專利名稱：同時測定五種cyp450酶探針藥代謝產(chǎn)物的檢測方法
技術領域：
本發(fā)明屬醫(yī)藥檢測的技術領域，涉及一種同時測定5種CYP450酶探針藥代謝產(chǎn)物 的檢測方法，。
背景技術：
細胞色素P450酶系(CYP450)是人體內(nèi)最重要的藥物代謝酶，與藥物代謝密切相 關的同工酶有 CYP1A2、CYP2A6、、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1 和 CYP3A4。藥物可顯著 影響藥酶細胞色素P450的活性，使其誘導或抑制，并加速或減緩底物和其他藥物代謝，這 些構成了藥物體內(nèi)過程和藥物相互作用的主要機制。探針藥物法指經(jīng)CYP450代謝的特異性底物，以其代謝物和原型藥的比例或速率 衡量酶代謝能力變化來衡量CYP450相關亞型的酶活力或表達量的方法。現(xiàn)有技術的測定五種CYP450酶探針藥代謝產(chǎn)物的檢測方法，可以參見如下兩篇 吉林大學博士論文。①《優(yōu)克那非臨床前藥代動力學研究》作者王江；導師顧景凱; 2008年。②《去甲基文拉法辛前體藥物和比索洛爾的藥物動力學研究》作者劉明遠；導 師顧景凱；李又欣；2007年。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是，建立一種同時測定5種CYP450酶探針藥代謝產(chǎn)物的 檢測方法。本發(fā)明的技術方案是一種同時測定五種CYP450酶探針藥代謝產(chǎn)物的檢測方法，所述的五種CYP450酶 是 CYP1A2、CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9、CYP2C19 ；主要有以下三個步驟(1)肝微粒體的制備及孵化首先制備大鼠肝微粒體；分別選擇非那西丁、咪達唑侖、異喹胍、甲苯磺丁脲和美 芬妥英作為五種CYP450酶的探針藥物，分別建立五種探針藥物孵化體系；將肝微粒體分別 與五種探針藥物進行孵化反應，使這五種探針藥物在其特異性酶的作用下分別轉化成對乙 酰氨基酚、4’ -羥基異喹胍、1，-羥基咪達唑侖、4’ -羥基甲苯磺丁脲和4’ -羥基美芬妥英；(2)樣品預處理樣品預處理按下述步驟操作，①孵化反應終止后，取反應液，立即加入冰冷甲醇；②取5只玻璃試管，分別加入內(nèi)標溶液，再分別加入5種①的探針藥孵化液；所述 的內(nèi)標溶液是，以體積比為1 1的甲醇和水作溶劑，含500ng/mL褪黑素和lOOng/mL克倫 特羅的甲醇-水溶液；③再加入體積比為1 1的甲醇水溶液和蒸餾水，振搖；④再加入體積比為乙酸乙酯異丙醇=95 5的溶液，渦流，振蕩，離心；⑤分離④中上清液于干凈IOmL玻璃試管中，氮氣下吹干；⑥將⑤中的得到的殘留物用流動相溶解；
(3)探針藥物代謝產(chǎn)物的測定探針藥物代謝產(chǎn)物測定的條件是①色譜條件Agilent 1100高效液相色譜輸液泵，Agilent 1100自動進樣器；色 譜柱Zorbax SB-Aq柱，150_X4. 6_ I. D.，5 μ m粒徑；流動相含0. 1 %甲酸的乙腈和含 0. 甲酸的水，梯度洗脫，見表1 ；柱溫40°C ；流速l.OmL/min ；表1梯度洗脫程序
權利要求
1. 一種同時測定五種CYP450酶探針藥代謝產(chǎn)物的檢測方法，所述的五種CYP450酶是 CYP1A2, CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9、CYP2C19 ；主要有以下三個步驟(1)肝微粒體的制備及孵化首先制備大鼠肝微粒體；分別選擇非那西丁、咪達唑侖、異喹胍、甲苯磺丁脲和美芬妥 英作為五種CYP450酶的探針藥物，分別建立五種探針藥物孵化體系；將肝微粒體分別與五 種探針藥物進行孵化反應，使這五種探針藥物在其特異性酶的作用下分別轉化成對乙酰氨 基酚、4’ -羥基異喹胍、1’ -羥基咪達唑侖、4’ -羥基甲苯磺丁脲和4’ -羥基美芬妥英；(2)樣品預處理樣品預處理按下述步驟操作，①孵化反應終止后，取反應液，立即加入冰冷甲醇；②取5只玻璃試管，分別加入內(nèi)標溶液，再分別加入5種①的探針藥孵化液；所述的內(nèi) 標溶液是，以體積比為1 1的甲醇和水作溶劑，含500ng/mL褪黑素和lOOng/mL克倫特羅 的甲醇-水溶液；③再加入體積比為1 1的甲醇水溶液和蒸餾水，振搖；④再加入體積比為乙酸乙酯異丙醇=95 5的溶液，渦流，振蕩，離心；⑤分離④中上清液于干凈IOmL玻璃試管中，氮氣下吹干；⑥將⑤中的得到的殘留物用流動相溶解；(3)探針藥物代謝產(chǎn)物的測定探針藥物代謝產(chǎn)物測定的條件是①色譜條件=Agilent 1100高效液相色譜輸液泵，Agilent 1100自動進樣器；色譜柱 Zorbax SB-Aq柱，15(toimX 4. 6讓I. D.，5 μ m粒徑；流動相含0. 1 %甲酸的乙腈和含0. 1 % 甲酸的水，梯度洗脫，見表1 ；柱溫40°C ；流速1. OmL/min ；表1梯度洗脫程序時間(miη)0. 000. 503. 004. 505. 006. 008. 00水(V0Zo )80802010108080乙腈(ν% )20208090902020②質譜條件API4000型三重四極桿串聯(lián)質譜儀，配有離子噴霧離子源以及Analyst 1. 3數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；離子噴射電壓為5000V ；溫度為500°C;源內(nèi)氣體1 =N2為60p. s. i.，氣體 2 =N2為65p. s. i.，氣簾氣體=N2為20p. s. i.；檢測方式正離子檢測；掃描方式選擇反應 監(jiān)測方式，用于定量分析的離子反應分別為對乙酰氨基酚m/z 152.3 —m/z 110.2，4’_羥 基異喹胍 m/z 192. O —m/z 132. 1，1，-羥基咪達唑侖 m/z 342. 3 — m/z 203. 2，4，-羥基 甲苯磺丁脲m/z 287.4 —m/z 171. 1，4，-羥基美芬妥英m/z 235. 4 - m/z 150. 0，內(nèi)標褪黑 素 m/z 233. 2 — m/z 174. 1，內(nèi)標，克倫特羅 m/z 277. 2 — m/z 203. 1 ；DP 電壓分別為 53V、 35V、70V、36V、50V、37V、50V ；CE 分別為 22eV、26eV、36eV、24eV、26eV、19eV，22eV。
2.根據(jù)權利要求1所述的同時測定五種CYP450酶探針藥代謝產(chǎn)物的檢測方法，其特 征在于，所述的步驟(1)的肝微粒體的孵化，孵化體系的組成為大鼠肝微粒體蛋白l.Omg/ mL、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸1. Ommol/L, MgCl2IO. Ommol/L, KCl 10. Ommol/L、和用體積 比甲醇水=1 1配制的探針藥物；以pH 7. 4的0. lmol/L的1Tris-HCl緩沖液定容至 500 μ L，孵化體系中甲醇的終濃度< 0. 01 %。
3.根據(jù)權利要求1所述的同時測定五種CYP450酶探針藥代謝產(chǎn)物的檢測方法，其特征 在于，所述的步驟( 樣品預處理中，步驟①為孵化反應30min后，取反應液IOOyL,立即加入100 μ L冰冷甲醇； 步驟②為取5只IOmL玻璃試管，分別加入IOOyL的內(nèi)標溶液，再分別加入5種探針 藥的①孵化液各IOOyL;步驟③為加50 μ L甲醇水溶液和200 μ L蒸餾水，振搖20下； 步驟④為加入3mL乙酸乙酯異丙醇=95 5的溶液，渦流aiiin，振蕩lOmin， 3500rpm 下離心 5min ；步驟⑤為分離④中上清液在40°C氮氣下吹干；步驟⑥為將⑤中的得到的殘留物用150 μ L流動相溶解，取30 μ L用于測定。
全文摘要
本發(fā)明的同時測定五種CYP450酶探針藥代謝產(chǎn)物的檢測方法，屬于醫(yī)藥檢測的技術領域。CYP450酶分多種亞型，每種亞型酶的特異性底物可作為探針藥用于評價該種酶的活性。將探針藥與肝微粒體共孵育得到相應的代謝產(chǎn)物，通過高效液相色譜-質譜聯(lián)用法同時檢測多種P450酶的探針藥物的代謝物，即可同時評價幾種酶的活性。本發(fā)明方法主要包括以下步驟(1)肝微粒體的孵化；(2)樣品預處理；(3)探針藥物代謝產(chǎn)物的測定。本發(fā)明提供的檢測方法，線性關系良好、準確度高、重現(xiàn)性好而且靈敏、可靠，可用于各種藥物對P450酶誘導、抑制的評價。
文檔編號C12Q1/25GK102080122SQ20101055968
公開日2011年6月1日 申請日期2010年11月26日 優(yōu)先權日2010年11月26日
發(fā)明者孫嚴彤, 孫熙麟, 張蕓輝, 張超, 楊艷, 顧景凱 申請人:吉林大學