所使用的鑒別馬鹿茸真?zhèn)蔚囊锛疤结樞蛄袨橐镄蛄袨镾EQ ID No. 1和SEQ ID No. 2，探針序列為SEQ ID No. 3，3’端連接有一個熒光淬滅基團BHQ1，5’端連接有一個 熒光報告基團FAM。所使用的檢測主要儀器
微量移液器(10μ LUOOy LUOOOy L, Eppendorf)、熒光定量 PCR 儀(ABI 7700 Applied Biosystems, USA))、高速臺式離心機(Picol7 Thermo)、高速粉碎機(IKA-ffEARKE GERMANY)、核酸蛋白分析儀(DYY-6C北京六一儀器廠)等
檢測主要試劑氯仿、異丙醇分別購于北京六合通公司；CTAB裂解液(20g/L CTAB, 1. 4mol/L NaCl，0. lmol/L Tris、0. 02mol/L Na2-EDTA)、CTAB 沉淀液(5g/LCTAB，0. 04mol/L NaCl)、 1. 2mol/L NaCl 均為本實驗自行配制；Fast Start Universal Probe MasterMix (Rox)購于 羅氏公司；引物及探針由上海奧科生物科技有限公司合成等。檢測主要步驟IDNA 提取檢測樣本(1) 7份馬鹿茸、23份梅花鹿茸、2份點鹿茸用于特異性分析；(2)以馬 鹿為例，將提取的DNA溶液用無菌水分別稀釋為IOng/ μ L、lng/ μ L、IOOpg/ μ L、IOpg/ μ L、 lpg/yL、0. lpg/y L的濃度，用于分析引物和探針組合的絕對檢測限；(3)以馬鹿、梅花鹿 為例，用梅花鹿DNA將馬鹿DNA以10倍稀釋，使其PCR反應體系中馬鹿DNA含量分別為 IOng,lng、100pg、10pg、lpg，以確定馬鹿特異性引物和探針組合的相對檢測限。稱取0. Ig樣品粉末至一潔凈2. OmL離心管中，加入1. 5mLCTAB裂解液，65°C 2h，間 期不斷混勻幾次；8000rpm 15min，取ImL上清液至1只潔凈2. OmL離心管中，加入700 μ L 氯仿，劇烈混勻30s, 14500rpm IOmin,分別取650 μ L上清液至潔凈2. OmL離心管中，加入 1300 μ L CTAB沉淀液，劇烈混勻30s，室溫靜置Ih ； 14500rpm 20min，棄上清液，加入350 μ L 1. 2Μ NaCl，劇烈振蕩30s,再加入350 μ L氯仿，劇烈混勻30s, 14500rpm IOmin ；分別取上 清液320 μ L，加入0. 8倍體積異丙醇，混勻后，-200C lh, 14500rpm 20min,棄上清液，加入 500 μ L70%乙醇，混勻后，14500rpm 20min,棄上清液，晾至風干，加入100 μ L ddH20溶解， 4°C儲存?zhèn)溆谩?實時熒光PCR檢測所用引物和探針引物序列為 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 ；探針序列為SEQ ID No. 3,3'端連接有一個熒光淬滅基團BHQ1，5’端連接有一個 熒光報告基團FAM。3實時熒光PCR反應體系Fast Start Universal Probe MasterMix(Rox)12. 5 μ L探針(10μΜ)0·5μ L上游引物(10μΜ)0·5μ L下游引物(10μΜ)0·5μ L模板 DNA 5μ L力卩ddH20至總體積為25 μ L注每次PCR檢測均設立相應的空白對照(用配制反應體系的超純水代替DNA模 板，檢測試劑是否受到污染)；4實時熒光PCR反應參數(shù)95 "C IOmin95 "C 15s
60 °C Imin40個循環(huán)。注不同儀器應將PCR各試劑及反應參數(shù)做適當調整。
如圖2所示，利用實時熒光PCR特異性鑒別馬鹿的線粒體DNA D-環(huán)區(qū)序列時， 7種馬鹿樣品等均出現(xiàn)典型的擴增曲線，而其它樣品23份梅花鹿、2份點鹿等及空白對照 (ddH20)均未出現(xiàn)擴增曲線，充分說明本實驗設計的引物探針對馬鹿樣品表現(xiàn)較好的特異性。為確定馬鹿特異性引物和探針組合的絕對檢測限，以馬鹿為例，將提取的DNA溶 液用無菌水分別稀釋為 IOng/ μ L、lng/ μ L、IOOpg/ μ L、IOpg/ μ L、lpg/ μ L、0. Ipg/ μ L 的 濃度，分別按上述條件進行實時熒光PCR擴增，結果如圖3所示。馬鹿DNA濃度為IOng/ μ L、lng/ μ L、IOOpg/ μ L、IOpg/ μ L、lpg/ μ L時有特異性擴增曲線，而濃度降至lpg/ μ L以 下時，無特異性擴增曲線出現(xiàn)。實驗結果表明建立的實時熒光PCR檢測方法能夠檢出馬鹿 成分的含量為lpg/yL。以馬鹿、梅花鹿為例，用梅花鹿DNA將馬鹿DNA以10倍稀釋，使其PCR反應體系中 馬鹿DNA含量分別為10ng、lng、100pg、10pg、lpg,分別按上述條件進行實時熒光PCR擴增， 以確定馬鹿特異性引物和探針組合的相對檢測限(結果見圖4)。實驗結果說明該方法檢測 馬鹿成分的相對檢測限為10pg。實施例4本發(fā)明的發(fā)明人通過如下試驗對市售鹿茸樣品進行了驗證。選取36種鹿茸樣品(樣品由本實驗室提供)，其中20種馬鹿茸樣品、16份梅花鹿 茸樣品，進行實時熒光PCR反應，以確定所建立的實時熒光PCR方法是否具有可行性。如圖5所示，利用實時熒光PCR檢測線粒體DNA D-環(huán)區(qū)序列時，馬鹿陽性對照品、 20份市售馬鹿茸樣品均在基線以上具有典型的熒光擴增曲線，而其他16份梅花鹿茸樣品 及空白對照擴增曲線均在基線位置，表明該方法能有效檢測出馬鹿茸成分。雖然已經對本發(fā)明的具體實施方案進行了描述，但是本領域技術人員應認識到， 在不偏離本發(fā)明的范圍或精神的前提下可以對本發(fā)明進行多種改變與修飾。因而，本發(fā)明 意欲涵蓋落在權利要求書及其同等物范圍內的所有這些改變與修飾。
權利要求
核酸，其堿基序列如SEQ ID No.7所示。
2.用于實時熒光PCR方法鑒別馬鹿茸真?zhèn)蔚奶禺愋院塑账嵋飳疤结?，所述引物?和探針基于權利要求1所述的核酸設計，其中所述引物對由上游引物和下游引物組成，所 述上游引物的堿基序列為SEQ ID No. 1，所述下游引物的堿基序列為SEQ ID No. 2，所述探 針的堿基序列為SEQ ID No. 3，在探針的3’端連接有一個熒光淬滅基團BHQ1，5’端連接有 一個熒光報告基團FAM。
3.用于實時熒光PCR方法鑒別馬鹿茸真?zhèn)蔚脑噭┖?，所述試劑盒包括根?jù)權利要求2 所述的特異性寡核苷酸引物對及探針。
4.根據(jù)權利要求3所述的試劑盒，所述試劑盒進一步包含另外的通用引物對和探針， 所述另外的通用引物對由堿基序列為SEQ ID No. 4的上游引物和堿基序列為SEQ ID No. 5 的下游引物組成，所述探針的堿基序列為SEQ ID No. 6，在探針的3’端連接有一個熒光淬滅 基團BHQ2，5’端連接有一個熒光報告基團TAMRA。
5.馬鹿茸真?zhèn)舞b別的實時熒光PCR檢測方法，其中所述實時熒光PCR方法為Taqman熒 光探針法，所述方法包括使用權利要求2所述的特異性寡核苷酸引物對及探針或根據(jù)權利 要求3所述的試劑盒。
6.根據(jù)權利要求5所述的實時熒光PCR檢測方法，還包括提取鹿茸樣品總DNA的步驟。
7.根據(jù)權利要求6所述的實時熒光PCR檢測方法，通過使用通用引物對及探針檢測樣 品DNA的提取質量，所述通用引物對由堿基序列為SEQ ID No. 4的上游引物和堿基序列為 SEQ ID No. 5的下游引物組成，所述探針的堿基序列為SEQ ID No. 6，在探針的3’端連接有 一個熒光淬滅基團BHQ2，5’端連接有一個熒光報告基團TAMRA。
8.權利要求1所述的核酸在鑒別馬鹿茸真?zhèn)沃械膽谩?br> 9.權利要求2所述的特異性寡核苷酸引物對及探針在鑒別馬鹿茸真?zhèn)沃械膽谩?br> 10.權利要求3或4所述的試劑盒在鑒別馬鹿茸真?zhèn)沃械膽谩?br> 全文摘要
本發(fā)明涉及用于馬鹿茸真?zhèn)舞b別的特異性寡核苷酸引物及探針。本發(fā)明還涉及用于馬鹿茸真?zhèn)舞b別的實時熒光PCR檢測方法，所述方法包括使用本發(fā)明的特異性寡核苷酸引物及探針。本發(fā)明還涉及用于馬鹿茸真?zhèn)舞b別的PCR檢測試劑盒，所述試劑盒包括本發(fā)明的特異性寡核苷酸引物和探針。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的特異性寡核苷酸引物及探針在鑒別馬鹿茸真?zhèn)沃械膽?。使用本發(fā)明的實時熒光PCR檢測方法，能夠簡單、快速、特異且靈敏地鑒別馬鹿茸的真?zhèn)巍?br> 文檔編號C12N15/11GK101974522SQ20101055556
公開日2011年2月16日 申請日期2010年11月23日 優(yōu)先權日2010年11月23日
發(fā)明者吳亞君, 鄧婷婷, 陳穎, 韓建勛, 黃文勝 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院