用于檢測aldh2基因的引物、探針及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及檢測人血液樣本中ALDH2基因多態(tài)性的引物、探針及其檢測方法，屬 于分子生物學領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】：
[0002] 乙酸脫氫酶（aldehyde dehydrogenase gene, ALDH)是一組 NAD (P) + 依賴性酶，廣 泛參與由體內(nèi)乙醇、氨基酸、生物胺、維生素、類膽固醇及脂質(zhì)的代謝過程中產(chǎn)生的醛類物 質(zhì)的氧化反應，成為相應的羧酸，對減輕醛類物質(zhì)對機體的毒性作用具有重要意義。ALDH有 19種同工酶，常見的有ALDH1~ALDH4,其中以位于線粒體內(nèi)的ALDH2活性最強，在清除體 內(nèi)醛類物質(zhì)中起主要作用。ALDH2的活性變化與ALDH2基因多態(tài)性有關(guān)，突變的等位基因形 成人群中三種基因型：具有正常催化活性的野生純合子型ALDH2*1/*1 ;催化活性下降的雜 合子型ALDH2*l/*2 ;催化活性喪失的突變純合子型ALDH2*2/*2。在亞洲人群中，ALDH2*2 是頻率最高且最重要的突變型，其中研究顯示中國人ALDH2*2的頻率達18%。
[0003] 研究表明，ALDH2基因多態(tài)性與硝酸甘油療效、酒精代謝解毒能力和多種疾病的發(fā) 生均有影響。
[0004] ALDH2基因多態(tài)性與硝酸甘油的用藥有關(guān)：舌下含服硝酸甘油片是抗冠心病心絞 痛急性發(fā)作的常規(guī)首選方法，但有些患者服用后并無療效。ALDH2酶是硝酸甘油有效代謝 物N0形成的關(guān)鍵，當ALDH2基因在rs671位點突變后，酶活性降低，硝酸甘油在體內(nèi)生物轉(zhuǎn) 化過程受阻，有效活性產(chǎn)物N0生成減少，進而導致硝酸甘油治療心絞痛效果降低。因此， ALDH2基因多態(tài)性檢測有助于臨床上指導硝酸甘油的合理利用，對實現(xiàn)個體化治療具有重 要意義。
[0005] ALDH2基因多態(tài)性與酒精性肝病的關(guān)系：ALDH2 (Glu504Lys)基因突變使乙醛脫氫 酶活性也降低10倍以上，使酒精在體內(nèi)從乙醇一乙醛一乙酸一水、二氧化碳的代謝過程受 阻，大量乙醛滯留在體內(nèi)。加之高頻飲酒易引發(fā)酒精依賴現(xiàn)象，進一步加重了肝臟的受累程 度。長期大量飲酒會導致脂肪肝甚至酒精性肝炎、肝纖維化和肝硬化，嚴重危害人民健康。 對ALDH2基因多態(tài)性的檢測將有助于揭示個體酒精代謝能力，指導檢測者正確飲酒，預防 酒精性肝病。
[0006] ALDH2基因多態(tài)性與食道癌和口腔癌等的關(guān)系：除了損傷肝臟導致脂肪肝、肝硬 化，甚至肝癌，還與增加食道癌、咽癌和胃癌、結(jié)腸癌、肺癌等風險相關(guān)。研究顯示，攜帶 ALDH2突變等位基因的亞洲人因酗酒引發(fā)消化道癌癥的幾率明顯較大：胃癌、結(jié)腸癌、肺癌 為3~10倍；咽癌、食道癌為11~115倍；而食道癌、咽癌和肺癌同時發(fā)病的幾率增加了 50倍。ALDH2基因的檢測將為食道癌、咽癌和胃癌、結(jié)腸癌、肺癌等相關(guān)尚風險疾病的提不 提供有效的參考依據(jù)。
[0007] 目前市場上常用的ALDH2基因檢測方法有基因芯片法和PCR-RFLP，基因芯片法是 目前市場上應用最多的一種方法，最大的優(yōu)點是高通量，但也存在著不足之處：技術(shù)成本昂 貴、操作復雜、檢測靈敏度較低及重復性差等。PCR-限制性片段長度多態(tài)性技（PCR-RFLP) 操作繁瑣、耗時多、結(jié)果可信度低等缺點，未能普及。因此，本領(lǐng)域亟需一種快速、高效、準 確、便捷、靈敏度高且結(jié)果準確性好的ALDH2基因型檢測試劑。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0008] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)檢測能力有限，現(xiàn)提供一種多色熒光PCR檢測ALDH2基因的方 法。
[0009] 本發(fā)明是采用多色熒光PCR檢測ALDH2基因的方法：利用雜合子型ALDH2*l/*2、 純合子型ALDH2*2/*2和內(nèi)參基因0 -珠蛋白的引物探針配制PCR反應液，加入人全血樣本 DNA，通過熒光PCR儀檢測ALDH2基因的多態(tài)性。
[0010] 以上所述的引物探針序列如下：
[0011] ALDH2-F : 5，-CCAACAGGCCCTGAGCC-3 '
[0012] ALDH2-R : 5 ' -CACCCTTTGGTGGCTACAAGATG-3 '
[0013] HBB-F1 :5' -TGAAGGCTCATGGCAAGAAAGT-3'
[0014] HBB-F2 :5, -TTGTCACAGTGCAGCTCACTCA-3'
[0015] P-ff ：5, -FAM-ACAGTTTTCACTTCAGTGTATGCCTGCAG-BHQl-3 ,
[0016] P-M : 5 ' -HEX-AGTTTTCACTTIAGTGTATGCCTGCAG-BHQ1-3 '
[0017] HBB-P : 5 ' -R0X-ACAACCTCAAGGGCACCTTTGCCAC-BHQ2-3 '
[0018] 本發(fā)明的主要原理：本發(fā)明基于焚光PCR方法結(jié)合Taqman多色焚光探針技 術(shù)，采用三色熒光PCR和dUTP/UNG防污染措施在全封閉的擴增體系，以ALDH2*l/*2和 ALDH2*2/*2作為檢測目標，同時針對人的珠蛋白基因（HBB)保守區(qū)域設計特異性引物 和探針作為內(nèi)參對樣本的采集、DNA的提取及擴增進行監(jiān)控。將同一樣本進行1管PCR擴 增即可同時檢測出ALDH2基因的多態(tài)性，為硝酸甘油的用藥、飲酒指導及相關(guān)高風險疾病 的提不提供有效的參考依據(jù)。
[0019] 本方法與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)勢：
[0020] (1)檢測特異性探針對靶基因進行識別，準確性高。同時，靶序列由引物和探針雙 重控制，特異性好、假陽性低。
[0021] (2)靈敏度為0.01%，8卩10000個細胞中有一個含八0)112基因八0)112*1/*2多態(tài)性、 ALDH2基因ALDH2*2/*2多態(tài)性就可以被檢測出。
[0022] (3)簡便安全：操作簡單、安全、能防止污染。擴增和檢測可以在同一管內(nèi)檢測，不 需要開蓋，不易被污染；同時擴增和檢測一步完成，不需要后期處理。
[0023] (4)全程監(jiān)控：本發(fā)明實施例提供的試劑盒引入了內(nèi)部陽性控制質(zhì)量控制體系， 對檢測過程進行全程質(zhì)量監(jiān)控，有效避免假陽性或者假陰性。
[0024] (5)快速：速度快、可在100分鐘內(nèi)完成。
【附圖說明】：
[0025] 圖1顯示ALDH2基因ALDH2*l/*2多態(tài)性在PCR反應液中的擴增曲線；
[0026] 圖2顯示ALDH2基因ALDH2*2/*2多態(tài)性在PCR反應液中的擴增曲線；
[0027] 圖3顯示ALDH2基因無ALDH2*l/*2多態(tài)性和ALDH2*2/*2多態(tài)性時，在PCR反應 液中的擴增曲線。
【具體實施方式】：
[0028] 附圖1顯示ALDH2基因ALDH2*l/*2多態(tài)性在PCR反應液中的擴增曲線，其中，橫 坐標為PCR循環(huán)數(shù)，縱坐標為熒光值；
[0029] 附圖2顯示ALDH2基因ALDH2*2/*2多態(tài)性在PCR反應液中的擴增曲線，其中，橫 坐標為PCR循環(huán)數(shù)，縱坐標為熒光值；
[0030] 附圖3顯示ALDH2基因無ALDH2*l/*2多態(tài)性和ALDH2*2/*2多態(tài)性時，在PCR反 應液中的擴增曲線，其中，橫坐標為PCR循環(huán)數(shù)，縱坐標為熒光值
[0031] 下面結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進一步說明，但發(fā)明的保護范圍并不限于此。
[0032] (1)引物探針的設計
[0033] 根據(jù)GenBank所提供包含線粒體乙醛脫氫酶-2多態(tài)性位點上下游各lOOObp的 DNA序列進行分析，利用分子生物學軟