專利名稱：利用超聲波促進酶制劑高效轉化異麥芽酮糖的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種異麥芽酮糖制備方法，具體涉及利用超聲波促進酶制劑高效轉化 異麥芽酮糖的制備方法。
背景技術：
異麥芽酮糖是蔗糖的同分異構體，含1摩爾的結晶水，分子量為360. 32，熔點 123 1M°C，甜度為蔗糖的42%，吸濕性低，耐酸解，具有還原性，不易被細菌利用，不易引起 血糖和胰島素波動等特點，是一種理想的功能甜味劑。由于在體內(nèi)吸收緩慢，可作為緩釋的 能量給體力勞動者和腦力勞動者食用。通常情況下，利用酶制劑對蔗糖進行轉化得到異麥芽酮糖?，F(xiàn)有的生物酶制劑及 生產(chǎn)工藝對蔗糖的轉化率可達到99%以上，但是異麥芽酮糖的獲得率只占85%左右，其余 為海藻酮糖等。在此基礎上，通過結晶的方式得到的異麥芽酮糖的收率只有55%左右，所得 母液難以處理。因此生產(chǎn)成本居高不下，國內(nèi)兩家企業(yè)目前都處于停產(chǎn)或半停產(chǎn)狀態(tài)。為 解決異麥芽酮糖的收率問題，一些發(fā)明人提出一些了解決方案中國專利200710190755. 2 當中，發(fā)明人徐虹等提出了利用大黃歐文氏菌制備異麥芽酮糖的方法。該方法中最多能夠 得到90%的異麥芽酮糖轉化率，仍有10%的雜糖；中國專利200910114186. 2當中，發(fā)明人 廣西投資集團維科特生物技術有限公司提出的利用酒精發(fā)酵手段除去雜糖，可使收率最高 達到85%。其中雜糖的發(fā)酵損失仍然有15%左右。發(fā)酵后，成品糖中的異味難以除去。上 述兩個專利當中，都提出了利用海藻酸鈣固定化細胞的方法。在規(guī)模化生產(chǎn)當中，這種細胞 固定化方式無法承受長時間的流體沖擊，造成海藻酸鈣球體軟化粘結，細胞脫落。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過對酶制劑及轉化液進行超聲波照射來提高異麥芽酮糖轉化 率進而提高收率。降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品的競爭力。本發(fā)明提出的利用超聲波促進酶制劑高效轉化異麥芽酮糖的方法，其工藝過程如 下
(1)菌體的發(fā)酵、培養(yǎng)和收集將為總量5 20%的菌種紅色精朊桿菌TSlOl變種以 及由下列組成的發(fā)酵培養(yǎng)基蔗糖2 8%、玉米漿廣6%、酵母浸膏0.廣2%、氯化鈉0. 0Γ0. 5%、 磷酸氫二鉀0. 0廣0. 1%和余量水，裝入發(fā)酵罐內(nèi)，裝料量為罐體積的50、0%，控制PH 6. 0 7· 5，溫度25 33°C，通氣量為通氣量/發(fā)酵罐體積=1 0. 5 1 1. 0。攪拌速度100^250 轉/分鐘。于6 12小時多次補充濃度為1(Γ60%的滅菌蔗糖溶液，總補糖量為裝料量的 5 10%，總發(fā)酵時間1(Γ30小時。發(fā)酵結束后，通過離心工序回收得到細胞濃漿。離心采用 1000(Γ20000轉/分鐘的離心機分離。整個回收細胞濃漿的過程中，控制溫度為15 25°C ； (2)菌體的包埋固定化及轉化罐將步驟(1)所得到的細胞濃漿IOmL與IOmL質量分 數(shù)為2 4%的海藻酸鈉溶液以及10(Tl000mg的玻璃纖維粉(50 1000 Mm左右)混合，用注射 器滴加到200mL 0. 2mol/L的CaCl2溶液中，25 30°C下靜置固化2小時后，過濾洗滌。將顆粒體移至200mL質量分數(shù)為0. Γ0. 2%的戊二醛溶液中，于33 37°C交聯(lián)2小時后，過濾洗滌 后，得到球狀固定化酶。將固定化酶裝入轉化罐中并固定好，始終保持無污染狀態(tài)。轉化罐 中設置有超聲波發(fā)射器，可發(fā)射一定頻率及強度的超聲波，頻率及強度可根據(jù)需要調整設 定；
(3)蔗糖轉化及成品用濃度30 60%的蔗糖溶液將轉化系統(tǒng)充滿，在25 35°C、PH為 5 7、超聲波照射頻率18 150Hz以及強度廣lOOOW/cm2的條件下，轉化3 30小時，將蔗糖轉 化為異麥芽酮糖，使異麥芽酮糖轉化率達到98%以上。然后將轉化液放出，經(jīng)脫色、過濾、離 子交換，并濃縮至5(Γ75%的濃度，然后進行噴霧造?；蚪Y晶及干燥等常規(guī)工序得到成品。 如果對濃縮液直接加晶種噴霧造粒，則沒有母液產(chǎn)生，全部為成品。如果采用降溫式結晶罐 結晶，雖有母液產(chǎn)生，但母液仍可循環(huán)利用；
(4)轉化罐中的固定轉化酶可重復使用，加入蔗糖液重復上面的條件，便可繼續(xù)轉 化。通常，本發(fā)明所述的固定轉化酶的使用周期為3(Γ90天。到期后重復步驟(1)和(2)， 更換新酶。
所述的紅色精朊桿菌PR0TAMIN0BACT0R RUBER為美國菌種保藏中心提供的代號為 ATCC8457的菌種。所述的紅色精朊桿菌TSlOl變種的制備方法通過蔗糖馴化和誘導使紅 色精朊桿菌產(chǎn)生高酶活的α —葡萄糖基轉移酶。該菌種具有高效穩(wěn)定、超聲波耐受性強、超 聲波下轉化方向性好的特點。本發(fā)明的優(yōu)點
(1)通過對酶制劑及轉化液進行超聲波照射來提高異麥芽酮糖轉化率進而提高收率。 將98%以上的蔗糖地轉化為異麥芽酮糖，沒有副產(chǎn)物，收率達到100%。(2)可將轉化液直接進行噴霧干燥，避免了結晶分離等過程。(3)給出了具有超聲波耐受性的轉化用菌種以及增強的細胞固定化方法。


圖1是本發(fā)明的異麥芽酮糖的制備工藝原理圖。 圖中E-I為轉化罐，Ε-2為循環(huán)泵，Ε-3為換熱器。如圖1所示，在生物轉化反應器固定化酶制劑區(qū)域設置超聲波發(fā)射器。超聲波在 酶制劑區(qū)域促進酶制劑將蔗糖轉化成異麥芽酮糖。循環(huán)泵使轉化液在反應器內(nèi)循環(huán)，循環(huán) 時經(jīng)過酶制劑。換熱器調節(jié)轉化液溫度。
菌種紅色精朊桿菌TSlOl目前已于2010年11月25日在中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏編號為4365。
具體實施例方式實施例1
1.將紅色精朊桿菌TSlOl變種從斜面菌種活化至三級搖瓶種，每次加入量是總量的 10%，再轉入IOL種子罐發(fā)酵培養(yǎng)10小時，轉至100L發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)12小時，種子罐與發(fā) 酵罐的參數(shù)相同。發(fā)酵液組成蔗糖6%、玉米漿5%、酵母膏0. 5%、氯化鈉0. 1%、磷酸氫二鉀 0.1%、其余為水，PH 6. 8，裝料量60%、通氣量為1: 0.8，補糖時間為第8小時，補糖量為發(fā)酵 體積的5%，總發(fā)酵時間為12小時；
2.用離心機將上一步所得的發(fā)酵液離心分離獲得細胞濃漿，離心機轉數(shù)15000轉/ 分，收集得2L細胞濃漿；
3.將步驟2所的到細胞濃漿2L與2L質量分數(shù)為21的海藻酸鈉溶液以及50g的玻璃 纖維粉混合，用注射器滴加到40L 0. 2mol/L的&(12溶液中，25 30°C下靜置固化2小時后， 過濾洗滌。將顆粒體移至40L質量分數(shù)為0.15%的戊二醛溶液中，于33 37°C交聯(lián)2小時 后，過濾洗滌后，得到球狀固定化酶4L。將固定化酶裝入容積為IOL的轉化罐中并固定好， 始終保持無污染狀態(tài)。轉化罐中設置有超聲波發(fā)射器，可發(fā)射一定頻率及強度的超聲波，頻 率及強度可根據(jù)需要調整設定；
4.用蔗糖5kg及去離子水配置50%濃度的蔗糖溶液10L，90°C消毒10分鐘，冷卻到 30 0C ；
5.將第4步得到的蔗糖溶液加入到轉化罐及系統(tǒng)中，使系統(tǒng)充滿。系統(tǒng)包括轉化罐、 固定化酶制劑、循環(huán)泵、超聲波發(fā)射器、換熱器等，系統(tǒng)有效容積為10L，如圖1所示。維持 轉化溫度^ 30°C，控制循環(huán)泵流量在廣2L/分鐘，保持轉化罐內(nèi)超聲波頻率20Hz、超聲波 強度30W/cm2，當蔗糖轉化率達到99%以上時，將轉化液全部放出，測得異麥芽酮糖含量達到 98. 0%，其它為海藻酮糖；
6.將上一步所得轉化液脫色過濾后，經(jīng)離子交換使電導率達到30以下；
7.按比例連續(xù)加入晶種500g，噴霧干燥床中對精制后的轉化液進行噴霧干燥，得到粉 末狀異麥芽酮糖成品5. 5kg ；
8.重復第4飛步80次，所得轉化液異麥芽酮糖含量平均值為98.0%。酶制劑顆粒情況 正常，沒有通常的顆?？逅图毎撀洮F(xiàn)象。
實施例2
本實施例的前4步與實施例1相同，第5步的其它條件也與實施例1相同，只有超聲波 條件有變化。將超聲波頻率調整到20Hz、強度調整到45W/cm2，當蔗糖轉化率達到99%以上 時，將轉化液放出，測得異麥芽酮糖含量達到98. 3%。實施例3
本實施例的前4步與實施例1相同，第5步的其它條件也與實施例1相同，只有超聲波 條件有變化。將超聲波頻率調整到30Hz、強度調整到45W/cm2，當蔗糖轉化率達到99%以上 時，將轉化液放出，測得異麥芽酮糖含量達到98. 7%。實施例4
將實施例1中第3步玻璃纖維粉調整為30g，其它步驟不變，在第8步中轉化80次時， 固定化酶制劑已經(jīng)粘連成塊。異麥芽酮糖平均轉化率也只有95%。
權利要求
1.本發(fā)明是一種利用超聲波促進酶制劑高效轉化異麥芽酮糖的方法，其特征包括以下 步驟(1)菌體的發(fā)酵、培養(yǎng)和收集將為總量廣20%的菌種紅色精朊桿菌TSlOl變種以及 由下列組成的發(fā)酵培養(yǎng)基蔗糖2、％、玉米漿廣6%、酵母浸膏0.廣2%、氯化鈉0. 0Γ0. 5%、 磷酸氫二鉀0. 0廣0. 1%和余量水，裝入發(fā)酵罐內(nèi)，裝料量為罐體積的50、0%，控制PH 6. 0 7· 5，溫度25 33°C，通氣量為通氣量/發(fā)酵罐體積=1 0. 5 1 1. 0 ；攪拌速度100^250 轉/分鐘；于6 12小時多次補充濃度為1(Γ60%的滅菌蔗糖溶液，總補糖量為裝料量的 5 10%，總發(fā)酵時間1(Γ30小時；發(fā)酵結束后，通過離心工序回收得到細胞濃漿；離心采用 1000(Γ20000轉/分鐘的離心機分離；整個回收細胞濃漿的過程中，控制溫度為15 25°C ；(2)菌體的包埋固定化及轉化罐將步驟(1)所得到的細胞濃漿IOmL與IOmL質量分數(shù) 為2 4%的海藻酸鈉溶液以及10(Tl000mg玻璃纖維絲粉(50 1000 Mm左右)混合，用注射 器滴加到200mL 0. 2mol/L的CaC12溶液中，25 30°C下靜置固化2小時后，過濾洗滌；將顆 粒體移至200mL質量分數(shù)為0. Γ0. 2%的戊二醛溶液中，于33 37°C交聯(lián)2小時后，過濾洗滌 后，得到球狀固定化酶；將固定化酶裝入轉化罐中并固定好，始終保持無污染狀態(tài)；轉化罐 中設置有超聲波發(fā)射器，可發(fā)射一定頻率及強度的超聲波，頻率及強度可根據(jù)需要調整設 定；(3)蔗糖轉化及成品用濃度30 60%的蔗糖溶液將轉化系統(tǒng)充滿，在25 35°C、PH為 5 7、超聲波照射頻率18 150Hz，強度廣lOOOW/cm2的條件下，轉化;Γ30小時，將蔗糖轉化為 異麥芽酮糖，使異麥芽酮糖轉化率達到98%以上；然后將轉化液放出，經(jīng)脫色、過濾、離子 交換，并濃縮至5(Γ75%的濃度，然后進行噴霧造?；蚪Y晶及干燥等常規(guī)工序得到成品；如 果對濃縮液直接加晶種噴霧造粒，則沒有母液產(chǎn)生，全部為成品；如果采用降溫式結晶罐結 晶，雖有母液產(chǎn)生，但母液仍可循環(huán)利用；轉化罐中的固定轉化酶可重復使用，加入蔗糖液 重復上面的條件，便可繼續(xù)轉化；通常，本發(fā)明所述的固定轉化酶的使用周期為3(Γ90天； 到期后重復步驟(1)和(2 )，更換新酶。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)所述的紅色精朊桿菌TS101變種 是通過蔗糖馴化和誘導使紅色精朊桿菌產(chǎn)生高酶活的α—葡萄糖基轉移酶；該菌種具有 高效穩(wěn)定、超聲波耐受性強、超聲波下轉化方向性好的特點。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)所述的在生物轉化反應器固定化 酶制劑區(qū)域設置超聲波發(fā)射器；超聲波設置在酶制劑區(qū)域促進酶制劑將蔗糖轉化成異麥芽 酮糖。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)所述的在制備固定化酶制劑顆粒 時，加入5(Tl000Mffl左右的玻璃纖維絲粉，混入海藻酸鈣骨架中，增加顆粒強度，以適應超 聲波照射下的耐久性和對超聲波的傳導性。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)所述的玻璃纖維絲粉的加入量為 IOO^lOOOmg ；這是在由步驟(1)所得細胞濃漿為IOmL體系下的加入量；若所得細胞濃漿體 積有變，則按比例相應調整玻璃纖維絲粉的加入量；玻璃纖維絲粉的加入量會影響異麥芽 酮糖的轉化率。
6.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(3)所述的超聲頻率及強度設置為超 聲波照射頻率18 150Hz，強度廣lOOOW/cm2。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用超聲波促進酶制劑高效轉化異麥芽酮糖的方法，其特點是通過對酶制劑及轉化液進行超聲波照射來提高異麥芽酮糖轉化率進而提高收率，無母液等副產(chǎn)物。同時給出具有超聲波耐受性的轉化用菌種以及增強的細胞固定化方法。本發(fā)明首先發(fā)酵紅色精朊桿菌并收集菌體，然后對菌體固定化用于蔗糖的轉化，在轉化過程中使用超聲波照射，再將該蔗糖轉化液進行脫色、過濾、離子交換、濃縮和結晶或噴霧造粒，干燥后得到異麥芽酮糖成品。本發(fā)明的方法可將98%以上的蔗糖地轉化為異麥芽酮糖，沒有副產(chǎn)物，實際收率可達到100%。這大幅度地降低了生產(chǎn)成本，從而提高了產(chǎn)品的競爭力。
文檔編號C12P19/12GK102071235SQ20101056079
公開日2011年5月25日 申請日期2010年11月26日 優(yōu)先權日2010年11月26日
發(fā)明者范志剛 申請人:上海健源碳水化合物有限公司