專利名稱：一種微生物轉化制備s-(+)-3-羥基丁酸甲酯的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種微生物轉化制備S-(+)-3-羥基丁酸甲酯的方法，特別涉及一種 以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No. 2266為生物催化劑，以乙酰乙酸甲酯 為底物制備S-(+)-3-羥基丁酸甲酯的方法。
背景技術：
S- (+) -3-羥基丁 酸甲酯((S) - (+) -methyl 3-hydroxybutyrate)，CAS 登錄號 53562-86-0，分子式C5HltlO3,分子量118. 13?？捎糜诠鈱W活性聚β _羥基丁酸酯P [ (R) _HB] 的合成，Pt(R)-HB]是細菌細胞內(nèi)的一類生物聚酯，具有良好的生物降解性，其分解產(chǎn)物可 全部為生物利用，對環(huán)境無任何污染，其熔融溫度為175 180°C，是一種可完全分解的熱 塑性塑料?？梢宰鳛槭中灾虚g體用于藥物合成。拆分外消旋體3-羥基丁酸甲酯，可以獲得S- (+) -3-羥基丁酸甲酯，但是拆分效率 最大只有50%，生產(chǎn)效率不高。以乙酰乙酸甲酯為底物采用化學法和微生物法不對稱還原 底物中的羰基均可以得到S-(+)-3-羥基丁酸甲酯?；瘜W法不對稱還原需要制備手性化學 催化劑，價格昂貴，制備過程繁瑣。采用微生物法不對稱還原乙酰乙酸甲酯可以獲得對映體 過剩值較高的光學純S-(+)-3-羥基丁酸甲酯，反應條件溫和，環(huán)境友好，成本低廉，易于實 現(xiàn)輔酶的原位再生，微生物易于大規(guī)模培養(yǎng)，易于工業(yè)化生產(chǎn)，是S-(+)-3-羥基丁酸甲酯 的綠色合成工藝。大量的文獻報道采用各種類型的鎳催化劑催化乙酰乙酸甲酯的不對稱加氫反應 制備S-(+)-3-羥基丁酸甲酯，該過程中催化劑的制備較為繁瑣，成本較高。采用微生物轉 化法不對稱還原乙酰乙酸甲酯制備S-(+)-3-羥基丁酸甲酯的工藝過程未見專利和文獻報 道，是一種高效、節(jié)能、環(huán)保的S-(+)-3-羥基丁酸甲酯的合成工藝。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種微生物轉化制備S-(+)_3-羥基丁酸甲酯的方法，該方法 反應條件溫和，操作簡便，環(huán)境友好，產(chǎn)物轉化率高，易于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明采用的技術方案是—種微生物轉化制備S-(+)_3-羥基丁酸甲酯的方法，所述方法是以乙酰乙酸甲 酯為底物，以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CGMCC No. 2266發(fā)酵獲得的含酶菌體 細胞為生物催化劑，進行轉化反應制得所述S-(+)-3-羥基丁酸甲酯。本發(fā)明所述的微生物轉化制備S-(+)_3-羥基丁酸甲酯的方法為在pH5. 0 8. 0 的磷酸鹽緩沖液中，以乙酰乙酸甲酯為底物、以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CGMCC No. 2266發(fā)酵獲得的含酶菌體細胞為生物催化劑，于25 45°C下轉化反應8 40 小時，反應結束后，轉化液經(jīng)分離純化得到所述S- (+) -3-羥基丁酸甲酯。所述的乙酰乙酸甲酯在磷酸鹽緩沖液中的初始終濃度為0. 01 0. 10mol/Lo進一步，本發(fā)明所述的磷酸鹽緩沖液中還添加有終濃度為10 150g/L的葡萄糖作為輔助底物，有利于提高底物的摩爾轉化率。所述的含酶菌體細胞用量以細胞干重計為1 70g/g底物，這里所述的底物的量 即乙酰乙酸甲酯的質(zhì)量；所述含酶菌體細胞干重的測定是將發(fā)酵液離心分離后，棄去上清 液，將濕細胞在120°C烘干48小時至恒重，測定干細胞的重量；取部分發(fā)酵液中離心所得濕 細胞測定細胞干重，計算出發(fā)酵液中單位含酶菌體細胞中干細胞比率，再以這個比率計算 定量細胞干重所需含有含酶菌體細胞發(fā)酵液用量。所述的含酶菌體細胞按照以下方法制備將釀酒酵母CGMCC No. 2266接種至發(fā)酵 培養(yǎng)基中，搖床轉速為150 200r/minJ6 35°C下培養(yǎng)18 30h，將發(fā)酵液離心，制得含 酶菌體細胞。所述的S-(+)_3-羥基丁酸甲酯分離純化方法如下反應結束后，將轉化液4000r/ min離心20分鐘，棄去菌體沉淀，將上清液用等體積乙酸乙酯連續(xù)萃取3次，合并乙酸乙酯 萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入無水硫酸鈉除去水分，抽濾，濾液蒸餾除去乙酸乙酯，即 得所述S- (+) -3-羥基丁酸甲酯。本發(fā)明所述的S-(+)_3-羥基丁酸甲酯制備方法推薦按照以下步驟進行(1)斜面 培養(yǎng)將釀酒酵母CGMCC No. 2266接種到斜面培養(yǎng)基，26 35°C培養(yǎng)4 6天得菌體斜面； 所述的斜面培養(yǎng)基終濃度組成為麥芽汁5 15g/L，酵母粉2 4g/L，蛋白胨4 6g/L， 葡萄糖7 12g/L，瓊脂15 25g/L，自然pH值，溶劑為水；(2)種子培養(yǎng)從菌體斜面取一 接種環(huán)菌體轉接到種子培養(yǎng)基，搖床轉速為150 200r/minJ6 35°C培養(yǎng)18 2 得種 子液；所述的種子培養(yǎng)基終濃度組成為葡萄糖26 32g/L，酵母粉2 4g/L，硫酸銨3 6g/L，無水 MgSO4O. 2 0. 4g/L, K2HPO4 · 3Η20 0· 5 1. 5g/L, KH2PO4O. 6 1. 5g/L，用 NaOH 或HCl溶液調(diào)整液體培養(yǎng)基的pH值為7. 0，溶劑為水；(3)發(fā)酵培養(yǎng)取種子液，以體積分 數(shù)10 20%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床轉速為150 200r/min，26 35°C培養(yǎng) 18 30h，將發(fā)酵液離心分離得到所述含酶菌體細胞；所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為葡萄 糖 26 32g/L，酵母粉 2 4g/L，硫酸銨 3 6g/L，無水 MgSO4O. 2 0. 4g/L，K2HPO4 · 3H20 0· 5 1. 5g/L, KH2PO4O. 6 1. 5g/L，用NaOH或HCl溶液調(diào)整液體培養(yǎng)基的pH值為7. 0，溶 劑為水；(4)生物轉化在pH 5. 0 8. 0的磷酸鹽緩沖液中，添加10 150g/L的葡萄糖作 為輔助底物，加入0. 01 0. 10mol/L的乙酰乙酸甲酯，以及細胞干重質(zhì)量為乙酰乙酸甲酯 1 50倍的菌體細胞，25 45°C下轉化反應8 40小時，得轉化液；(5)分離純化反應結 束后，將轉化液于4000r/min離心20分鐘，棄去菌體沉淀，將上清液用等體積乙酸乙酯連續(xù) 萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入無水硫酸鈉除去水分，抽濾，濾 液蒸餾除去乙酸乙酯，即得所述S-(+)-3-羥基丁酸甲酯。釀酒酵母CGMCC No. 2266，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物保 藏中心，位于北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學院微生物研究所內(nèi)，保藏號CGMCC No. 2266，保 藏日期2007年11月沈日，已在先前授權專利200810059686中作為新菌株予以保護。菌株來源本發(fā)明中所述的微生物菌株釀酒酵母CGMCC No. 2266是從杭州西湖啤 酒廠附近的土壤中篩選得到。將土壤中分離得到的菌株用于轉化乙酰乙酸甲酯，得到釀酒 酵母CGMCC No. 2266具有良好的轉化乙酰乙酸甲酯生產(chǎn)S_(+)_3_羥基丁酸甲酯的能力。所述釀酒酵母CGMCC No. 2266的菌落特征在瓊脂培養(yǎng)基上呈現(xiàn)出乳白色、有光 澤、平坦、邊緣整齊、濕潤、表面光滑，質(zhì)地均勻的菌落形態(tài)。
所述的S- (+) -3-羥基丁酸甲酯純品可用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測，確定產(chǎn)物的 純度和分子量。摩爾轉化率和產(chǎn)物S-(+)-3-羥基丁酸甲酯的對映體過剩值(ee% )的確定采用氣相色譜分析檢測。色譜柱為Varian CP Chirasil-DEX手性柱。該手性柱 可以檢測到R-(-)-3-羥基丁酸甲酯和S-(+)-3-羥基丁酸甲酯兩種對映體的含量，進一步 計算出反應的摩爾轉化率和S-(+)-3-羥基丁酸甲酯的對映體過剩值(ee% )。本發(fā)明中采用微生物細胞不對稱還原乙酰乙酸甲酯制備S-(+)_3-羥基丁酸甲 酯，可以獲得高對映體過剩值的產(chǎn)品，添加10 150g/L的葡萄糖作為輔助底物有利于提高 底物的摩爾轉化率。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明采用的微生物轉化法制備 S-(+)-3-羥基丁酸甲酯與化學合成法、酶催化法相比具有以下優(yōu)點(1)生產(chǎn)菌株安全無 毒，微生物菌體易于大規(guī)模培養(yǎng)；( 可以獲得大量的生物催化劑，比化學催化劑成本低 廉；(3)反應條件溫和，環(huán)境友好；(4)操作簡便，反應過程中不需要添加價格昂貴的輔酶； (5)易于實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，摩爾轉化率高，是S-(+)-3-羥基丁酸甲酯的綠色合成工 藝。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于 此斜面培養(yǎng)基配制麥芽汁10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，瓊脂 20g/L,自然pH值，溶劑為水；121°C滅菌20min，滅菌后冷卻制成斜面。種子和發(fā)酵培養(yǎng)基配制葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，硫酸銨5g/L，無水 MgSO4O. 25g/L，K2HPO4 · 3H20 lg/L，KH2PO4lg/L,溶劑為水，用 NaOH 或 HCl 溶液調(diào)整液體培養(yǎng) 基的PH值為7. 0，121°C滅菌20min。實施例1將釀酒酵母CGMCC No. 2266菌種接種至斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)4 6天制得菌體 斜面。用接種針從菌體斜面取一接種環(huán)菌體接種在含有IOOmL液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶 中，于30°C、180r/min的條件下培養(yǎng)24h獲得種子液。將IOmL種子液(接種量為液體培養(yǎng) 基體積用量10% )接種于含有IOOmL液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于30°C、180r/min的 條件下培養(yǎng)24h獲得發(fā)酵液，發(fā)酵液離心，得含酶菌體細胞。菌體干重的測定是將發(fā)酵液離心后從濕細胞中取小部份在120°C烘干48小時至 恒重，測定干細胞的重量，計算出發(fā)酵液中單位含酶菌體細胞中干細胞比率，再以這個比率 計算定量細胞干重所需含有含酶菌體細胞發(fā)酵液用量。本實施例的每升發(fā)酵液中含有含酶菌體細胞的干重為50克。在十份含有IOOmL pH7. 0磷酸鹽緩沖液的三角瓶中加入上述所得200mL發(fā)酵液 離心后獲得的濕細胞，其中含有含酶菌體細胞的干重為10g，分別加入乙酰乙酸甲酯，使乙 酰乙酸甲酯的終濃度分別為 0. 01mol/L、0. 02mol/L、0. 03mol/L、0. 04mol/L、0. 05mol/L、 0. 06mol/L、0. 07mol/L、0. 08mol/L、0. 09mol/L、0. lOmol/L,均置于 30 °C，180r/min 的搖床 中反應Mh。反應結束后將轉化液于4000r/min離心20分鐘，棄去菌體沉淀，將上清液用等體積乙酸乙酯連續(xù)萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入無水硫酸鈉 除去少量水分，抽濾，濾液蒸餾除去乙酸乙酯，即得所述S-(+)-3-羥基丁酸甲酯，底物初始 濃度對摩爾轉化率及S-(+)-3-羥基丁酸甲酯的對應體過剩值(ee% )的影響見表1。
表1底物初始濃度對轉化率及S-(+)_3-羥基丁酸甲酯的影響
權利要求
1.一種微生物轉化制備S-(+)-3-羥基丁酸甲酯的方法，其特征在于所述方法是以乙 酰乙酸甲酯為底物，以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No. 2266發(fā)酵獲得的 含酶菌體細胞為生物催化劑，進行轉化反應制得所述S-(+)-3-羥基丁酸甲酯。
2.如權利要求1所述的微生物轉化制備S-(+)-3-羥基丁酸甲酯的方法，其特征在于 所述的方法為在PH 5. O 8. O的磷酸鹽緩沖液中，以乙酰乙酸甲酯為底物、以釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) CGMCC No. 2266發(fā)酵獲得的含酶菌體細胞為生物催化劑，于 25 45°C下轉化反應8 40小時，反應結束后，轉化液經(jīng)分離純化得到所述S-(+)-3-羥 基丁酸甲酯。
3.如權利要求1所述的微生物轉化制備S-(+)-3-羥基丁酸甲酯的方法，其特征在于所 述的乙酰乙酸甲酯在磷酸鹽緩沖液中的初始終濃度為0. 01 0. 10mol/Lo
4.如權利要求1所述的微生物轉化制備S-(+)-3-羥基丁酸甲酯的方法，其特征在于所 述的磷酸鹽緩沖液中還添加有終濃度為10 150g/L的葡萄糖作為輔助底物。
5.如權利要求1所述的微生物轉化制備S-(+)-3-羥基丁酸甲酯的方法，其特征在于所 述的含酶菌體細胞用量以細胞干重計為1 70g/g底物。
6.如權利要求1所述的微生物轉化制備S-(+)-3-羥基丁酸甲酯的方法，其特征在于所 述的含酶菌體細胞按照以下方法制備將釀酒酵母CGMCC No. 2266接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中， 搖床轉速為150 200r/min，26 35°C下培養(yǎng)18 30h，將發(fā)酵液離心，制得含酶菌體細 胞。
7.如權利要求1所述的微生物轉化制備S-(+)-3-羥基丁酸甲酯的方法，其特征在于 所述的S-(+)-3-羥基丁酸甲酯分離純化方法如下反應結束后，將轉化液4000r/min離心 20分鐘，棄去菌體沉淀，將上清液用等體積乙酸乙酯連續(xù)萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液， 在乙酸乙酯萃取液中加入無水硫酸鈉除去水分，抽濾，濾液蒸餾除去乙酸乙酯，即得所述 S-(+)-3-羥基丁酸甲酯。
8.如權利要求1所述的微生物轉化制備S-(+)-3-羥基丁酸甲酯的方法，其特征在于 所述的方法按照以下步驟進行(1)斜面培養(yǎng)將釀酒酵母CGMCC No. 2266接種到斜面培養(yǎng) 基，26 35°C培養(yǎng)4 6天得菌體斜面；(2)種子培養(yǎng)從菌體斜面取一接種環(huán)菌體轉接 到種子培養(yǎng)基，搖床轉速為150 200r/minJ6 35°C培養(yǎng)18 2 得種子液；(3)發(fā)酵 培養(yǎng)取種子液，以體積分數(shù)10 20%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床轉速為150 200r/minJ6 35°C培養(yǎng)18 30h，將發(fā)酵液離心分離得到所述含酶菌體細胞；(4)生物轉 化在pH5. 0 8. 0的磷酸鹽緩沖液中，添加終濃度為10 150g/L的葡萄糖作為輔助底 物，加入終濃度為0. 01 0. 10mol/L的乙酰乙酸甲酯，以及細胞干重質(zhì)量為乙酰乙酸甲酯 1 50倍的含酶菌體細胞，25 45°C下轉化反應8 40小時，反應結束制得轉化液；(5) 分離純化轉化反應結束后，將轉化液于4000r/min離心20分鐘，棄去菌體沉淀，將上清液 用等體積乙酸乙酯連續(xù)萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入無水硫 酸鈉除去水分，抽濾，濾液蒸餾除去乙酸乙酯，即得所述S-(+)-3-羥基丁酸甲酯。
9.如權利要求2所述微生物轉化制備S-(+)-3-羥基丁酸甲酯的方法，其特征在于所述 方法按如下步驟進行(1)斜面培養(yǎng)將釀酒酵母CGMCC No. 2266接種到斜面培養(yǎng)基，26 35°C培養(yǎng)4 6天 得菌體斜面；所述的斜面培養(yǎng)基終濃度組成為麥芽汁5 15g/L，酵母粉2 4g/L，蛋白胨4 6g/L，葡萄糖7 12g/L，瓊脂15 25g/L，自然pH值，溶劑為水；(2)種子培養(yǎng)從菌體斜面取一接種環(huán)菌體轉接到種子培養(yǎng)基，^5 35°C，搖床轉速為 150 200r/min，培養(yǎng)18 2 得種子液；所述的種子培養(yǎng)基終濃度組成為葡萄糖沈 32g/L，酵母粉 2 4g/L，硫酸銨 3 6g/L，無水 MgSO4 0. 2 0. 4g/L，K2HPO4 · 3Η20 0· 5 1. 5g/L，KH2PO4 0· 6 1. 5g/L，用NaOH或HCl溶液調(diào)整液體培養(yǎng)基的pH值為7. 0，溶劑為 水；(3)發(fā)酵培養(yǎng)取種子液，以體積分數(shù)為10 20%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，培 養(yǎng)溫度為沈 35°C，搖床轉速為150 200r/min，培養(yǎng)18 30h得到含有含酶菌體細胞 的發(fā)酵液，離心分離得到所述含酶菌體細胞；所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為葡萄糖26 32g/L，酵母粉 2 4g/L，硫酸銨 3 6g/L，無水 MgSO4 0. 2 0. 4g/L，K2HPO4 · 3Η20 0· 5 1. 5g/L，KH2PO4 0· 6 1. 5g/L，用NaOH或HCl溶液調(diào)整液體培養(yǎng)基的pH值為7. 0，溶劑為 水；(4)生物轉化在pH5. 0 8. 0的磷酸鹽緩沖液中，加入0. 01 0. IOmol/L的乙酰乙 酸甲酯，添加終濃度為10 150g/L的葡萄糖作為輔助底物，以及以細胞干重質(zhì)量為乙酰乙 酸甲酯1 50倍的含酶菌體細胞，于25 45°C下轉化反應8 40小時得轉化液；(5)分離純化反應結束后將轉化液于4000r/min離心20分鐘，棄去菌體沉淀，將上清 液用等體積乙酸乙酯連續(xù)萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入無水 硫酸鈉除去水分，抽濾，濾液蒸餾除去乙酸乙酯，即得所述S-(+)-3-羥基丁酸甲酯。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種微生物轉化制備S-(+)-3-羥基丁酸甲酯的方法在pH 5.0～8.0的磷酸鹽緩沖液中，以乙酰乙酸甲酯為底物、以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No.2266發(fā)酵獲得的含酶菌體細胞為生物催化劑，于25～45℃下轉化反應8～40h，反應結束后，轉化液經(jīng)分離純化得到所述S-(+)-3-羥基丁酸甲酯；本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在(1)生產(chǎn)菌株安全無毒，易于大規(guī)模培養(yǎng)；(2)可以獲得大量的生物催化劑，成本低廉；(3)反應條件溫和，環(huán)境友好；(4)操作簡便，反應過程中不需要添加價格昂貴的輔酶；(5)易于實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，摩爾轉化率高。
文檔編號C12R1/865GK102071227SQ201010567729
公開日2011年5月25日 申請日期2010年11月30日 優(yōu)先權日2010年11月30日
發(fā)明者歐志敏, 陳慶美, 隋志紅 申請人:浙江工業(yè)大學