專利名稱：抗人ppGalNAc-T2單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種抗人ppfeilNAC-T2單克隆抗體及其制 備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
多肽N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶(ppGalNAc-T)家族是催化蛋白質(zhì)肽鏈上絲氨酸 或蘇氨酸Ger/Thr)殘基以合成0-糖鏈的起始酶。迄今為止，在哺乳動(dòng)物中該酶家族至 少有18個(gè)成員被克隆表達(dá)鑒定。通過(guò)基因數(shù)據(jù)庫(kù)比較分析提示該家族有M個(gè)潛在的成 員組成。所有的ppfelNAc-Ts都能夠結(jié)合底物UDP-GalNAc，但它們?cè)诘鞍踪|(zhì)骨架上的催化 位點(diǎn)又有所不同，正是這種不同使得該酶成員眾多，并有著廣泛的組織分布。近年來(lái)研究 表明，ppGalNAc-T家族成員在多種人腫瘤細(xì)胞或組織中存在異常表達(dá)，例如在鱗狀癌變組 織中ppfeilNAcTl表達(dá)異常下降而ppfeilNAc-T2和ppGalNAc_T3表達(dá)升高；在結(jié)腸癌中發(fā) 現(xiàn)了 ppGalNAc-Tl，ppGalNAc_T2，和 ppGalNAc_T3 表達(dá)的異常升高。其中 ppGalNAc_T3 的 異常表達(dá)還在結(jié)腸癌、胃癌、肺癌、胰腺癌、膽囊癌、前列腺癌以及原發(fā)性肝膽管癌中均有報(bào) 道；在乳腺癌及胃癌中發(fā)現(xiàn)PPfelNAc-T6異常表達(dá)；還有研究小組在人胃腸道腫瘤中檢測(cè) 到pp(ialNAC-T12的表達(dá)也發(fā)生了異常改變；重要的是，這些存在于腫瘤中的異常表達(dá)情況 可成為潛在的腫瘤診斷依據(jù)。為了更方便快捷地檢測(cè)ppfeilNAc-T在腫瘤中的異常表達(dá)情況，制備ppfeilNAc-T 抗體顯得尤為重要。ppGalNAc-T2作為的ppfeilNAc-T酶家族的一個(gè)重要成員，是0-糖鏈起 始合成關(guān)鍵酶?，F(xiàn)有技術(shù)中，國(guó)外研究小組制備pp(ialNAC-T2單/多克隆抗體，且用于人腫瘤的 檢測(cè)研究有以下報(bào)道1)如2000年，來(lái)自日本的Takuhiro Kohsaki等人制備了兔抗人 ppGalNAc-T2多克隆抗體用于檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞及組織，發(fā)現(xiàn)ppfeilNAC-T2存在明顯高表達(dá) (參考 J Gastroenterol 2000 ；35 :840-848) ；2)早在 1999 年，丹麥的 Ulla Mandel 研究 小組就成功制備了鼠抗人pp(ialNAC-T2單克隆抗體并命名為UH4 (IgGl)，該研究小組還對(duì) 該抗體作了較為細(xì)致深入的研究(參考GlyC0bi0l0gy，1999，9(l) :43-52)。與多克隆抗體相比，單克隆抗體有高特異性、高效價(jià)等優(yōu)點(diǎn)，更適用于目標(biāo)抗原 的檢測(cè)，上述技術(shù)方案中，丹麥Ulla Mandel小組的制備方案具有以下優(yōu)點(diǎn)1)采用昆蟲(chóng) 細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物作為免疫原，比傳統(tǒng)的原核蛋白抗原或新興的DNA抗原相比，在制備單克隆 抗體上更有優(yōu)勢(shì)；幻在篩選陽(yáng)性克隆時(shí)，選用了三級(jí)篩選，分別是間接免疫酶聯(lián)吸附試驗(yàn) ELISA、免疫熒光流式細(xì)胞分析法和免疫共沉淀法；這更有利于篩選出真正的陽(yáng)性克隆。但他們的方案中同時(shí)存在了不足首先，他們選用了昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Sf9 細(xì)胞)制備免疫原，但存在的一些問(wèn)題如桿狀病毒的基因組學(xué)研究相對(duì)薄弱，有關(guān)病毒晚 期基因的高表達(dá)和調(diào)控機(jī)制等還不十分清楚，表達(dá)產(chǎn)物的純化比較困難，多元表達(dá)等方面 的技術(shù)還不夠成熟等，均有待進(jìn)一步解決；其次，所制備的抗體在ELISA和免疫沉淀中有 著較好的表現(xiàn)，但在免疫印跡WesternBlot實(shí)驗(yàn)中的表現(xiàn)卻不盡人意，這就限制了該抗體的使用，因?yàn)槊庖哂≯E試驗(yàn)是現(xiàn)在最為通用可靠的可定量檢測(cè)目的蛋白表達(dá)情況的一種手 段?；谝陨戏治觯枰苽湟环N高特異性、高效價(jià)的鼠抗人ppfeilNAC-T2單克隆抗 體，使其能夠用于間接免疫酶聯(lián)吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)，免疫印跡(Western-blot)，免疫細(xì)胞熒 光(Immunocytoflurescence)，免疫熒光流式細(xì)胞分析(Flowcytometer Analysis)，免疫組 織化學(xué)(Immunohistochemistry)等多種研究手段，以實(shí)現(xiàn)ppfeilNAc-T2表達(dá)的快速通量檢 測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種人ppfeilNAC-T2的單克隆抗體，利用該單克隆抗體通過(guò)免 疫學(xué)方法檢測(cè)人PpfelNAc-T2基因的蛋白表達(dá)水平；本發(fā)明的另一目的是提供能產(chǎn)生具有 良好識(shí)別PPfelNAc-T2蛋白并能與其進(jìn)行免疫學(xué)反應(yīng)的單克隆抗體分泌型穩(wěn)定雜交瘤細(xì) 胞株，通過(guò)該細(xì)胞株大量生產(chǎn)均質(zhì)的、穩(wěn)定的、多用途的、可用于商業(yè)化的單克隆抗體。為為達(dá)到上述目的，本發(fā)明具體技術(shù)方案是，一種雜交瘤細(xì)胞株，所述雜交瘤細(xì) 胞株的保藏信息為保藏單位中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；地址中國(guó)武漢大學(xué)；保藏日期 2010年11月4日；保藏編號(hào)CCTCC NO :C2010106 ；分類命名雜交瘤細(xì)胞株LW-5F3。上述雜交瘤細(xì)胞株的制備方法包括以下步驟(1)利用ppfeilNAC-T2基因(基因序列號(hào)是NM_004481. 3)原核表達(dá)產(chǎn)物免疫 Balb/C小鼠以獲取能產(chǎn)生針對(duì)該蛋白特異性抗體的致敏B細(xì)胞；(2)獲取融合細(xì)胞生長(zhǎng)克隆從免疫合格小鼠無(wú)菌取其脾細(xì)胞作為抗原致敏的B 細(xì)胞，按常規(guī)方法，將B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0株融合，然后利用常規(guī)的融合細(xì)胞HAT篩 選方法進(jìn)行篩選，進(jìn)而獲取融合細(xì)胞生長(zhǎng)克隆；(3)分泌單克隆抗體融合細(xì)胞克隆的篩選①應(yīng)用雙抗體夾心ELISA或間接ELISA 檢測(cè)策略篩選分泌單克隆抗體融合細(xì)胞克隆是獲取分泌單抗細(xì)胞克隆常規(guī)手段，發(fā)明人選 用了間接ELISA檢測(cè)手段進(jìn)行檢測(cè)；②使用免疫熒光流式細(xì)胞分析加以篩選即以ELISA 檢測(cè)陽(yáng)性的作為候選克隆，再采用免疫熒光流式細(xì)胞分析陽(yáng)性作為關(guān)鍵指標(biāo)以確立其陽(yáng)性 克?。?4)單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的獲得采用雙篩選方法，僅獲得三株合格細(xì)胞克 隆，其中一株細(xì)胞4D3 (進(jìn)行融合細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)共用了 12塊96孔板，這里指的是第4塊板的D 列3行孔中的細(xì)胞)克隆免疫熒光信號(hào)均強(qiáng)于其他二株(11E7和9B12，同樣的方法編號(hào))， 將該克隆細(xì)胞按常規(guī)單細(xì)胞克隆方法進(jìn)行了二輪亞克隆并對(duì)每輪亞克隆進(jìn)行雙篩選直至 所有的亞克隆均呈強(qiáng)雙陽(yáng)性后，從中挑出一株生長(zhǎng)最旺的單細(xì)胞克隆(編號(hào)5F!3)擴(kuò)大培養(yǎng) 并進(jìn)行傳代凍存。將上述技術(shù)方案中生長(zhǎng)最旺的單細(xì)胞克隆(編號(hào)5F!3)送交至武漢大學(xué)的中國(guó)典 型培養(yǎng)物保藏中心保藏。上述技術(shù)方案中，采用步驟(1)的策略是基于以下幾方面考慮首先，原核表達(dá)產(chǎn)物作免疫原其表達(dá)量高(這是真核表達(dá)產(chǎn)物無(wú)法達(dá)到的)，易純 化(通過(guò)蛋白制備電泳的方法可以獲取其純度大于85%純化物，純化周期僅需1天的時(shí)間， 大大減少了該蛋白降解的可能性)。
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其次，該基因原核表達(dá)產(chǎn)物與天然表達(dá)蛋白能有相同的抗原識(shí)別位點(diǎn)完全滿足制 備抗體的要求；再次，用PCR產(chǎn)物直接免疫動(dòng)物屬DNA疫苗的范疇，該技術(shù)到目前為止僅為探索階 段其技術(shù)不成熟，因此不宜采用該策略；最后，選Balb/C小鼠免疫制備檢測(cè)用單克隆抗體是通用策略，我們制備該抗體目 的并不用于抗體的治療故無(wú)需制備人源化的單抗，即便需要亦可在此基礎(chǔ)上再進(jìn)行研究。上述技術(shù)方案中，采用步驟(3)的策略是基于以下幾方面考慮ELISA的優(yōu)點(diǎn)是可進(jìn)行大量樣本檢測(cè)，操作時(shí)間短2 池內(nèi)可出報(bào)告，但缺點(diǎn) 是有一定的非特異性，考慮到ELISA檢測(cè)存在一定非特異性風(fēng)險(xiǎn)，本發(fā)明采用了雙篩選 方法，與常規(guī)單抗篩選方法相比，雙篩選比單篩選提高了篩選的可靠性；此外，發(fā)明人制 備的免疫原是一種融合蛋白，因此用ELISA法有可能篩選了融合蛋白的標(biāo)簽的位點(diǎn)而非 ppGalNAc-T2蛋白的位點(diǎn)的風(fēng)險(xiǎn)，所以必須用另一方法確立識(shí)別的是ppfeilNAC-T2蛋白抗 原表位來(lái)佐證。本發(fā)明同時(shí)要求保護(hù)一種人ppfeilNAC-T2的單克隆抗體，所述人ppfeilNAC-T2 的單克隆抗體由上述雜交瘤細(xì)胞株LW-5F3產(chǎn)生，所述單克隆抗體為高特異性的鼠源抗 ppGalNAc-T2單克隆抗體，所述單克隆抗體為IgM類，kapa型，制備所述人ppfeilNAC-T2的 單克隆抗體的方法有兩種第一種方法包括以下步驟以上述雜交瘤細(xì)胞4D3亞克隆的一株細(xì)胞5F3(即雜交 瘤細(xì)胞株LW-5F3)作種子細(xì)胞用10% CBS+DMEM或10% CBS+RPMI-1640，在細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備 (如轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備)中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，在培養(yǎng)上清中可分泌鼠抗人PPfelNAc-T2單克隆 抗體；第二種方法采用雜交瘤細(xì)胞株LW-5F3誘生腹水的方法來(lái)生產(chǎn)該單抗蛋白；對(duì)上述兩種方法進(jìn)行比較用ELISA法進(jìn)行效價(jià)比較發(fā)現(xiàn)腹水中抗體效價(jià)比培 養(yǎng)上清(細(xì)胞濃度為106/ml)抗體的效價(jià)高出3000倍以上，故采用該方法生產(chǎn)極大的提高 了單抗蛋白產(chǎn)量大大的降低了生產(chǎn)成本。上述技術(shù)方案中，用雜交瘤細(xì)胞株LW-5F3反復(fù)進(jìn)行誘生腹水試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該株能良 好誘導(dǎo)產(chǎn)生大量血性腹水且目標(biāo)抗體蛋白占在腹水總蛋白的比例能達(dá)到15 20%，其每 毫升抗體蛋白產(chǎn)量均已達(dá)到毫克級(jí)以上，為下一步進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)提供了可靠保證。本發(fā)明還保護(hù)一種利用上述抗人ppfeilNAC-T2的單克隆抗體檢測(cè)ppfeilNAC-T2蛋 白表達(dá)水平的應(yīng)用。因此，本發(fā)明同時(shí)要求保護(hù)一種利用上所述單克隆抗體采用免疫學(xué)方法檢測(cè) ppGalNAc-T2蛋白表達(dá)水平的方法。上述技術(shù)方案中，為檢測(cè)人ppfeilNAC-T2蛋白表達(dá)水平，優(yōu)選地，可以使用以下免 疫學(xué)方法，如間接免疫酶聯(lián)吸附試驗(yàn)(ELISA)法，免疫印跡試驗(yàn)(Western-blot)法，免 疫細(xì)胞熒光試驗(yàn)(Immunocytoflurescence)法，免疫熒光流式細(xì)胞分析(Flowcytometer Analysis)等法對(duì)含多種形式ppfeilNAC-T2蛋白的樣本進(jìn)行檢測(cè)。上述技術(shù)方案中，所述人ppfeilNAC-T2蛋白包括人ppfeilNAC-T2的原核表達(dá)產(chǎn) 物、人PP&tlNAc-T2的真核表達(dá)產(chǎn)物、人ppfeilNAC-T2表達(dá)蛋白的變性蛋白和非變性蛋白。進(jìn)一步的技術(shù)方案中，上述檢測(cè)ppfeilNAC-T2蛋白表達(dá)水平的方法，可以分析在腫瘤細(xì)胞或組織中ppfetlNAc-T2的異常表達(dá)。上述技術(shù)方案中，所述免疫學(xué)方法屬于免疫學(xué)常見(jiàn)基本技術(shù)，屬于本領(lǐng)域技術(shù)人 員公知的技術(shù)；另外根據(jù)本發(fā)明現(xiàn)有的試驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，所述抗體可以應(yīng)用在免疫酶組織化 學(xué)和免疫組織熒光化學(xué)試驗(yàn)。由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)1、在檢測(cè)人ppfeilNAC-T2蛋白的時(shí)候，本發(fā)明由于得到了特異性高、親和力高的 抗人pp(}alNAC-T2單克隆抗體，因此，本發(fā)明所述檢測(cè)方法無(wú)需提取RNA那樣非?？量痰脑?驗(yàn)條件(主要防止RNA降解)，也無(wú)需Real-timePCR技術(shù)那樣需設(shè)嚴(yán)格的內(nèi)參和外參和利 用昂貴的實(shí)時(shí)定量PCR儀，不僅大大降低了檢測(cè)的成本，更重要的是對(duì)檢測(cè)時(shí)機(jī)的要求也 大大降低了，沒(méi)有上述專利嚴(yán)格；同時(shí)由于該單抗可大量生產(chǎn)也可制備直標(biāo)抗體，而不用二 級(jí)免疫試劑來(lái)降低成本和提高檢測(cè)效率。2、與丹麥的Ulla Mandel小組制備的單克隆抗體相比，本發(fā)明所述抗人 ppGalNAc-T2的單克隆抗體不僅可以成功用于間接免疫酶聯(lián)吸附(ELISA)，免疫細(xì)胞熒光 (Immunocytoflurescence),免疫熒光流式細(xì)胞分析(Flowcytometer Analysis)等實(shí)驗(yàn),還 可以成功用于免疫印記(Western Blot)實(shí)驗(yàn)。3、本發(fā)明制備了一種抗人pp(ialNAC-T2的單克隆抗體，該單克隆抗體具有高特異 性和高親和力，能夠識(shí)別人ppfetlNAc-T2的原核表達(dá)產(chǎn)物，人ppfeilNAC-T2的真核表達(dá)產(chǎn) 物。因此，利用該單克隆抗體可以簡(jiǎn)便快速準(zhǔn)確地檢測(cè)出人PpGalNAc-T2蛋白的表達(dá)水平。4、本發(fā)明制備了一種可以分泌抗人pp(ialNAC-T2單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，該 雜交瘤細(xì)胞株具有良好的傳代能力并能大量擴(kuò)增培養(yǎng)，能穩(wěn)定體外分泌抗體，并且分泌抗 體的能力隨著培養(yǎng)代次增加沒(méi)有下降，誘生腹水的能力也不隨傳代次數(shù)的增加而改變。


雜交瘤細(xì)胞株的保藏信息為保藏單位中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；地址中國(guó)武 漢大學(xué)；保藏日期2010年11月4日；保藏編號(hào)CCTCC NO :C2010106 ；分類命名雜交瘤細(xì) 胞株 LW-5F3 ；附圖1為實(shí)施例一中制備抗人pp(ialNAC-T2的單克隆抗體的制備方案圖；附圖2為實(shí)施例一中5F3細(xì)胞不同代次的生長(zhǎng)曲線圖；附圖3為實(shí)施例一中單克隆抗體的亞類測(cè)定圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述實(shí)施例一鼠抗人ppfeilNAC-T2蛋白單克隆抗體的制備采用ppGalNAC-T2基因原核表達(dá)產(chǎn)物作為免疫原免疫Balb/C小鼠的策略以獲取 該免疫原致敏的B細(xì)胞，具體的操作方法1.制備單克隆抗體免疫原1. lppGalNAC-T2基因完整開(kāi)放閱讀框片段的擴(kuò)增直接從組織或細(xì)胞中獲取純化pp(ialNAC-T2蛋白制備抗體十分困難，因而通過(guò)基 因工程表達(dá)產(chǎn)物制備抗體是有效的方法，要獲得基因工程表達(dá)產(chǎn)物調(diào)取目的基因是先決條
6件。采用細(xì)胞系能產(chǎn)生大量的ppfeilNAC-T2基因轉(zhuǎn)錄本，然后經(jīng)總RNA的提 取、RT-PCR擴(kuò)增和重組轉(zhuǎn)移載體pGEM-T-ppGalNAC-T2的構(gòu)建，重組質(zhì)粒的經(jīng)測(cè)序，獲取 ppGalNAc-T2基因完整開(kāi)放閱讀框片段，具體包括以下步驟(1)取2X IO6個(gè)生長(zhǎng)良好的293T細(xì)胞(來(lái)源于ATCC，America),用 Trizol (Promega公司產(chǎn)品)提取總mRNA，按RT試劑盒(Promega公司產(chǎn)品)說(shuō)明書(shū)的方法 獲取mRNA互補(bǔ)第一鏈(cDNA)；(2)以步驟(1)所得mRNA互補(bǔ)第一鏈為模板，用第一對(duì)上下游引物進(jìn)行100 μ 1反 應(yīng)體系PFU酶的PCR擴(kuò)增(100 μ 1反應(yīng)體系，3 μ 1上樣)，清潔后進(jìn)行BamHI (TAKARA公司 產(chǎn)品)單酶切；所述上下游引物為F 5-GGATCCATGCGGCGGCGCTCGCGGATG(SEQ ID No.1)R 5-GGATCCCTACTGCTGCAGGTTGAGCGTGAAC(SEQ ID No. 2)上述引物是根據(jù)公布的ppfeilNAC-T2基因序列(基因序列號(hào)是NM_004481. 3)設(shè) 計(jì)的，設(shè)計(jì)二對(duì)引物是基于以下二個(gè)方面考慮I、該基因ORF(Open Reading Frame)由1713bp組成，以一對(duì)引物通過(guò)低擴(kuò)增效率 的高保真酶PFU (Fermentas公司產(chǎn)品)(比普通Taq擴(kuò)增效率要低2-3倍，但突變率和錯(cuò)配 率很低，故調(diào)取大目的基因特別是大于500bp的基因時(shí)宜用)進(jìn)行PCR擴(kuò)增其產(chǎn)物量低不 利于以后的基因操作；II、一對(duì)通長(zhǎng)引物PCR擴(kuò)增長(zhǎng)度過(guò)長(zhǎng)基因(大于IOOObp)易出現(xiàn)錯(cuò)配和突變)。將上述PFU酶PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定在1700bp位置上有明顯的條 帶，與預(yù)期分子量(17i;3bp) —致，該結(jié)果表明我們已經(jīng)獲得該基因的DNA片段。(3)將步驟⑵雙酶切所得的片段通過(guò)BamHI酶切點(diǎn)克隆到pGEM T (promega 公司產(chǎn)品)載體上，酶切鑒定正確后備用，取3-4個(gè)重組菌落克隆的重組轉(zhuǎn)移載體pGEM T-ppGalNAc-T2進(jìn)行ppfeilNAc-T2基因的測(cè)序(測(cè)序工作由上海hvitrogen公司完成)， 測(cè)序結(jié)果與GENEBANK公布的ppfeilNAc-T2 (NM_004481. 3) cDNA序列一致，且目的基因插入 方向正確。1. 2 重組表達(dá)載體 pET3h (+) -ppGalNAc_T2 的構(gòu)建將步驟1. 1構(gòu)建的經(jīng)測(cè)序正確的質(zhì)粒pGEM T-ppGalNAc-T2和質(zhì)粒ρΕΤ3^ι(+) (novagen公司產(chǎn)品)用BamH I酶于37°C酶切2小時(shí)后，割膠回收目的片段，并用T4DNA 連接酶(上述兩種酶均為i^rmentas公司產(chǎn)品)16°C連接過(guò)夜，得到含有重組表達(dá)載體 pET32a(+) -ppGalNAc-T2 的連接液；繼而將連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α (由本室保存)，挑單菌落，質(zhì)粒提取酶切鑒定， 陽(yáng)性克隆菌保種備用。所述酶切鑒定包括以下步驟將所得重組質(zhì)粒pET3h(+)-ppGalNAC-T2用BamHI 酶切經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果在1.71Λ，5. 91Λ位置上各有一條明顯的條帶；與此 同時(shí)，將重組質(zhì)粒進(jìn)行基因測(cè)序(測(cè)序工作由上海hvitrogen公司完成)，測(cè)序結(jié)果與 GENEBANK公布的ppfeilNAc-T2 (NM_004481. 3) cDNA序列一致，且目的基因插入方向正確。該 結(jié)果表明我們已將ppfeilNAC-T2基因片段正確克隆于原核表達(dá)載體pET3h(+)上。
1. 3ppGalNAc-T2基因原核表達(dá)產(chǎn)物的獲得與純化將上述已經(jīng)酶切鑒定重組表達(dá)載體pET3h(+)-ppGalNAC-T2轉(zhuǎn)化原核表達(dá)菌大 腸桿菌BL21株(Invitrogen公司產(chǎn)品)，挑單菌落于挑單個(gè)菌落至含氨芐霉素MDG(5ml)培 養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)過(guò)夜；然后取該培養(yǎng)液Iml加至IOOml含氨芐霉素的ZYM-5052自動(dòng)誘導(dǎo) 表達(dá)培養(yǎng)基中，過(guò)夜培養(yǎng)(注MDG培養(yǎng)基，ZYM-5052自動(dòng)誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基及培養(yǎng)要求均參 考文獻(xiàn)F William Studier. Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures, Protein Expression and Purification. 2005,41 :207_234)。加等體積的2XSDS-PAGE電泳上樣緩沖液，于沸水浴中孵育15min，12，000r/min 4離心15min取上清，上樣于8 Ife 12% SDS-PAGE制備膠(10cmX8cmX 1. 5mm)(每塊膠均 上Iml蛋白樣本液，同時(shí)設(shè)預(yù)染蛋白分子量marker孔)于冰水浴中電泳，電泳后按預(yù)染 蛋白分子量marker指示分子量割取含目標(biāo)蛋白的膠條，上述膠條剪碎后置于蛋白透析袋 (14，000-20, 000D, pharmacia公司產(chǎn)品)中，加適量電極緩沖液浸沒(méi)后扎緊，置于Wfestern Blot轉(zhuǎn)移片中央，加滿電極緩沖液后，將電泳槽置于冰水浴中進(jìn)行IlOmA電洗脫池，再將 透析袋置于冰冷的0.01M PBS (pH7. 2)中透析Mh，無(wú)菌取上清于12，OOOr/min 4°C離心 15min再取上清，用少許樣本進(jìn)行紫外分光儀(Eppendorf公司產(chǎn)品)進(jìn)行含量分析和12% SDS-PAGE電泳純度，其余樣本按每份IOOul分裝_80°C凍存?zhèn)溆?。上述純化物?jīng)紫外分光儀測(cè)定其含量為1. 0mg/ml和經(jīng)電泳鑒定發(fā)現(xiàn)在分子量 85kd位置有一條明顯蛋白條帶，其純度約85%，該條帶與我們預(yù)計(jì)目標(biāo)表達(dá)產(chǎn)物分子量一 致ppGalNAC-T2 (65Kd) +Tag標(biāo)簽(約20Kd) = 85Kd ；該結(jié)果表明已經(jīng)獲得了目的基因表 達(dá)產(chǎn)物電泳純樣本，已經(jīng)能滿足作免疫原免疫小鼠制備單克隆抗體的需要。2.抗原致敏B淋巴細(xì)胞的免疫小鼠獲得無(wú)菌取步驟1. 3所得pp(ialNAC-T2基因原核表達(dá)并純化的蛋白樣本(蛋白濃度 1. 0mg/ml)用0. OlM PBS(pH7. 2) 10X稀釋后加等體積的弗氏完全佐劑(sigma公司產(chǎn)品) 充分混勻后按30 μ g/只蛋白劑量注射于5只5周齡雌性的SPF級(jí)Balb/c小鼠(由蘇州大 學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)腹腔中，每隔二周后按上述等蛋白劑量加弗氏不完全佐劑(sigma公 司產(chǎn)品)腹腔免疫各一次，三次免疫后再隔一周按30ug/只蛋白劑量(無(wú)佐劑)進(jìn)行四免， 四免后5 7天，眼眶靜脈采血取血清作待測(cè)抗體；以步驟1. 3所述pp(ialNAC-T2純化蛋白 (lmg/ml)作固定標(biāo)準(zhǔn)抗原，做間接ELISA，效價(jià)超過(guò)1 1000的為合格小鼠，此時(shí)無(wú)菌取其 脾細(xì)胞作為抗原致敏B淋巴細(xì)胞。ELISA效價(jià)已達(dá)到1 1000，該結(jié)果表明我們已經(jīng)獲得了能產(chǎn)生較高效價(jià)針對(duì)原 核表達(dá)產(chǎn)物特異性抗體的免疫小鼠，同時(shí)說(shuō)明該小鼠脾臟內(nèi)已有抗原致敏B淋巴細(xì)胞克 隆。至此已經(jīng)完成了制備單抗第一重要階段。在此需說(shuō)明的是免疫小鼠獲取抗原致敏B淋巴細(xì)胞有多種方法，本實(shí)施例采用 了經(jīng)典免疫方法，該方法的優(yōu)點(diǎn)是免疫效果好，主要體現(xiàn)在B淋巴細(xì)胞受抗原免疫刺激時(shí) 間長(zhǎng)，受免疫刺激B淋巴細(xì)胞基因重排克隆穩(wěn)定，為以后獲取優(yōu)良穩(wěn)定雜交瘤細(xì)胞克隆奠 定了良好的基礎(chǔ)，其缺點(diǎn)是免疫期長(zhǎng)需40-50天免疫周期；另外一種方法是將抗原直接注 射小鼠脾臟免疫，該方法的優(yōu)點(diǎn)是需要的抗原量少(10ng-2yg/只)，免疫期短20- 天即 可，但缺點(diǎn)是操作困難，小鼠應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)、B淋巴細(xì)胞基因重排克隆穩(wěn)定性差，在制備該抗體 時(shí)，發(fā)明人考慮需要抗原易得故用經(jīng)典免疫法以獲取高穩(wěn)定性基因重排的抗原致敏B淋巴細(xì)胞。3.融合細(xì)胞克隆的獲取和分泌抗體克隆的篩選3. 1融合細(xì)胞生長(zhǎng)克隆培養(yǎng)無(wú)菌取上述一只合格小鼠脾臟，將其置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，10% FBS+RPMI-1640洗 滌2-3次后剪成小塊，用無(wú)菌玻璃片研磨，擠出脾細(xì)胞，30-40ml 10% FBS+RPMI 1640吹散 重懸細(xì)胞，過(guò)尼龍膜進(jìn)行細(xì)胞篩后(單細(xì)胞易于細(xì)胞融合)再用RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌2-3 次并計(jì)數(shù)；按脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0細(xì)胞(來(lái)源于ATCC)5 1 10 1的比例將處 于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SP2/0細(xì)胞加入脾細(xì)胞懸浮液離心管中，用RPMI-1640培養(yǎng)基離心洗滌2_3 次，按常規(guī)PEG細(xì)胞融合劑(北京賽馳公司產(chǎn)品)細(xì)胞融合法進(jìn)行脾細(xì)胞與SP2/0融合； 融合后離心去除融合液，重懸于120ml 20% FBSplus RPMI-1640培養(yǎng)液中，并按IOOul/孔 植于12塊預(yù)先長(zhǎng)有Balb/c小鼠腹腔巨噬或胸腺細(xì)胞飼養(yǎng)層中的96孔板的孔中，(注融 合前一天按3 4X IO4個(gè)細(xì)胞/孔加入飼養(yǎng)細(xì)胞)種植12塊96孔板，每孔加100 μ 1含 2ΧΗΑΤ(用100ΧΗΑΤ儲(chǔ)存液(SIGMA公司產(chǎn)品)稀釋)10% FBS PLUS RPMI-1640培養(yǎng)液的 飼養(yǎng)細(xì)胞懸浮液；)于37°C 5% CO2培養(yǎng)，一周后用含IXHAT 20% FBS PLUSRPMI-1640培 養(yǎng)液進(jìn)行2/3換液并繼續(xù)培養(yǎng)，于2周后培養(yǎng)出多個(gè)HAT抗性克隆(細(xì)胞克隆生長(zhǎng)面積約 占孔面積的1/4時(shí))待篩選。3. 2分泌抗體克隆的篩選與亞克隆各取克隆孔上清分成二份(50 μ 1/份)作為待檢抗體，檢測(cè)前一天將ppfeilNAC-T2 原核表達(dá)純化蛋白(lmg/ml)用0. IM Na2C03/NaHC03 (pH9. 6)作1 15稀釋并按IOOul/孔 包被于96孔酶標(biāo)板(corning公司產(chǎn)品)中，于4°C包被過(guò)夜，用0. OlM PBS(pH7. 2)洗滌2 次，加 200 μ 1/ 孔 5% CBS (GIBC0 公司產(chǎn)品)/0. OlM PBS (pH7. 2)于 37°C濕浮 2h，用 0. OlM PBS (pH7. 2)洗滌1次，每孔加一份待檢抗體，設(shè)SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)照孔，37°C濕浮lh， 0. 02% Tween20/0. OlM PBS (pH7. 2)洗滌 4 次(4X IOmin)，各加 50ul 的 1 300affinity purified HRP conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)(親和純辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊 抗小鼠IgG(重鏈和輕鏈)二抗)(Bioworld公司產(chǎn)品)(5% CBS/0. OlM PBS(pH7. 2)稀釋) 二抗，同上濕浮lh，洗滌4次后，加50 μ 1/孔OPD (上海生工產(chǎn)品)/ 顯色液避光顯色， ELISA酶標(biāo)儀(Thermo公司產(chǎn)品)測(cè)定OD49tl值，以試驗(yàn)孔OD49tl值大于對(duì)照孔OD49tl值2倍 判讀為陽(yáng)性孔。準(zhǔn)備檢測(cè)前一天將細(xì)胞擴(kuò)增于細(xì)胞培養(yǎng)瓶(corning公司產(chǎn)品)中，于 37 0C 5 % CO2培養(yǎng)；收集細(xì)胞，每孔IX IO5個(gè)細(xì)胞，將細(xì)胞用0. 01MPBS (ρΗ7. 2)洗 滌1次，將細(xì)胞用2%福爾馬林室溫固定15min，PBS清洗兩次，每管加入200μ 1含0. 5% Saponin (Sigma公司產(chǎn)品)的破膜緩沖液重懸細(xì)胞，IOOOrpm離心5分鐘，棄上清；加入 100 μ 1上述破膜緩沖液，每孔加1 μ 1待檢抗體(克隆孔細(xì)胞上清)并設(shè)SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)上 清對(duì)照孔，于4°C孵育0. 5h ；0. OlM PBS (pH7. 2)洗滌2次(2 X 5min)，更換為上述破膜緩沖 液，每孑L力口 Iul 的 affinity purified FITC conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) ( 0 和純FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(重鏈和輕鏈)二抗)(Bioworld公司產(chǎn)品)(3% CBS/0. OlM PBS(pH7. 2)稀釋)二抗4°C避光孵育0.證，洗滌2次后，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)上樣分析，通過(guò)對(duì) 照孔判讀陽(yáng)性孔，篩選出雙陽(yáng)性克隆。
將上述雙陽(yáng)性的克隆進(jìn)行至少2輪單細(xì)胞亞克隆(方法同融合細(xì)胞生長(zhǎng)克隆培 養(yǎng))，待細(xì)胞長(zhǎng)至30%細(xì)胞單層時(shí)再進(jìn)行上述雙篩選(同上方法)直至獲得100%雙陽(yáng)性 克隆后，取其中生長(zhǎng)最旺盛一株克隆并命名為L(zhǎng)W-5F3，將該克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并凍存和復(fù) 蘇。4.雜交瘤細(xì)胞克隆5F3不同代次的生長(zhǎng)曲線及抗體分泌能力的穩(wěn)定性分析4.1不同代次的生長(zhǎng)曲線將lX104/ml的第一代，第五代，第十代，第二十代雜交瘤5F3細(xì)胞株按2mL/孔分 別種植于6孔標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning公司產(chǎn)品)中，于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分 別在12h，Mh，36h時(shí)間點(diǎn)每個(gè)代細(xì)胞各取3孔充分分散后用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，并以時(shí)間點(diǎn) 作為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)作為縱坐標(biāo)繪出生長(zhǎng)曲線，得圖2。如附圖2所示用10%小牛血清培養(yǎng)基對(duì)5F3雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行第一代，第五代， 第十代，第二十代生長(zhǎng)曲線分析，細(xì)胞的倍增時(shí)約為4h，而各代次生長(zhǎng)速率亦基本一致。上 述結(jié)果說(shuō)明實(shí)施例一獲得雜交瘤細(xì)胞能良好的傳代并能大量擴(kuò)增培養(yǎng)；同時(shí)并不隨培養(yǎng)代 次增加而生長(zhǎng)能力下降。4. 2抗體分泌穩(wěn)定性分析首先對(duì)5F3雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行傳代，分別取第一代，第五代，第十代，第二十代雜交 瘤(初始細(xì)胞密度2X106/ml)培養(yǎng)過(guò)夜后的上清樣本，通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定各樣本 總蛋白的含量，同時(shí)將上清進(jìn)行用SDS-PAGE電泳，操作步驟同Western Blot中，電泳結(jié)束 后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，利用Quantity One分析軟件分析抗體50Kd，25Kd 二條帶占總蛋 白條帶中的比例；分析結(jié)果顯示四個(gè)代次培養(yǎng)上清平均總蛋白的含量分別為6. 08mg/ml, 5. 99mg/ml，6. 09mg/ml，6. 01mg/ml，而上述二條帶占總蛋白的百分比約為7. 13 %，7. 26 %， 7. 11%,7. 09% ；從統(tǒng)計(jì)學(xué)分析四個(gè)代次的分泌抗體量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異；其次，對(duì)細(xì)胞分泌上清進(jìn)行ELISA鑒定，取第一代，第五代，第十代，第二十代 雜交瘤(初始細(xì)胞密度2X 106/ml)培養(yǎng)過(guò)夜后的上清樣本作為一抗，以1. 3中獲得的 ppGalNAc-T2原核純化蛋白包板，進(jìn)行ELISA，每組別均做6個(gè)重復(fù)孔，抗原抗體使用量及操 作步驟同3. 2中所描述；分析結(jié)果顯示OD490平均值分別為1. 805，1. 798，1. 803，1. 793 ；從 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析四個(gè)代次的分泌抗體能力無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異；從以上結(jié)果可以說(shuō)明實(shí)施例一獲得雜交瘤能穩(wěn)定體外分泌抗體，同時(shí)說(shuō)明隨著培 養(yǎng)代次增加而分泌抗體的能力不下降。4. 3雜交瘤細(xì)胞株5F3體內(nèi)誘生腹水能力的指標(biāo)同樣用上述四個(gè)代次細(xì)胞，并按5X IO6/只腹腔注射每代次注射5只5周齡雌性 BALB/c小鼠(具體操作見(jiàn)下文，腹水制備)，四個(gè)代次細(xì)胞在二周內(nèi)獲得腹水平均數(shù)分別為 4. 51ml/只，4. 78ml/只，4. 66ml/只，4. 59ml/只；用上述方法測(cè)腹水中平均總蛋白含量分別 為 100. 12mg/ml，105. 05mg/ml, 101. 75mg/ml, 101. 92mg/ml 而抗體占總蛋白的百分比分別 為19. 08%, 18. 92%,19. 73% ；18. 86%，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析上述三個(gè)指標(biāo)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異性， 結(jié)果說(shuō)明該雜交瘤細(xì)胞誘生腹水的能力也不隨傳代次數(shù)的增加而改變。5.目標(biāo)雜交瘤體內(nèi)誘生腹水產(chǎn)生5. 1小鼠的預(yù)處理選擇5周齡SPF級(jí)BALB/c小鼠(平均體重21g) 10只，接種細(xì) 胞前1-2周按0. 5ml/只預(yù)先腹腔注射液體石蠟(上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品)(我們用弗氏不
10完全佐劑、降植烷、液體石蠟等三種試劑進(jìn)行致敏效果的比較發(fā)現(xiàn)三者無(wú)明顯差異，故選用 廉價(jià)的液體石蠟)致敏。5. 2接種雜交瘤細(xì)胞接種前一天，我們將上述雜交瘤細(xì)胞按1 8-10傳代待細(xì) 胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期輕輕吹打懸浮細(xì)胞，1000r/min離心5min，棄培養(yǎng)液，用無(wú)血清培養(yǎng)基洗 滌離心2次后，并用該培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞濃度至5X106/ml，按0. 5ml/只注射于上述的預(yù)處理的 BALB/c小鼠腹腔中，注射后精心飼養(yǎng)。5. 3腹水的采集注射后7-12天取腹水于5ml離心管中，lOOOr/min離心5min以 去除腹水中的細(xì)胞，取上清4°C 12000r/min離心15min，取少量上清并用紫外分光光度計(jì)和 SDS-PAGE檢測(cè)其蛋白含量和純度，同時(shí)用間接ELISA法測(cè)定其效價(jià)，并分裝_80°C凍存?zhèn)溆谩?.單克隆抗體免疫球蛋白抗體亞型分類分析取上述的5F3克隆細(xì)胞培養(yǎng)上清及腹水，利用亞類測(cè)定試紙(Roche公司產(chǎn)品)鑒 定單克隆抗體免疫球蛋白亞型分類分析。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)附圖3，根據(jù)試紙顯示該抗體為IgM，kapa亞型。7.單克隆抗體的特異性分析我們對(duì)5F3細(xì)胞培養(yǎng)上清及所制備腹水進(jìn)行抗體特異性分析，這也同時(shí)涉及該單 克隆抗體在檢測(cè)ppfeilNAC-T2蛋白表達(dá)水平時(shí)的應(yīng)用。7. 1單克隆抗體對(duì)多種樣本W(wǎng)festern-Blot試驗(yàn)單克隆抗體對(duì)原核表達(dá)及真核ppfeilNAc-T2蛋白Western-Blot定性試驗(yàn)(1)以上述1.3中制備的原核抗原作為目標(biāo)蛋白，按50yg/line(同時(shí)上等量同 樣處理的原核表達(dá)空菌體蛋白作陰性對(duì)照，并加預(yù)染蛋白分子量marker孔)上樣于12% SDS-PAGE于冰水浴中電泳，電泳后，按濕轉(zhuǎn)膜法于IlOmA冰水浴中將膠中的蛋白轉(zhuǎn)移于 NC 膜(0. 2um, pharmacia 公司產(chǎn)品)上，0. 01MPBS (pH7. 2)浸沒(méi)平衡 15min 后，于 5 % 脫 脂奶粉/0. OlM PBS (pH7. 2) 4°C封閉過(guò)夜，加上述待測(cè)一抗室溫孵育90min后，用0. 02% Tween 20/0. OlM PBS(pH7. 2)洗滌 4 次 0X IOmin)后，1 300 affinity purified HRP conjugated goatanti-mouse IgM(Bioworld 公司產(chǎn)品)(3%脫脂奶粉/0. OlM PBS (pH7. 2) 稀釋)室溫孵育60min并洗滌4次(同上)后，DAB (上海生工產(chǎn)品)/ 顯色液中避光顯 色，充分洗滌后拍照。(2)將pcDNA3. l-ppGalNAc-T2基因重組真核載體(自己構(gòu)建)利用脂質(zhì)體 2000 (Invitrogen公司產(chǎn)品)轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，以pcDNA3. 1空載體轉(zhuǎn)染作為空白 mock 對(duì)照，經(jīng) 600 μ g/ml G418 (Sigma 公司產(chǎn)品)篩選，獲得 L9^/pcDNA3. l_ppGalNAc_T2 及L^9-moCk轉(zhuǎn)染細(xì)胞；以正常培養(yǎng)細(xì)胞系作為陰性對(duì)照，將上述三組細(xì)胞用10% FBS plus RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)于50ml標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞瓶中待細(xì)胞長(zhǎng)滿后收集細(xì)胞；將， L929/pcDNA3. l_ppGalNAc_T2及L929_mock三組細(xì)胞用 0. 25% (trypsin/0. 01MPBS(ρΗ7· 2) 消化后，用0. OlM PBS (ρΗ7. 2)離心洗滌2_3次后，加60-80 μ 1該緩沖液重懸細(xì)胞，加等體積 的 2Χ SDS-PAGE loding buffer 于沸水浴中孵育 15min 后，于 12，000r/min 4°C離心 15min 取上清，測(cè)蛋白的含量，進(jìn)行電泳、電轉(zhuǎn)移、抗體的顯色，操作方法均同上。結(jié)果顯示，該結(jié)果表明我們的抗體在原核蛋白及真核蛋白的Western Blot實(shí)驗(yàn)中 均有良好表現(xiàn)，該抗體不僅可以進(jìn)行PpfelNAc-T2蛋白的定性分析，同時(shí)也可進(jìn)行定量或半定量分析。7. 2細(xì)胞免疫熒光分析取生長(zhǎng)良好的IXlO5個(gè)人肝癌細(xì)胞H印G2進(jìn)行涂片，然后4%多聚甲醛(上海化 學(xué)試劑公司產(chǎn)品)/0. OlM PBS(pH7. 2)室溫固定30min，0. OlM PBS(pH7. 2)洗滌 1 次，0. 02% Triton x-100 (上海生工產(chǎn)品)/0. OlM PBS (pH7. 2)室溫透化 15min，3% CBS/0. 02% Triton X-100/0. OlM PBS (pH7. 2)室溫封閉lh，每孔加一份待檢抗體并設(shè)對(duì)照孔，于37°C濕浮lh， 0. 02% tween20/0. OlMPBS (pH7. 2)洗滌 4 次(4X IOmin)，每孔力口 50ul 的 1 300affinity purified FITCconjugated goat anti-mouse IgM(Bioworld 公司產(chǎn)品)(3 % CBS/0. OlM PBS (pH7. 2)稀釋)二抗同上濕浮lh，洗滌4次后，抗淬滅劑封片，進(jìn)行熒光顯微鏡拍照；結(jié) 果顯示，該單克隆抗體能很好的識(shí)別真核細(xì)胞中ppGalNAC-T2蛋白，在免疫熒光實(shí)驗(yàn)中有 很好的表現(xiàn)，這也說(shuō)明該抗體能夠應(yīng)用于免疫組化以及ppfeilNAC-T2的細(xì)胞定位研究。7. 3流式細(xì)胞術(shù)操作步驟同3. 2中陽(yáng)性克隆的流式細(xì)胞術(shù)篩選，細(xì)胞更換為人肝癌細(xì)胞系HepG2 和人白血病細(xì)胞系Jurkat，并設(shè)立對(duì)照試驗(yàn)；腹水一抗稀釋比例為1 1000 ;affinity purified FITC conjugated goat anti-mouse 親和純 FITC 標(biāo)記山羊抗小鼠 重 鏈和輕鏈)二抗)二抗稀釋比例為1 200;結(jié)果顯示，該單克隆抗體能夠特異的標(biāo)記H印G2 細(xì)胞及Jurkat細(xì)胞，陽(yáng)性標(biāo)記率均達(dá)50%以上，說(shuō)明該抗體的特異性較高，且能很好識(shí)別 pp(}alNAC-T2，這也為該單克隆抗體用于腫瘤pp(ialNAC-T2異常表達(dá)的通量檢測(cè)奠定個(gè)基 石出。
權(quán)利要求
1.一種雜交瘤細(xì)胞株，所述雜交瘤細(xì)胞株的保藏信息為保藏單位中國(guó)典型培養(yǎng) 物保藏中心；地址中國(guó)武漢大學(xué)；保藏日期2010年11月4日；保藏編號(hào)CCTCC NO C2010106 ；分類命名雜交瘤細(xì)胞株LW-5F3。
2.一種單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體由權(quán)利要求1所述雜交瘤細(xì)胞株 LW-5F3 產(chǎn)生。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體為高特異性的鼠源 抗ppfeilNAc-T2單克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體為IgM亞類，kapa型。
5.一種利用權(quán)利要求2所述單克隆抗體檢測(cè)ppfeilNAC-T2蛋白表達(dá)水平的應(yīng)用。
6.一種利用權(quán)利要求2所述單克隆抗體采用免疫學(xué)方法檢測(cè)ppfeilNAC-T2蛋白表達(dá)水 平的方法，所述免疫學(xué)方法包括間接免疫酶聯(lián)吸附試驗(yàn)法，免疫印跡試驗(yàn)法，免疫細(xì)胞熒 光試驗(yàn)法，免疫熒光流式細(xì)胞分析。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述檢測(cè)方法，其特征在于，所述人ppfeilNACT2蛋白包括人 ppGalNAc-T2的原核表達(dá)產(chǎn)物、人ppfeilNAc-T2的真核表達(dá)產(chǎn)物、人ppfeilNAc-T2表達(dá)蛋白 的變性蛋白和非變性蛋白。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種抗人ppGalNAc-T2單克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用，所述單克隆抗體由雜交瘤細(xì)胞株LW-5F3產(chǎn)生。所述高特異性、高效價(jià)的鼠抗人ppGalNAc-T2單克隆抗體，能夠采用間接免疫酶聯(lián)吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)，免疫印跡(Western-blot)，免疫細(xì)胞熒光(Immunocytoflurescence)，免疫熒光流式細(xì)胞分析(Flowcytometer Analysis)或免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry)等多種手段實(shí)現(xiàn)對(duì)ppGalNAc-T2表達(dá)的快速通量檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12N5/20GK102061287SQ201010555708
公開(kāi)日2011年5月18日 申請(qǐng)日期2010年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月23日
發(fā)明者劉春亮, 吳士良, 姜智, 徐嵐, 林丹丹, 顧文超 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)