專利名稱：能夠降解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的缺陷假單胞菌m5r14的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株能夠降解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留、尤其是能夠同時(shí)降解聯(lián)苯菊 酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯三種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的缺陷假單胞菌M5R14。
背景技術(shù)：
擬除蟲菊酯類農(nóng)藥是模擬天然的除蟲菊酯而合成，含有多個(gè)苯環(huán)結(jié)構(gòu)的一類殺 蟲劑，具有廣譜高效、低毒、耐光、熱等特點(diǎn)，其品種數(shù)和使用量?jī)H次于有機(jī)磷農(nóng)藥， 占?xì)⑾x劑市場(chǎng)的第二位，在茶葉、蔬菜等經(jīng)濟(jì)作物害蟲防治中得到廣泛應(yīng)用，常用的有 聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯等。但是這類農(nóng)藥普遍具有對(duì)環(huán)境穩(wěn)定、降解速度慢、 降解率低，殘留過高，帶來了食品安全問題。特別是我國(guó)加入WTO后，“關(guān)稅壁壘”隨 之拆除，國(guó)外針對(duì)我國(guó)入關(guān)而頒布的農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥的最大殘留量(MRL)標(biāo)準(zhǔn)帶有明顯的
“技術(shù)壁壘”傾向，農(nóng)藥檢測(cè)范圍大幅度擴(kuò)大，擬除蟲菊酯類農(nóng)藥MRL標(biāo)準(zhǔn)明顯降低， 使我國(guó)茶葉等農(nóng)產(chǎn)品出口面臨著更為嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。農(nóng)藥殘留是吸附、降解和遷移等綜合作用后結(jié)果，其中降解是制約其殘留量 的關(guān)鍵過程，控制農(nóng)藥殘留有多種途徑，包括禁用農(nóng)藥、化學(xué)處理方法和微生物降解 等。大量研究表明微生物對(duì)土壤和水環(huán)境中的農(nóng)藥降解起著關(guān)鍵作用，已分離到大批能 降解或轉(zhuǎn)化農(nóng)藥的微生物類群，如細(xì)菌、放線菌、真菌和藻類，在對(duì)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥 降解研究中發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬(Pseudomonas.sp)、腸桿菌屬(Ehterobacte.sp)、產(chǎn)堿桿菌屬 (Alcaligenes.sp)和蠟狀芽孢桿菌屬(Bacillus cereus.sp)等對(duì)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥具有降解作 用。但大多數(shù)微生物降解針對(duì)某一或少數(shù)幾個(gè)農(nóng)藥，而同時(shí)能降解多種擬除蟲菊酯類農(nóng) 藥的微生物報(bào)道較少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種能夠同時(shí)降解多種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的菌株——缺陷假 單胞菌(Pseudomonas diminuta)M5R14。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是缺陷假單胞菌(Pseudomonas diminuta)M5Rl4，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理 委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究 所，100101，保藏編號(hào)CGMCCNo.4154，保藏日期2010年09月08日。所述缺陷假單胞菌M5R14菌落特征如下為球菌，無芽孢、無鞭毛，大小 0.5X1.2 1.7 iim，在固體培養(yǎng)基上，菌落圓形、隆起，表面光滑、濕潤(rùn)，邊緣完整， 呈灰黃色，半透明，革蘭氏染陰性，乙酰甲基甲醇生成試驗(yàn)(v-p)反應(yīng)陽(yáng)性，氧化酶和 過氧化氫酶陽(yáng)性，不能水解淀粉，能液化明膠。所述缺陷假單胞菌M5R14的16S rDNA基因序列如下CGGGCGGCGTGCTATACATGCAAGTCGAGCGGACTTGATGAGGAGCTTGCTCCCCTGATGGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGT
AGGCAACCTGCCCTCAAGACTGGGATAACTACCGGAAACGGTAGCTAATACCGGATAATTAAATTCGCTGCATGGCGGAGTTATGAAAGGCGGAGCAATCTGTCACTTGAGGATGGGCCTGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGAACGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGCCAGGGAAGAACGTCTCATAGAGTAACTGCTATGAGAGTGACGGTACCTGAGAAGAAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGG
CGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTCTTTAAGTCTGGTGTTTAAACCCGAGGCTCAACTTCGGGACGCACTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGGCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTAGGGGTTTCGATACCCTTGGTGCCGAAGTTAACACATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCAGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGTCTTGACATCCCTCTGAATCCTCTAGAGATAGAG
GCGGCCTTCGGGACAGAGGAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCACTTTGGGTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACTTGGGCTACACACGTACTACAATGGCTGGTACAACGGGAAGCGAAGCCGCGAGGTGGAGCCAATCCTAAAAAGCCAGTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGTCGGAATTGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTACAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCCTTACGGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGAGAATo本發(fā)明菌株由采集杭州農(nóng)藥廠擬除蟲菊酯類農(nóng)藥生產(chǎn)車間下水道處馴化過的 污泥中篩選獲得，經(jīng)Sherlock MIS系統(tǒng)以及16SrDNA測(cè)序方法鑒定為假單胞菌菌屬 (pseudomonas.sp)中的缺陷/[叚單胞菌(pseudomonasdiminuta)。該菌株能同時(shí)降解聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯三種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘 留，在通氣、pH6.0 7.0、25 30°C、OD415nm0.2、農(nóng)藥濃度 100mg I/1、轉(zhuǎn)速 180r mirT1條件下，對(duì)含有聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的混合培養(yǎng)基，培養(yǎng)3天，
3種農(nóng)藥的降解率分別為53.26%，54.04%, 52.98% 0本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在提供了一株能夠同時(shí)降解聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯三種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的新菌株，為控制農(nóng)產(chǎn)品中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘 留提供了研究基礎(chǔ)，應(yīng)用前景廣闊。


圖1為缺陷假單胞菌M5R14的電鏡照片(放大50000倍)；圖2為缺陷假單胞菌M5R1416S rDNAPCR擴(kuò)增結(jié)果(ZA 樣品M6R9 ； Marke
DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量)；圖3為基于16S rDNA序列的菌株M6R9系統(tǒng)發(fā)育樹。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限 于此實(shí)施例1 降解菌株的篩選與鑒定1.1培養(yǎng)基和試劑富集培養(yǎng)基蛋白胨10g，NaCl 1.Og，KH2PO4 1.Og，H20 IOOOmL,葡萄糖 l.Og, pH7.0 ；基礎(chǔ)培養(yǎng)基NH4NO3l.OOg, MgSO4JH2O 0.5g, (NH4)2SO4 0.5g, KH2PO4 0.5g, NaCl 0.5g, K2HPO4 1.5g, H2O 1 OOOmL, pH7.0 ；基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入1.5%瓊脂和IOOmg · I/1的聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯即 配成相應(yīng)的含農(nóng)藥固體培養(yǎng)基；50g · L1的聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯乳液。1.2菌株對(duì)聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯降解效能的測(cè)定將純化后的單個(gè)菌株以菌量OD415nm = 0.2接種到IOOmL含聯(lián)苯菊酯、甲氰菊 酯、氯氰菊酯各IOOmg 'I/1的無菌液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，以不接菌的培養(yǎng) 液作對(duì)照，在30°C，180r · miiT1的恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)3天。培養(yǎng)結(jié)束后，吸取2mL 培養(yǎng)液，加入4，4，3mL的石油醚萃取3次，加入無水硫酸鈉吸水，并定容至10mL，用 氣相色譜檢測(cè)。氣相色譜檢測(cè)條件Agilent 6890GC (G1530N/G3172A)氣相色譜儀， HP-5(30mmX0.25mmX0.25ym)色譜柱，ECD 檢測(cè)器，檢測(cè)溫度 280°C，柱溫 260°C， 進(jìn)樣口溫度280°C，柱流l.OmL · mm1,分流比為1 10，載氣為N2 (99.999% )，進(jìn) 樣量為1 PL。降解率(％ )=(對(duì)照樣品殘留量_處理樣品殘留量)X 100/對(duì)照樣品殘留量1.3優(yōu)勢(shì)降解菌株選育1.3.1菌株來源采集杭州農(nóng)藥廠擬除蟲菊酯類農(nóng)藥生產(chǎn)車間下水道處馴化過的污泥。1.3.2降解菌株的分離、純化和篩選從每份污泥土樣中取10g，在無菌的條件下，分別加到含聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、 氯氰菊酯各IOOmg · L—1的IOOmL無菌液體富集培養(yǎng)基的250mL三角瓶中.在30°C下 180r · miiT1搖床上培養(yǎng)7天后，按10%接種量轉(zhuǎn)移到下一批富集培養(yǎng)基上(三種農(nóng)藥梯度依次為100，150，200，250mg · L1),同條件馴化培養(yǎng)7天。然后再按10%接種量 轉(zhuǎn)接到含聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯各250mg 的無菌液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，繼續(xù) 培養(yǎng)7天，連續(xù)轉(zhuǎn)接2次后從農(nóng)藥濃度為250mg 'I/1基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，取O.lmL基礎(chǔ)培養(yǎng) 基發(fā)酵液反復(fù)進(jìn)行平板劃線分離、純化，直到篩選得到單個(gè)菌落，將純菌落接種到斜面 上，于4°C冰箱內(nèi)保存。1.3.3菌株鑒定菌株鑒定采用美國(guó)MIDI 公司的 Sherlock microbial identity system (MIS)軟件系
統(tǒng)，該系統(tǒng)將在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)的菌株按照MIDI公司的操作規(guī)范要求進(jìn)行脂肪 酸甲酯的提取和分析，定性(種類)和定量(含量)地分析微生物的脂肪酸甲酯成份并 生成一個(gè)脂肪酸圖譜，利用該圖譜和數(shù)據(jù)庫(kù)(Library)進(jìn)行比對(duì)，鑒定未知的菌種(吳愉 萍，徐建明，汪海珍等.SheriockMIS系統(tǒng)應(yīng)用于土壤細(xì)菌鑒定的研究.土壤學(xué)報(bào)，2006， 43(4) 642-647)。此外，還使用16SrDNA鑒定方法對(duì)菌株進(jìn)行了進(jìn)一步的驗(yàn)證(李玲，陳林， 楊文革等.一株他克莫司產(chǎn)生菌的篩選及鑒定.食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2010，29(3) 416-420)。1.3.4菌株形態(tài)特征觀察及生理生化特性測(cè)定將菌株接種在固體培養(yǎng)基中，48h后電鏡觀察菌株形態(tài)特征；取純化的菌株生 長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期進(jìn)行革蘭氏、鞭毛、結(jié)晶紫簡(jiǎn)單莢膜等染色；生理生化特性測(cè)定參照《常見 細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》(東秀珠，2001)。2.結(jié)果2.1菌株的分離與篩選經(jīng)分離、純化、篩選獲得1株能同以聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯為碳源并 保持較高和較穩(wěn)定降解率的細(xì)菌，命名為M5R14，其它菌株降解力都不同程度地衰退， 培養(yǎng)3天，對(duì)三種農(nóng)藥的降解率分別為53.26%，54.14%, 52.98%。2.2菌株的鑒定2.2.1菌株M5R14基本形態(tài)及生理生化特征該菌為球菌，無芽孢、無鞭毛，大小0.5X1.2 1.7 μ m(圖1)，在固體培養(yǎng) 基上，菌落圓形、隆起，表面光滑、濕潤(rùn)，邊緣完整，呈灰黃色，半透明，革蘭氏染陰 性，乙酰甲基甲醇生成試驗(yàn)(V-P)反應(yīng)陽(yáng)性，氧化酶和過氧化氫酶陽(yáng)性，不能水解淀 粉，能液化明膠，其他生理生化特性見表1。表1 菌株M5R14的生理生化特性
權(quán)利要求
1.缺陷假單胞菌(Pseudomonasdiminuta)M5R14,保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究 所，100101，保藏編號(hào)CGMCCNo.4154，保藏日期2010年09月08日。
2.如權(quán)利要求1所述的缺陷假單胞菌M5R14，其特征在于所述缺陷假單胞菌M5R14 菌落特征如下為球菌，無芽孢、無鞭毛，大小0.5X1.2 1.7μιη，在固體培養(yǎng)基上， 菌落圓形、隆起，表面光滑、濕潤(rùn)，邊緣完整，呈灰黃色，半透明，革蘭氏染陰性，乙 酰甲基甲醇生成試驗(yàn)(ν-ρ)反應(yīng)陽(yáng)性，氧化酶和過氧化氫酶陽(yáng)性，不能水解淀粉，能液 化明膠。
3.如權(quán)利要求1所述的缺陷假單胞菌M5R14，其特征在于所述缺陷假單胞菌M5R14 的16S rDNA基因序列如下CGGGCGGCGTGCTATACATGCAAGTCGAGCGGACTTGATGAGGAGCTTGCTCCCCTGATGGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGCAACCTGCCCTCAAGACTGGGATAACTACCGGAAACGGTAGCTAATACCGGATAATTAAATTCGCTGCATGGCGGAGTTATGAAAGGCGGAGCAATCTGTCACTTGAGGATGGGCCTGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGAACGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGCCAGGGAAGAACGTCTCATAGAGTAACTGCTATGAGAGTGACGGTACCTGAGAAGAAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTCTTTAAGTCTGGTGTTTAAACCCGAGGCTCAACTTCGGGACGCACTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGGCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTAGGGGTTTCGATACCCTTGGTGCCGAAGTTAACACATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCAGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGTCTTGACATCCCTCTGAATCCTCTAGAGATAGAGGCGGCCTTCGGGACAGAGGAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCACTTTGGGTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACTTGGGCTACACACGTACTACAATGGCTGGTACAACGGGAAGCGAAGCCGCGAGGTGGAGCCAATCCTAAAAAGCCAGTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGTCGGAATTGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTACAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCCTTACGGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGAGAAT。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株能夠降解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留、尤其是能夠同時(shí)降解聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯三種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的缺陷假單胞菌M5R14，該菌株保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，100101，保藏編號(hào)CGMCC No.4154，保藏日期2010年09月08日。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在提供了一株能夠同時(shí)降解聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯三種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的新菌株，為控制農(nóng)產(chǎn)品中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留提供了研究基礎(chǔ)，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)C12R1/38GK102021134SQ201010567790
公開日2011年4月20日 申請(qǐng)日期2010年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月30日
發(fā)明者廖敏, 謝曉梅 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)