專利名稱：嵌段酶－探針復(fù)合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用酶標(biāo)記探針的技術(shù)。如此產(chǎn)生的嵌段酶-探針復(fù)合物廣泛用于采用免疫反應(yīng)的免疫檢測(cè)，如酶免疫檢測(cè)、免疫組化等。
背景技術(shù)：
在免疫學(xué)檢測(cè)或測(cè)定方法中通常已廣泛使用用酶標(biāo)記探針的酶標(biāo)探針。例如，用辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(ALP)、β-半乳糖苷酶、葡糖氧化酶等標(biāo)記的探針可用于免疫組化和酶免疫測(cè)定的檢測(cè)步驟。
免疫組化和酶免疫測(cè)定已經(jīng)長期廣泛用作在活體中檢測(cè)自身抗原或外來抗原的方法。由于這些采用免疫反應(yīng)的檢測(cè)方法具有高特異性和靈敏度，可無需分離而檢測(cè)體內(nèi)的少量物質(zhì)。然而，許多物質(zhì)存在于體內(nèi)的量非常少，以致于普通的免疫組化和酶免疫測(cè)定不能檢測(cè)，已進(jìn)行了一些研究以發(fā)現(xiàn)提高檢測(cè)方法靈敏度的方法以檢測(cè)這些物質(zhì)。
例如，健康人血清中腫瘤標(biāo)記物如癌胚抗原(CEA)和甲胎蛋白的濃度為5-20ng/ml。然而，健康個(gè)體血清中人胃泌素釋放肽前體(ProGRP)的濃度約為14 pg/ml，需要高1000倍的靈敏度以檢測(cè)ProGRP。此外，對(duì)于外來抗原，例如丙肝病毒，在血液中的量很小，因此需要高靈敏度的抗原檢測(cè)方法。為了檢測(cè)該抗原，需要可檢測(cè)100-1000個(gè)拷貝的病毒RNA和約0.03-0.3 pg/ml蛋白質(zhì)濃度的靈敏度水平。
為提高免疫檢測(cè)方法的靈敏度以檢測(cè)以這樣的微量存在于體內(nèi)的抗原或物質(zhì)，已經(jīng)進(jìn)行了多種努力。Ishikawa等(非專利文獻(xiàn)1)詳細(xì)描述了對(duì)提高酶免疫檢測(cè)靈敏度的研究。影響酶免疫檢測(cè)靈敏度的因素包括檢測(cè)系統(tǒng)類型、標(biāo)記的檢測(cè)靈敏度、標(biāo)記方法的類型、免疫反應(yīng)時(shí)間以及抗原和抗體間的親和力。此外，影響用夾心法測(cè)定抗原的靈敏度提高的條件包括抗體與固相連接的條件；抗原反應(yīng)效率；酶標(biāo)抗體的反應(yīng)效率；標(biāo)記抗體與固相的非特異性吸附的降低；標(biāo)記抗體的添加量；免疫反應(yīng)時(shí)間；溫度、pH、離子強(qiáng)度和免疫反應(yīng)緩沖液的選擇；立體化學(xué)構(gòu)型和抗原決定基團(tuán)的數(shù)量。
除了上述研究以外，為了提高酶免疫檢測(cè)的靈敏度，人們努力在檢測(cè)步驟中在酶和抗體的交聯(lián)方面改進(jìn)標(biāo)記方法。已知制備標(biāo)記抗體的各種方法，具體地說，Ishikawa等報(bào)道的制備標(biāo)記抗體的方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于普通診斷試劑。在通常所述方法中，一至幾個(gè)酶主要結(jié)合于抗體(在IgG的情況下，分子量約為150,000，在Fab’的情況下，分子量約為46,000)，例如其中三個(gè)辣根過氧化物酶(HRP)(分子量40,000)分子與一個(gè)IgG分子結(jié)合在一起的復(fù)合物的總分子量為40,000×3+150,000＝270,000。同時(shí)，其中三個(gè)堿性磷酸酶(ALP)分子(分子量100,000)與一個(gè)IgG分子結(jié)合在一起的復(fù)合物的總分子量為100,000×3+150,000＝450,000。然而，Ishikawa等的描述顯示，優(yōu)選通過以1個(gè)分子∶1個(gè)分子的比例將抗體結(jié)合于酶，尤其是采用去除Fc部分后的Fab’部分，實(shí)現(xiàn)靈敏度最高的測(cè)定，并開發(fā)了一種將一個(gè)抗體分子共價(jià)連接于一個(gè)酶分子方法(非專利文件2)。在酶與抗體1∶1結(jié)合的抗體酶標(biāo)記法的情況下，例如共價(jià)連接的一個(gè)HRP分子和1個(gè)Fab’分子的復(fù)合物的總分子量為40,000+46,000＝86,000。通常，主要采用總分子量為200,000或更小的酶標(biāo)記復(fù)合物。
為了開發(fā)高靈敏度的免疫檢測(cè)方法，以各種方式試驗(yàn)了通過增加步驟以增強(qiáng)信號(hào)。例如，采用生物素和抗生物素蛋白的高親和力，主要將幾個(gè)生物素分子引入第二抗體，生物素化的第二抗體與待分析物質(zhì)反應(yīng)后，去除過量的生物素化第二抗體。然后加入抗生物素蛋白-酶，形成生物素化第二抗體-抗生物素蛋白-酶復(fù)合物，并通過增加連接于第二抗體的酶分子數(shù)提高靈敏度?？梢杂每股锼氐鞍?生物素-酶復(fù)合物替代抗生物素蛋白-酶。同時(shí)，Butler等描述了作為過氧化物酶-抗過氧化物酶抗體的抗體-酶復(fù)合物(非專利文獻(xiàn)3)。Bobrow等將過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體與待分析物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)，并在去除過量過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體后，加入生物素-酪胺(tyramide)，使自由基化的生物素-酪胺與過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體周圍的封閉蛋白結(jié)合，并在洗滌后用過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白放大酶信號(hào)(非專利文獻(xiàn)4)。然而，這些方法都由缺點(diǎn)，如增加步驟數(shù)量和測(cè)定時(shí)間。
已經(jīng)報(bào)道了一種使酶結(jié)合于某種載體，并然后使抗體結(jié)合于酶聯(lián)載體以增加結(jié)合于抗體的酶分子數(shù)量的方法，并且按照這一方法，可以最少步驟提高靈敏度(專利文獻(xiàn)1)。在此方法中，將馬來酰亞胺基或巰基(SH)引入具有氨基的載體中，并將一種酶酶連接于所述載體。將馬來酰亞胺基引入抗體結(jié)合載體所留有的至少一個(gè)氨基上。由于在這種方法中抗體和酶通過載體連接，可以看出與將酶和抗體直接連接的方法相比，可連接數(shù)量更多的酶分子，并因此提高靈敏度。然而，所述發(fā)明人提到載體的分子量適合為5,000-500,000，優(yōu)選10,000-300,000。在這種情況下，例如，將辣根過氧化物酶用作所述酶時(shí)，分子量約為40,000。即使載體的分子量為500,000，能夠與分子量為500,000的分子結(jié)合的分子量為40,000的分子數(shù)量在物理上和空間上受限是正常的，因此限制了能夠結(jié)合于載體的酶分子的數(shù)量。即，當(dāng)所述載體與一種酶和一種抗體結(jié)合時(shí)，載體上的官能團(tuán)必須為酶和抗體所共享，酶分子數(shù)量減少且信號(hào)會(huì)被降低。當(dāng)更多酶分子結(jié)合于所述載體時(shí)，用于抗體結(jié)合的空間會(huì)更小，并且與抗原的反應(yīng)能力會(huì)降低。這意味著，盡管抗體和酶盡可能結(jié)合于同一載體可能會(huì)更好，根據(jù)大分子的制備過程，傾向于發(fā)生聚集和沉淀，引起導(dǎo)致靈敏度降低的更高的檢測(cè)背景。
專利文獻(xiàn)1日本專利申請(qǐng)?zhí)亻_號(hào)(KOKAI)2000-88850非專利文獻(xiàn)1超高靈敏度的酶免疫檢測(cè)方法(Ultra High Sensitive EnzymeImmunoassay Method)，Eiji Ishikawa，1993，Japan Scientific Societies Press非專利文獻(xiàn)2Imagawa等，J.Appl. Biochem.第4卷；400，1982非專利文獻(xiàn)3Butler(1981)，Methods Enzomol.，第73卷；482-523非專利文獻(xiàn)4Bobrow(1981)，J.Immunol. Methods，125，279-285發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明解決的問題本發(fā)明發(fā)明人試驗(yàn)性地按照上述專利申請(qǐng)所述制備方法制備了酶標(biāo)探針，并將其應(yīng)用于需要高靈敏度的ProGRP和HCV抗原檢測(cè)系統(tǒng)。然而，在測(cè)定微量生物物質(zhì)的檢測(cè)系統(tǒng)中，即使采用所述靈敏度高于常規(guī)探針的酶標(biāo)探針，也不一定能獲得足夠的靈敏度。因此，本發(fā)明解決的問題是提供一種高度靈敏的酶標(biāo)探針，該探針可用于高度靈敏的檢測(cè)系統(tǒng)。
解決問題的方法本發(fā)明人進(jìn)行研究以獲得一種高度靈敏的酶標(biāo)探針。結(jié)果是，本發(fā)明人產(chǎn)生了一種嵌段復(fù)合物，其中兩個(gè)或多個(gè)作為載體的分子通過與所述載體結(jié)合的酶連接起來，并且通過使探針結(jié)合于此嵌段復(fù)合物成功實(shí)現(xiàn)了所述目標(biāo)，即高度靈敏的嵌段酶-探針復(fù)合物。
即，本發(fā)明是(1)一種嵌段酶-探針復(fù)合物，其中探針分子是與作為載體的兩個(gè)或多個(gè)分子量為20,000-4,000,000的分子通過酶連接起來的復(fù)合物相偶聯(lián)。
(2)如(1)所述的嵌段酶-探針復(fù)合物，其中所述載體和所述酶分子通過該載體上的官能團(tuán)和通過氧化該酶分子中的糖鏈形成的醛基結(jié)合。
(3)如(1)或(2)所述的嵌段酶-探針復(fù)合物，其中所述載體是選自下組的一種或多種載體葡聚糖、氨基葡聚糖、聚蔗糖、糊精、瓊脂糖、支鏈淀粉、各種纖維素、殼多糖、殼聚糖、β-半乳糖苷酶、甲狀腺球蛋白、血藍(lán)蛋白、聚賴氨酸、多肽和DNA。
(4)如(1)或(2)所述的嵌段酶-探針復(fù)合物，其中所述酶是選自下組的一種或多種酶辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖氧化酶和螢光素酶。
(5)如(1)或(2)所述的嵌段酶-探針復(fù)合物，其中所述探針是選自下組的一種或多種探針抗體分子或其功能片段、蛋白A、蛋白G、蛋白L、凝集素、受體和抗生物素蛋白。
(6)如(1)-(5)中任一項(xiàng)所述的嵌段酶-探針復(fù)合物，其中兩種或多種探針偶聯(lián)。
(7)如(5)或(6)所述的嵌段酶-探針復(fù)合物，其中所述抗體分子或其功能片段是選自下組的一種或多種抗-HCV核心抗原抗體、抗胃泌素釋放肽前體抗體和它們的功能片段。
(8)如(1)-(7)中任一項(xiàng)所述的嵌段酶-探針復(fù)合物，其中所述嵌段酶-探針復(fù)合物的分子量為440,000或更高。
(9)包含(1)-(8)中任一項(xiàng)所述的嵌段酶-探針復(fù)合物的免疫檢測(cè)試劑盒或核酸檢測(cè)試劑。
(10)一種產(chǎn)生(1)-(8)中任一項(xiàng)所述的嵌段酶-探針復(fù)合物的方法，所述方法包括以下步驟通過將分子量為20,000-4,000,000的載體與酶結(jié)合形成嵌段物；和將探針偶聯(lián)于所述嵌段物。
(11)如(10)所述的方法，其中通過所述載體與所述酶分子以載體∶酶＝1∶0.1-1∶20的重量比反應(yīng)形成所述嵌段物。
此外，按照本發(fā)明(1)所述分子量為20,000-4,000,000的作為載體的兩個(gè)或多個(gè)分子的連接包括不由酶介導(dǎo)的連接。例如，可以由具有官能團(tuán)的接頭或蛋白介導(dǎo)。此外，本發(fā)明包括嵌段酶-探針復(fù)合物，其中載體、酶和探針分別通過具有官能團(tuán)的接頭分子結(jié)合。即，本發(fā)明是嵌段酶-探針復(fù)合物，其中載體通過酶或接頭互相結(jié)合，酶和探針結(jié)合于該分子，因此該復(fù)合物的一個(gè)分子中含有許多酶分子或探針分子。
可使酶結(jié)合于載體形成嵌段物，并使探針分子結(jié)合于此嵌段物，從而產(chǎn)生本發(fā)明的嵌段酶-探針復(fù)合物。也可使酶和探針結(jié)合于載體形成偶聯(lián)物、然后將該偶聯(lián)物互相連接形成嵌段復(fù)合物，從而產(chǎn)生本發(fā)明的嵌段酶-探針復(fù)合物。
在本發(fā)明中，可通過酶連接載體分子增加分子量，從而使較多的酶分子或探針與所述嵌段物結(jié)合。另一方面，由于探針結(jié)合于嵌段物表面，嵌段酶-探針復(fù)合物中很難發(fā)生位阻現(xiàn)象，因此產(chǎn)生復(fù)合物時(shí)可以不考慮探針分子的大小。對(duì)于嵌段酶-探針復(fù)合物的最終產(chǎn)物，分子量為440,000或更高的嵌段酶-探針復(fù)合物具有高效能，而且分子量為668,000或更高的嵌段酶-探針復(fù)合物具有較高靈敏度。原則上，嵌段酶-探針復(fù)合物的分子量越大，一個(gè)復(fù)合物分子上結(jié)合的酶分子越多，則靈敏度越高?？砂凑毡景l(fā)明所述方法產(chǎn)生具有大分子量的嵌段酶-探針復(fù)合物，并可采用諸如凝膠過濾等方法選擇具有較大分子量的嵌段酶-探針復(fù)合物。
雖然取決于所采用的載體、酶和探針，嵌段復(fù)合物形成后分子量可能略有不同，但任何分子量都可接受，只要嵌段酶-探針復(fù)合物不在液體中沉淀或沉積，就不應(yīng)設(shè)定分子量上限。葡聚糖用作載體時(shí)(下述實(shí)施例1和6)，就分子量而言，20,000,000根本沒有問題，并且分子量在40,000,000-100,000,000之間也沒有問題。
雖然最初是在尋找可用于免疫檢測(cè)和免疫組化領(lǐng)域的酶-探針復(fù)合物時(shí)實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明，但并不限制將該復(fù)合物應(yīng)用于其它領(lǐng)域。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明的酶標(biāo)抗體使得檢測(cè)活體內(nèi)痕量存在的抗原和蛋白質(zhì)成為可能，用常規(guī)酶標(biāo)抗體不能檢測(cè)到這些抗原和蛋白質(zhì)。采用這種酶標(biāo)抗體，可以測(cè)定以前無法測(cè)定的抗原和蛋白質(zhì)附圖簡要說明

圖1顯示了用凝膠過濾對(duì)本發(fā)明的酶-抗HCV核心抗原單克隆抗體復(fù)合物進(jìn)行分子量分析的結(jié)果；圖2顯示了采用酶-抗HCV核心抗原單克隆抗體復(fù)合物和常規(guī)的酶-抗體檢測(cè)核心抗原時(shí)靈敏度的比較結(jié)果；圖3顯示了一種單克隆抗體結(jié)合于載體-酶復(fù)合物時(shí)和兩種單克隆抗體結(jié)合于載體-酶復(fù)合物時(shí)的反應(yīng)活性；圖4顯示了其中酶的氨基被封閉并然后結(jié)合于探針的復(fù)合物和其中酶的氨基未封閉并結(jié)合于探針的復(fù)合物的反應(yīng)活性；以及圖5顯示了采用酶-抗ProGRP抗原單克隆抗體復(fù)合物和常規(guī)方法的酶-抗體檢測(cè)ProGRP時(shí)靈敏度的比較結(jié)果。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明中的所述載體不受特別限制，只要其分子量在20,000-4,000,000的范圍內(nèi)。然而，由于需要結(jié)合大量酶分子以提高靈敏度，優(yōu)選某種水平的分子量。載體的例子包括多糖、高分子量蛋白質(zhì)和肽聚合物，它們的合適分子量為20,000-20,000,000，優(yōu)選20,000-4,000,000，更優(yōu)選70,000-2,000,000。此外，采用多糖或肽聚合物時(shí)，即使分子量相同，富含側(cè)鏈的分子的信號(hào)傾向于更強(qiáng)。
本發(fā)明所述多糖載體的例子包括葡聚糖、氨基葡聚糖、聚蔗糖、糊精、瓊脂糖、支鏈淀粉、各種纖維素、殼多糖、殼聚糖、可溶性淀粉等。此外，本發(fā)明所述高分子量蛋白質(zhì)載體的例子包括β-半乳糖苷酶、甲狀腺球蛋白、血藍(lán)蛋白等。此外，聚賴氨酸以及各種肽聚合物可用作本發(fā)明所述的肽聚合物載體。
可用于本發(fā)明的酶不受特別限制，適合采用免疫檢測(cè)通常所用的辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(ALP)、β-半乳糖苷酶、葡糖氧化酶、螢光素酶等。由于所述酶結(jié)合于兩個(gè)或多個(gè)載體，或載體和探針分子，所述酶需要含有兩個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)，例如糖鏈和氨基；或兩個(gè)或多個(gè)氨基；氨基和羧基；以及巰基和氨基。
可采用任何接頭或結(jié)合方式使載體與酶結(jié)合。然而，由于所述載體與酶結(jié)合后需要使探針結(jié)合于嵌段物，所述酶或載體上必須留有官能團(tuán)。
可通過使酶分子通過肼基結(jié)合于分子量為(例如)20,000-4,000,000的載體產(chǎn)生酶分子介導(dǎo)的嵌段物，所述肼基存在于所述載體上或用合適的接頭分子引入該載體，或用合適的接頭分子引入所述酶分子中?？赏ㄟ^所述嵌段物的載體分子中或與載體連接的酶分子中的官能團(tuán)結(jié)合探針分子，產(chǎn)生所述嵌段酶-探針復(fù)合物。
類似地，可通過將引入分子量為20,000-4,000,000的載體的肼基結(jié)合于通過氧化酶分子的糖鏈產(chǎn)生的醛基以使載體結(jié)合于酶分子，然后，通過結(jié)合于通過酶分子形成的嵌段物的載體分子中或結(jié)合于載體的酶分子中的官能團(tuán)的接頭分子結(jié)合探針分子，從而產(chǎn)生嵌段酶-探針復(fù)合物。
在這種情況下，引入載體或酶的具有肼基的接頭分子可以是具有肼基(-NHNH2)的肼鹽，如硫酸肼和鹽酸肼；具有肼基的酰肼(-CO-NHNH2)；或者具有官能團(tuán)和肼基的物質(zhì)。
同時(shí)，具有官能團(tuán)如馬來酰亞胺基、琥珀酰亞胺基、羧基、巰基等的物質(zhì)可用作將載體或酶分子連接于探針分子的接頭分子。
而且，在制備酶介導(dǎo)的嵌段酶時(shí)，酶與載體的重量比優(yōu)選為0.2-10倍，更優(yōu)選0.3-5倍，雖然這取決于載體上官能團(tuán)如肼基的數(shù)量。
另一個(gè)例子是，通過氧化辣根過氧化物酶(HRP)的糖鏈制備酶介導(dǎo)的嵌段酶，它進(jìn)而結(jié)合于分子量為20,000或更高的葡聚糖，此葡聚糖上引入了肼基。為了將馬來酰亞胺基引入嵌段酶的表面，將接頭分子如N-(6-馬來酰亞胺己酰氧基)琥珀酰亞胺(EMCS)連接于載體上殘留的肼基和HRP上殘留的氨基，并與探針分子中存在的或引入探針分子的SH基團(tuán)反應(yīng)，從而制備嵌段酶-探針復(fù)合物。以此方式，利用酶分子的糖鏈以及殘留肼基和殘留氨基制備嵌段酶-探針復(fù)合物。
可用任何交聯(lián)劑使嵌段物和探針結(jié)合，并可采用任何結(jié)合方式。優(yōu)選采用在水溶液中高度穩(wěn)定的雜雙功能(heterobifunctional)交聯(lián)劑或同雙功能(homobifunctional)交聯(lián)劑。
抗體(單克隆抗體、多克隆抗體)及其片段(F(ab’)2、Fab’、Fab、F(abc’)、Fabc’等)、各種受體、各種抗生物素蛋白(抗生物素蛋白D、鏈霉抗生物素蛋白等)、蛋白A、蛋白G、蛋白L、各種凝集素(伴刀豆球蛋白A、小扁豆凝集素、植物血凝素等)、能夠結(jié)合于各種待測(cè)核酸的探針等可用作探針。
可采用結(jié)合于待分析的靶抗原或物質(zhì)的任何抗體?？捎玫鞍酌溉缥傅鞍酌负湍竟系鞍酌赣煽贵w獲得抗體片段如F(ab’)2和Fab?？贵w的重鏈(H鏈)通常通過S-S鍵互相連接，可用還原劑破壞此鍵。還原劑包括半胱胺和巰基乙醇。用還原劑將F(ab’)2切割成Fab’，以產(chǎn)生新的巰基(SH)。本發(fā)明也可采用這些抗體片段如F(ab’)2、Fab’、Fab、F(abc’)、Fabc’等。
為了以非限制性方式詳細(xì)描述本發(fā)明，下面顯示了產(chǎn)生酶-探針復(fù)合物的方法及其特征描述的例子。
實(shí)施例1用葡聚糖T2000作為載體制備酶-抗HCV核心抗原單克隆抗體復(fù)合物稱量0.3g葡聚糖T2000(平均分子量2,000,000；Amersham)，溶解于6 ml 0.1 M的磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中。加入3ml高碘酸鈉溶液并混合，將該混合物室溫靜置2小時(shí)以進(jìn)行反應(yīng)，然后進(jìn)行凝膠過濾(Sephadex G25，Amersham)，以收集空組分。將鹽酸肼(Wako Pure Chemical Industris Inc.)加入空組分以將肼引入葡聚糖。理論上，分子量為2,000,000的葡聚糖分子上最多可引入22,000個(gè)肼。稱量100mg過氧化物酶(HRP，Toyobo Co.Ltd.)，混合并溶解于3ml 0.1M碳酸氫鈉溶液中。加入1.5ml高碘酸鈉溶液并混合，將該混合物室溫靜置2小時(shí)以進(jìn)行反應(yīng)。通過凝膠過濾(SephadexG25)使該混合物脫鹽，然后加入約150mg事先獲得的葡聚糖酰肼并混合。該混合物在室溫下反應(yīng)2小時(shí)，還原后，加入甘氨酸至最終濃度為0.1M。4℃透析該混合物3次，每次4小時(shí)，以獲得嵌段的載體HRP偶聯(lián)物。由于此反應(yīng)中未結(jié)合的HRP為10％或更少，同時(shí)根據(jù)回收率，似乎約12-16個(gè)HRP結(jié)合于一個(gè)葡聚糖T2000(平均分子量2,000,000)分子。將溶解于二甲基甲酰胺(DMF)中的1mg N-(6-馬來酰亞胺己酰氧基)琥珀酰亞胺(EMCS，Dojindo Laboratories)加入5mg偶聯(lián)物中，室溫下反應(yīng)2小時(shí)，然后通過凝膠過濾(Sephadex G25)去除過量EMCS，以將馬來酰亞胺引入載體HRP偶聯(lián)物中。將1/10體積0.1 M鹽酸半胱胺溶液加入3.5mg抗HCV核心抗原單克隆抗體的F(ab’)2(由等量的c11-10 F(ab’)2和c11-14 F(ab’)2組成)的0.1M磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)中，37℃孵育該混合物90分鐘，以將F(ab’)2轉(zhuǎn)化為Fab’。對(duì)該混合物進(jìn)行凝膠過濾(Sephadex G25)，通過收集空組分獲得Fab’。此Fab’和引入了馬來酰亞胺基的載體HRP偶聯(lián)物在4℃反應(yīng)過夜，進(jìn)行凝膠過濾(Superdex 200 pg，1.6×60cm，Amersham)以去除游離的Fab’。此時(shí)，在空組分附近洗脫出本發(fā)明HRP-Fab復(fù)合物。由于此反應(yīng)中游離的Fab’占10％或更少，同時(shí)根據(jù)回收率，似乎約6-10個(gè)Fab’結(jié)合于一個(gè)葡聚糖T2000(平均分子量2,000,000)分子。將牛血清白蛋白(BSA)加入收集的組分中，至濃度為0.5％，將該混合物儲(chǔ)存于4℃。在403nm處測(cè)定這樣制備的HRP-Fab復(fù)合物的吸光度，用403nm處HRP的分子吸收系數(shù)計(jì)算復(fù)合物中HRP的濃度。
實(shí)施例2用葡聚糖T70作為載體制備酶-抗HCV核心抗原單克隆抗體復(fù)合物稱量0.3g葡聚糖T70(平均分子量70,000；Amersham)，以類似于實(shí)施例1的方式獲得HRP-Fab復(fù)合物。在403nm處測(cè)定HRP-Fab復(fù)合物的吸光度，用403nm處HRP的分子吸收系數(shù)計(jì)算復(fù)合物中HRP的濃度。
實(shí)施例3用葡聚糖T500作為載體通過改變載體與酶的比例制備酶-抗HCV核心抗原單克隆抗體復(fù)合物稱量0.3g葡聚糖T500(平均分子量500,000；Amersham)，以下述比例制備載體-酶偶聯(lián)物載體(150mg)∶酶(100mg)的重量比(0.66)，與實(shí)施例1相似；載體100mg∶三倍量的酶(300mg)的重量比(2.00)；載體100mg∶五倍量的酶(500mg)的重量比(3.33)。然后，以類似于實(shí)施例1的方式偶聯(lián)抗HCV核心抗原單克隆抗體。在403nm處測(cè)定HRP-Fab復(fù)合物的吸光度，用403nm處HRP的分子吸收系數(shù)計(jì)算復(fù)合物中HRP的濃度。
實(shí)施例4用葡聚糖T500作為載體制備酶-抗ProGRP抗體復(fù)合物稱量0.3g葡聚糖T500(平均分子量500,000；Amersham)，以類似于實(shí)施例1的方式獲得載體-Fab復(fù)合物。將溶解于DMF中的1mg EMCS加入5mg此偶聯(lián)物中，室溫下反應(yīng)2小時(shí)。然后通過凝膠過濾(Sephadex G25)去除過量EMCS，將馬來酰亞胺引入載體HRP偶聯(lián)物中。將1/10體積0.1 M鹽酸半胱胺溶液加入抗ProGRP單克隆抗體(2B10)的F(ab’)2的溶液中，37℃孵育該混合物90分鐘，以產(chǎn)生Fab’。對(duì)該混合物進(jìn)行凝膠過濾(Sephadex G25)，收集空組分以獲得Fab’。此Fab’和引入了馬來酰亞胺基的載體HRP偶聯(lián)物在4℃反應(yīng)過夜，進(jìn)行凝膠過濾(Superdex 200 pg，1.6×60cm，Amersham)。收集空組分附近的組分，與牛血清白蛋白(BSA)混合，至終濃度為0.5％，并儲(chǔ)存于4℃。在403nm處測(cè)定這樣制備的HRP-Fab復(fù)合物的吸光度，用403 nm處HRP的分子吸收系數(shù)計(jì)算復(fù)合物中HRP的濃度。
對(duì)比實(shí)施例1用常規(guī)方法制備酶-抗HCV核心抗原單克隆抗體Ishikawa等報(bào)道的制備標(biāo)記抗體的方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于普通診斷試劑。此方法(超高靈敏度的酶免疫檢測(cè)方法，Eiji Ishikawa，1993，Japan Scientific Societies Press)用作常規(guī)方法。稱量4mg HRP，并溶解于0.6ml 0.1 M的磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中。加入溶解于DMF的1mg EMCS，室溫下反應(yīng)2小時(shí)。通過凝膠過濾(Sephadex G25)去除過量EMCS，將馬來酰亞胺引入HRP的氨基。將1/10體積0.1 M鹽酸半胱胺溶液加入每個(gè)抗HCV核心抗原單克隆抗體(c11-10和c11-14)的F(ab’b)2的0.1M磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)中，37℃孵育該混合物90分鐘，以產(chǎn)生Fab’。對(duì)Fab’進(jìn)行凝膠過濾(Sephadex G25)，收集空組分。此Fab’和引入了馬來酰亞胺基的HRP在4℃反應(yīng)過夜，對(duì)該混合物進(jìn)行凝膠過濾(Superdex 200 pg，1.6×60cm)，收集HRP-Fab組分，與牛血清白蛋白(BSA)混合，至終濃度為0.5％，4℃保存。在403nm處測(cè)定這樣制備的HRP-Fab偶聯(lián)物的吸光度，用403nm處HRP的分子吸收系數(shù)計(jì)算偶聯(lián)物中HRP的濃度。
對(duì)比實(shí)施例2
用常規(guī)方法制備酶-抗ProGRP單克隆抗體以類似于對(duì)比實(shí)施例1的方式將馬來酰亞胺引入HRP的氨基中。將1/10體積0.1 M鹽酸半胱胺溶液加入抗ProGRP單克隆抗體(2B10)的F(ab’)2的0.1M磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)中，37℃孵育該混合物90分鐘，以產(chǎn)生Fab’。對(duì)Fab’進(jìn)行凝膠過濾(Sephadex G25)，收集空組分。此Fab’和引入了馬來酰亞胺的HRP在4℃反應(yīng)過夜，對(duì)該混合物進(jìn)行凝膠過濾(Superdex 200 pg，1.6×60cm)，收集HRP-Fab組分，與牛血清白蛋白(BSA)混合，至終濃度為0.5％，4℃保存。在403nm處測(cè)定這樣制備的HRP-Fab偶聯(lián)物的吸光度，用403nm處HRP的分子吸收系數(shù)計(jì)算偶聯(lián)物中HRP的濃度。
實(shí)施例5通過凝膠過濾對(duì)實(shí)施例1中制備的酶-抗HCV核心抗原單克隆抗體復(fù)合物進(jìn)行分子量分析用Sephacryl S-500 Superfine(amersham)(1.6×60)柱對(duì)實(shí)施例1中制備的酶-抗HCV核心抗原單克隆抗體復(fù)合物進(jìn)行凝膠過濾。這種Sephacryl S-500 Superfine柱主要用于分離大分子量的分子與小顆粒。根據(jù)Pharmacia的“凝膠過濾理論和實(shí)踐”(Gelfiltration theory and practice)，對(duì)于多糖而言，此柱的分級(jí)范圍是4×104-2×107。用PBS作為載體以1ml/分鐘的流速進(jìn)行凝膠過濾。收集4ml/2分鐘組分。測(cè)定403nm處的吸光度，用HRP的分子吸收系數(shù)計(jì)算HRP濃度(μg/ml)。將各組分稀釋至1μg/ml當(dāng)量的HRP濃度，研究反應(yīng)活性。檢測(cè)方法如下。
將200μl抗HCV核心抗原單克隆抗體(等量的c11-3和c11-7的混合物)以4μg/ml的濃度加入96孔微量滴定板的各孔中，4℃孵育過夜。用10mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.3)洗滌后，將350μl 0.5％的酪蛋白加入各孔，孵育2小時(shí)。加入其中重組HCV核心抗原(c11)的濃度被調(diào)整為0 fmol/L和1200 fmol/L的樣品，室溫下振蕩孵育60分鐘。用含有0.05％吐溫20的10mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.3)(洗滌溶液)洗滌6次后，加入200μl稀釋至1μg/ml HRP當(dāng)量濃度的各組分和1μg/ml HRP當(dāng)量濃度的常規(guī)制備的酶-抗體偶聯(lián)物作為第二抗體，孵育30分鐘。各孔用洗滌溶液再洗滌6次，加入200μl底物溶液(鄰苯二胺，過氧化氫)并孵育30分鐘。通過加入50μl 5N硫酸終止酶反應(yīng)，用酶標(biāo)儀(Corona MTP32)測(cè)定492nm(參比波長630nm)處的吸光度。表1和圖1顯示了各凝膠過濾組分的HRP濃度和上述檢測(cè)的結(jié)果(核心抗原1200fmol/L和0fmol/L之間吸光度的差異)。3個(gè)分子量標(biāo)記物的分子量是甲狀腺球蛋白，668,000；鐵蛋白，440,000；BSA，68,000。此外，同時(shí)測(cè)定的核心抗原為0 fmol/L和1200 fmol/L的情況下常規(guī)方法制備的1μg/ml酶-抗體偶聯(lián)物的吸光度分別為0.000和0.050。因此，常規(guī)方法測(cè)定的1200fmol/L和0fmol/L核心抗原的吸光度的差異為0.050。圖1驗(yàn)證了分子量越大，1200fmol/L核心抗原的吸光度越高。
表1

在19之后的組分中，與常規(guī)方法相比信號(hào)增加了三倍或更少，但在組分2-18中，信號(hào)增加了3倍或更多。由于甲狀腺球蛋白(分子量668,000)和鐵蛋白(分子量440,000)分別顯示出在組分17和組分18附近的峰值，這說明在分子量約為440,000或更高時(shí)本發(fā)明的效果比常規(guī)方法優(yōu)越約5.9倍或更高，在分子量約為668,000或更高時(shí)本發(fā)明的效果比常規(guī)方法優(yōu)越約7.7倍。
本實(shí)施例中葡聚糖T2000的平均分子量為2,000,000，當(dāng)14個(gè)分子量為40,000的HRP分子結(jié)合于這種載體，另有8個(gè)分子量為46,000的Fab’分子結(jié)合于這種嵌段的載體-酶時(shí)，酶-探針復(fù)合物的分子量約為2,900,000。這被認(rèn)為是本實(shí)施例中酶-探針復(fù)合物的基本單元。
另一方面，用于本實(shí)施例中凝膠過濾的Sephacryl S-500 Superfine柱的分級(jí)范圍是4×104-2×107，如表1中明確表示，包含空組分的第一組分顯示出高活性。包含空組分的第一組分含有分子量至少為2×107或更高的酶-探針復(fù)合物。由于本實(shí)施例中酶-探針復(fù)合物的基本單元的分子量是2,900,000，可以解釋為包含空組分的第一組分中存在的酶-探針復(fù)合物形成了分子量較高的酶-探針復(fù)合物，其中至少兩個(gè)或多個(gè)酶-探針復(fù)合物共價(jià)連接，這就是嵌段酶-探針復(fù)合物。
另外，用于本實(shí)施例的載體葡聚糖T2000必然含有分子量小于平均分子量2,000,000的葡聚糖和其降解產(chǎn)物。它們顯然也參與了酶-探針復(fù)合物或嵌段酶-探針復(fù)合物的形成，因此本實(shí)施例中包括分子量小于2,900,000(酶-探針復(fù)合物的基本單元的平均分子量)的酶-探針復(fù)合物。本發(fā)明中也包括它們。
實(shí)施例6改變載體與酶的比例時(shí)酶-抗HCV核心抗原單克隆抗體復(fù)合物的反應(yīng)活性采用實(shí)施例3制備的酶-抗HCV核心抗原單克隆抗體復(fù)合物，研究稀釋至2μg/ml當(dāng)量酶濃度后這些復(fù)合物的反應(yīng)活性。以下是測(cè)試方法。
將200μl抗HCV核心抗原單克隆抗體(等量的c11-3和c11-7的混合物)以4μg/ml的濃度加入96孔微量滴定板的各孔中，4℃孵育過夜。用10mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.3)洗滌后，將350μl 0.5％的酪蛋白加入各孔，孵育2小時(shí)。將重組HCV核心抗原(c11)的濃度調(diào)整為0fmol/L、25.9fmol/L、77.8fmol/L、233.3fmol/L和700fmol/L，作為樣品加入，室溫下振蕩孵育60分鐘。用含有0.05％吐溫20的10mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.3)洗滌6次后，加入稀釋至2μg/ml酶當(dāng)量濃度的各酶-抗HCV核心抗原單克隆抗體復(fù)合物，孵育30分鐘。然后用洗滌溶液洗滌各孔6次，加入200μl底物溶液(鄰苯二胺、過氧化氫)，孵育30分鐘。通過加入50μl 5N硫酸終止酶反應(yīng)，用酶標(biāo)儀(Corona MTP32)測(cè)定492nm(參比波長630nm)處的吸光度。
比較采用載體與酶重量比為0.66、2.00和3.33的載體-酶偶聯(lián)物制備的抗HCV核心抗原單克隆抗體復(fù)合物的反應(yīng)活性時(shí)，重量比為2.00和3.33的復(fù)合物的反應(yīng)活性為重量比為0.66的復(fù)合物的反應(yīng)活性的77.6％和70.5％，這表明酶量越多，反應(yīng)活性越低。即使載體∶酶重量比為2.00、3.33或更高的復(fù)合物的靈敏度仍然比常規(guī)方法高得多。然而，酶相對(duì)于載體過量存在時(shí)，因?yàn)楦嗟拿附Y(jié)合于一個(gè)載體分子，產(chǎn)生更多的作為最小單元的酶-載體。然而，推測(cè)產(chǎn)生其中最小單元通過酶互相結(jié)合的復(fù)合物如載體-酶-載體-酶-載體-酶的概率較小。就是說，正如實(shí)施例5的凝膠過濾分析中所述，本發(fā)明的酶-探針復(fù)合物的反應(yīng)活性較高可解釋為因?yàn)樾纬闪朔肿恿枯^高的酶-探針復(fù)合物，其中至少兩個(gè)或多個(gè)作為所述復(fù)合物最小單元的酶-探針復(fù)合物共價(jià)連接起來，換言之，因?yàn)樾纬闪饲抖蚊?探針復(fù)合物。
實(shí)施例7用實(shí)施例1和2中制備的酶-抗HCV核心抗原單克隆抗體復(fù)合物和常規(guī)的酶-抗體進(jìn)行核心抗原檢測(cè)的靈敏度的比較將200μl抗HCV核心抗原單克隆抗體(等量的c11-3和c11-7的混合物)以4μg/ml的濃度加入96孔微量滴定板的各孔中，4℃孵育過夜。用10mM磷酸鹽緩沖液pH7.3(PBS)洗滌后，將350μl 0.5％的酪蛋白加入各孔，孵育2小時(shí)。吸除0.5％酪蛋白后，從21870fmol/L起連續(xù)三倍稀釋重組HCV核心抗原(c11)，作為樣品加入，室溫下振蕩孵育60分鐘。用洗滌溶液洗滌6次后，以2.5μg/ml HRP加入200μl實(shí)施例1和2中制備的酶-抗HCV核心抗原單克隆抗體復(fù)合物或常規(guī)方法制備的酶-抗體，作為第二抗體，孵育30分鐘。用洗滌溶液再將各孔洗滌6次，加入200μl底物溶液(10mg鄰苯二胺、過氧化氫)，孵育30分鐘。通過加入50μl 5N硫酸終止酶反應(yīng)，用酶標(biāo)儀(Corona MTP32)測(cè)定492nm(參比波長630nm)處的吸光度。圖2顯示了結(jié)果。如果將0fmol/L和OD0.030之間的差異定為檢測(cè)限，常規(guī)的酶-抗體、實(shí)施例2的酶-抗體復(fù)合物和實(shí)施例1的酶-抗體復(fù)合物分別可檢測(cè)到約263fmol/L、約75fmol/L和約10fmol/L(0.2pg/ml)。即，本發(fā)明的靈敏度比常規(guī)方法高3.5-26.3倍。由于易于測(cè)定HCV感染以及寬范圍的病毒定量，具有更高靈敏度的此種方法的實(shí)用性得到了提高。
實(shí)施例8用其中兩種單克隆抗體結(jié)合在一起的酶-抗HCV核心抗原單克隆抗體復(fù)合物和其中兩種單克隆抗體分別結(jié)合的酶-抗HCV核心抗原單克隆抗體復(fù)合物檢測(cè)核心抗原的靈敏度的比較在實(shí)施例1或2中，兩種抗HCV核心抗原單克隆抗體{c11-10F(ab’)2和c11-14F(ab’)2}一起與嵌段載體-酶反應(yīng)。此外，這兩種單克隆抗體分別與嵌段載體-酶反應(yīng)，并制備了酶-抗HCV核心抗原單克隆抗體復(fù)合物。研究了其中兩種單克隆抗體結(jié)合在一起的制備物以及其中c11-10和c11-14單克隆抗體以1μg/ml的濃度單獨(dú)結(jié)合的制備物的反應(yīng)活性。也通過將單獨(dú)結(jié)合的c11-10單克隆抗體的制備物和單獨(dú)結(jié)合的c11-14單克隆抗體的制備物混合來研究反應(yīng)活性，其中各抗體的濃度為0.5μg/ml(共1μg/ml)。結(jié)果見圖3。
將200μl抗HCV核心抗原單克隆抗體(等量的c11-3和c11-7的混合物)以4μg/ml的濃度加入96孔微量滴定板的各孔中，4℃孵育過夜。用10mM磷酸鹽緩沖液pH7.3(PBS)洗滌后，將350μl 0.5％的酪蛋白加入各孔，孵育2小時(shí)。吸除0.5％酪蛋白后，從21870fmol/L起連續(xù)三倍稀釋重組HCV核心抗原(c11)，作為樣品加入，室溫下振蕩孵育60分鐘。用洗滌溶液洗滌6次后，加入200μl其中兩種單克隆抗體結(jié)合在一起的制備物、其中c11-10和c11-14單克隆抗體單獨(dú)結(jié)合的制備物以及等量的單獨(dú)結(jié)合的c11-10單克隆抗體制備物和c11-14單克隆抗體制備物的混合物，其HRP濃度為1μg/ml。用洗滌溶液再將各孔洗滌6次，加入200μl底物溶液(10mg鄰苯二胺、過氧化氫)，孵育30分鐘。通過加入50μl 5N硫酸終止酶反應(yīng)，用酶標(biāo)儀(CoronaMTP32)測(cè)定492nm(參比波長630nm)處的吸光度。
與單獨(dú)存在時(shí)相比，單獨(dú)結(jié)合的c11-10和c11-14單克隆抗體各為0.5μg/ml的混合物中反應(yīng)活性稍有提高(約1.2倍)。然而，與混合的制備物相比，兩種抗體結(jié)合在一起的制備物的反應(yīng)活性提高了大約2-2.5倍。因此，結(jié)合探針以使兩種或多種單克隆抗體和其片段結(jié)合于嵌段載體-酶更有效。
實(shí)施例9其中單克隆抗體特異性結(jié)合于嵌段載體-酶上的載體的酶-抗HCV核心抗原單克隆抗體復(fù)合物的反應(yīng)活性HRP中的氨基數(shù)量非常少，嘗試用氨基將馬來酰亞胺基引入HRP的Ishikawa等的結(jié)果表明，其中至多有1-3個(gè)基團(tuán)(Eiji Ishikawa，Methods for BiochemistryExperiments 27，酶標(biāo)記方法，Japan Scientific Societies Press)。用2-甲基馬來酸酐封閉HRP中的這幾個(gè)氨基后，以類似于實(shí)施例3的方式用葡聚糖T500作為載體制備載體-酶偶聯(lián)物，載體∶酶重量比為0.66，然后結(jié)合抗HCV核心抗原單克隆抗體。測(cè)定403nm處的吸光度，用403nm處HRP的分子吸收系數(shù)計(jì)算復(fù)合物中HRP的濃度。將200μl抗HCV核心抗原單克隆抗體(等量的c11-3和c11-7的混合物)以4μg/ml的濃度加入96孔微量滴定板的各孔中，4℃孵育過夜。用10mM磷酸鹽緩沖液pH7.3(PBS)洗滌后，將350μl 0.5％的酪蛋白加入各孔，孵育2小時(shí)。吸除0.5％酪蛋白后，從21870fmol/L起連續(xù)三倍稀釋重組HCV核心抗原(c11)，作為樣品加入，室溫下振蕩孵育60分鐘。用洗滌溶液洗滌6次后，以總濃度2μg/ml當(dāng)量HRP濃度加入200μl標(biāo)記抗體，孵育20分鐘。用洗滌溶液再將各孔洗滌6次，加入200μl底物溶液(10mg鄰苯二胺、過氧化氫)，孵育30分鐘。通過加入50μl 5N硫酸終止酶反應(yīng)，用酶標(biāo)儀(Corona MTP32)測(cè)定492nm(參比波長630nm)處的吸光度。作為對(duì)比參照，用類似于實(shí)施例3的方式以載體∶酶重量比0.66制備載體-酶偶聯(lián)物，并隨后結(jié)合抗HCV核心抗原單克隆抗體后使用(圖4)。
如圖4所示，其中氨基被封閉的酶-抗體復(fù)合物的反應(yīng)活性約為氨基未封閉的制備物的88.1％，因此確證，抗體僅結(jié)合于載體時(shí)能獲得足夠的反應(yīng)活性。由于本發(fā)明所述嵌段酶-抗體復(fù)合物中沒有采用大量過量的酶，抗體可結(jié)合于載體或酶，但看來作為探針的抗體僅結(jié)合于載體時(shí)顯示出了足夠的反應(yīng)活性。
實(shí)施例10采用實(shí)施例4中制備的酶-抗ProGRP單克隆抗體復(fù)合物和常規(guī)的酶-抗體的檢測(cè)靈敏度的比較將200μl抗ProGRP單克隆抗體(2B10)以5μg/ml的濃度加入96孔微量滴定板的各孔中，4℃孵育過夜。用10mM磷酸鹽緩沖液pH 7.3(PBS)洗滌兩次后，將350μl0.5％的酪蛋白加入各孔，孵育2小時(shí)。吸除0.5％酪蛋白后，從8000 pg/mL起連續(xù)三倍稀釋重組ProGRP(31-98)，作為樣品加入，37℃孵育60分鐘。用洗滌溶液洗滌5次后，以總濃度1.5μg/ml HRP加入200μl實(shí)施例4中制備的酶-抗ProGRP單克隆抗體復(fù)合物或常規(guī)方法制備的酶-抗體，作為第二抗體，孵育30分鐘。用洗滌溶液再將各孔洗滌6次，加入200μl底物溶液(10mg鄰苯二胺、過氧化氫)，孵育30分鐘。通過加入50μl 5N硫酸終止酶反應(yīng)，用酶標(biāo)儀(Corona MTP32)測(cè)定492nm(參比波長630nm)處的吸光度。結(jié)果見圖5。橫軸代表ProGRP的濃度，縱軸代表492nm處的吸光度。可以明顯看出，與常規(guī)方法制備的酶標(biāo)抗體相比，實(shí)施例4中制備的酶抗體復(fù)合物顯示出極高的信號(hào)。如果將0 pg/mL和OD0.020之間的差異定為檢測(cè)限，那么常規(guī)的酶-抗體和實(shí)施例3的酶-抗體復(fù)合物分別可檢測(cè)到約115 pg/ml和約7pg/ml。即，本發(fā)明方法的靈敏度比常規(guī)方法高16.4倍。由于健康個(gè)體的血清中ProGRP的濃度約為14 pg/ml且截止值約為50 pg/ml(Jpn.J.Cancer Res.1995，86，698-705)，用常規(guī)方法不能檢測(cè)到健康個(gè)體或一些小細(xì)胞肺癌患者的樣品中的ProGRP。通過本發(fā)明則可能檢測(cè)到常規(guī)方法檢測(cè)不到的患者和健康個(gè)體的樣品中的ProGRP，從而驗(yàn)證了本發(fā)明的有用性。
權(quán)利要求
1.一種嵌段酶-探針復(fù)合物，其中探針分子與其中兩個(gè)或多個(gè)分子量為20,000-4,000,000的作為載體的分子通過結(jié)合于所述載體的酶連接起來的復(fù)合物偶聯(lián)。
2.如權(quán)利要求1所述的嵌段酶-探針復(fù)合物，其特征在于，所述載體和酶分子通過所述載體上的官能團(tuán)和氧化所述酶分子中的糖鏈形成的醛基結(jié)合。
3.如權(quán)利要求1或2所述的嵌段酶-探針復(fù)合物，其特征在于，所述載體是選自下組的一種或多種載體葡聚糖、氨基葡聚糖、聚蔗糖、糊精、瓊脂糖、支鏈淀粉、各種纖維素、殼多糖、殼聚糖、β-半乳糖苷酶、甲狀腺球蛋白、血藍(lán)蛋白、聚賴氨酸、多肽和DNA。
4.如權(quán)利要求1或2所述的嵌段酶-探針復(fù)合物，其特征在于，所述酶是選自下組的一種或多種酶辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖氧化酶和螢光素酶。
5.如權(quán)利要求1或2所述的嵌段酶-探針復(fù)合物，其特征在于，所述探針是選自下組的一種或多種探針抗體分子或其功能片段、蛋白A、蛋白G、蛋白L、凝集素、受體和抗生物素蛋白。
6.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的嵌段酶-探針復(fù)合物，其特征在于，兩種或多種探針相偶聯(lián)。
7.如權(quán)利要求5或6所述的嵌段酶-探針復(fù)合物，其特征在于，所述抗體分子或其功能片段是選自下組的一種或多種抗-HCV核心抗原抗體、抗胃泌素釋放肽前體抗體和它們的功能片段。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的嵌段酶-探針復(fù)合物，其特征在于，所述嵌段酶-探針復(fù)合物的分子量為440,000或更高。
9.一種包含權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的嵌段酶-探針復(fù)合物的免疫檢測(cè)試劑盒或核酸檢測(cè)試劑。
10.一種產(chǎn)生權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的嵌段酶-探針復(fù)合物的方法，所述方法包括以下步驟通過將分子量為20,000-4,000,000的載體與酶結(jié)合形成嵌段物；和將探針偶聯(lián)于所述嵌段物。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，通過以載體∶酶＝1∶0.1-1∶20的重量比使所述載體與所述酶分子反應(yīng)形成所述嵌段物。
全文摘要
問題提供可用于以高靈敏度檢測(cè)活體中以極小量存在的抗原、蛋白質(zhì)等的嵌段酶標(biāo)記物復(fù)合物。解決問題的方法提供了包含嵌段的嵌段酶探針復(fù)合物，所述嵌段由兩個(gè)或多個(gè)分子量為20,000－4,000,000的分子的載體和酶的組合組成，它們通過酶或接頭結(jié)合，其中探針分子與酶結(jié)合。
文檔編號(hào)G01N33/535GK101088009SQ20058004466
公開日2007年12月12日 申請(qǐng)日期2005年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月28日
發(fā)明者青柳克己 申請(qǐng)人:株式會(huì)社先端生命科學(xué)研究所