一種使用病毒誘導的基因沉默系統(tǒng)培育雄性不育植株的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了VIGS載體系統(tǒng)在培育雙子葉雄性不育植株中的應用。本發(fā)明建立了一個基于VIGS技術的高效實用的植物不育株系創(chuàng)建技術體系，不育率超過了96%，可達到98%，且具有不穩(wěn)定遺傳的特點，不會在后代中遺傳，不會發(fā)生因不可控生物技術擴散而引起的基因污染或生物安全。同時，本發(fā)明操作簡單，時間短，田間工作量少，大大節(jié)約成本，提高育種效率。
【專利說明】一種使用病毒誘導的基因沉默系統(tǒng)培育雄性不育植株的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及以生物技術手段培育雄性不育植株的載體系統(tǒng)和方法，尤其涉及雙子葉植物。
【背景技術】
[0002]培養(yǎng)擁有不育性穩(wěn)定，徹底，各方面性狀良好的雄性不育株系是實現(xiàn)植物雜交育種目標的關鍵。目前，生產(chǎn)上培育雄性不育株系的主要途徑有胞質不育系統(tǒng)、核不育系統(tǒng)和化學殺雄系統(tǒng)等。
[0003]細胞質雄性不育是當前油菜雜種優(yōu)勢利用中應用最廣泛而又最有效的途徑之一，但是該系統(tǒng)不育系的不育性不夠徹底、易受環(huán)境溫度的影響。在初花期低溫條件下易出現(xiàn)微量花粉，微粉的產(chǎn)生將迫使母本自交結實，使Fl代種子恢復度降低，在生產(chǎn)上應用存在一定風險。例如，對于油菜來說，胞質不育系統(tǒng)微粉問題是目前國內外育種界尚未徹底攻克的技術難題，也是油菜三系制種普遍存在的一大隱患。細胞核不育系不育性徹底穩(wěn)定，不受環(huán)境條件影響，恢復系多，易獲得強優(yōu)勢組合。該系統(tǒng)的不足之處在于其不育系中存在50%可育株，在親本繁殖和雜交種生產(chǎn)中要人工去除不育系中50%的可育株，導致生產(chǎn)成本增加，而且一旦去除不及時，雜交種中會出現(xiàn)一定比例的不育株系。經(jīng)過改進，人們育成了隱性和顯性核不育三系，解決了核不育親本繁殖和雜交種制種過程中需要拔除50%可育株的難題，但是該系統(tǒng)存在保 持系較少、親本選育較難的問題。化學殺雄是指在植物雄性器官分化前或發(fā)育過程中，噴施內吸性藥劑，經(jīng)過一系列生理生化過程，以阻止花粉的形成或抑制花粉的正常發(fā)育，而導致的雄性不育。利用化學殺雄劑培育品種是一種新型的油菜育種方法，在國內外應用較為廣泛，但是該系統(tǒng)雜交種由于易受外界條件影響、田間操作繁瑣，而且由于農(nóng)藥殘留等問題，在生產(chǎn)上大面積應用也存在一定局限性。
[0004]近來的分子生物學研究中，利用生物技術手段來培育雄性不育植株是一個重要的研究方向。與傳統(tǒng)不育系選育相比，生物技術不育系的培育可以不受遺傳資源的限制，通過轉基因等可以從分子水平上改變植物育性的手段實現(xiàn)。然而，利用轉基因生物技術培育的穩(wěn)定不育系不僅面臨著轉基因擴散的安全問題，而且同樣存在上述細胞核不育系的缺點。
[0005]病毒誘導的基因沉默(virus induced gene silencing, VIGS)也是一種可用于調控植物內源基因表達水平的生物技術。VIGS引起的基因沉默是一種轉錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)現(xiàn)象,是植物體內普遍存在的遺傳免疫機制。VIGS技術通過在病毒載體中插入目的基因片段，并侵染寄主植物，利用植物體內天然存在的遺傳免疫機制，將內源目的基因mRNA降解，使植物出現(xiàn)目的基因功能喪失或表達水平下降的表型。與植物轉基因技術相比，VIGS無需培育轉基因植株，而且具有操作簡便、獲得表型快速等優(yōu)點，目前已廣泛應用于與植物抗病、逆境脅迫、細胞信號轉導以及生長發(fā)育等相關基因功能的研究。但是，利用VIGS技術沉默植物內源基因一直存在一個沉默效率的問題，一股獲得有表型材料的比例低于30%，限制了這一技術應用。
【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的在于利用生物技術建立不受育種資源限制、可利用現(xiàn)有可育優(yōu)質種質資源，快速培育不育性徹底穩(wěn)定及性狀優(yōu)良的雄性不育系，而且具有田間操作簡單、制種成本低的授粉控制系統(tǒng)。
[0007]本發(fā)明的目的是通過以下措施實現(xiàn)的:
[0008]VIGS載體系統(tǒng)在培育雙子葉雄性不育植株中的應用。
[0009]優(yōu)選地，上述VIGS載體系統(tǒng)來源于煙草脆裂病毒(TRV病毒)，包括輔助病毒載體PTRVl (含TRV病毒的RNAl片段)和表達病毒載體pTRV2 (含TRV病毒的RNA2片段)。
[0010]上述pTRVl載體包括以下結構:依次為左邊界(LB)、2X35S啟動子、2X35S啟動子驅動表達的煙草脆裂病毒RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)、富半胱氨酸16K蛋白、運動蛋白(MP)、自主剪切核酶(Rz)、轉錄終止子(NOSt)、右邊界(RB);上述pTRV2載體包括以下結構:依次為左邊界(LB)、2X35S啟動子、2X35S啟動子驅動表達的煙草脆裂病毒外殼蛋白(CP)、多克隆位點(MCS)、自主剪切核酶(Rz)、轉錄終止子(NOSt)、右邊界(RB)。如圖9所示。在利用VIGS方法沉默植物基因時，利用pTRV2載體CP和Rz之間的多克隆位點(MSC)將靶基因片段構建在的PTRV2載體中。pTRVl和pTRV2載體均有T-DNA的左右邊界，用于在侵染植物過程中將載體中的目的片段導入植物細胞，以啟動煙草脆裂病毒的復制。PTRVl含TRV病毒的RNAl cDNA克隆，為病毒復制組裝所必須；pTRV2含TRV病毒RNA2cDNA克隆和多克隆位點(MCS)。
[0011]上述VIGS載體系統(tǒng)帶有植物育性調控基因，主要為隱性雄性不育基因，優(yōu)選為 COIl 基因(Coronatine-1nsensitivel), MSPl 基因(MultipleSporocyte), TDR 基因(tapetum degeneration retardation)和 UDTl 基因(undeveloped Tapetuml)等，在基因沉默后可影響小孢子母細胞發(fā)育、絨氈層發(fā)育、花粉囊和花粉外壁發(fā)育而導致雄性不育性狀的基因。
[0012]上述雙子葉植物優(yōu)選為十字花科植物。
[0013]油菜COIl基因的序列為SEQ ID N0.1，其中核苷酸(1181)至(1694)的序列片段可以用于沉默整個油菜COIl基因。煙草COIl基因的序列為SEQ ID N0.2，其中核苷酸(444)至(952)可以用于沉默整個煙草COII基因。SEQ ID N0.3為pTRVl載體中的煙草脆裂病毒RNAl序列片段，SEQ ID N0.4為pTRV2載體序列。
[0014]使用上述VIGS載體系統(tǒng)培育雙子葉雄性不育植株的方法，包括以下步驟:
[0015](1)克隆植物育性調控基因，構建攜帶植物育性調控基因的重組PTRV2病毒載體；
[0016](2)將攜帶植物育性調控基因的重組PTRV2病毒載體、pTRVl載體導入農(nóng)桿菌，將含攜帶植物育性調控基因的重組PTRV2病毒載體和pTRVl載體的農(nóng)桿菌配制成0D600為
0.6~1.0的菌液；
[0017](3)切除植株的部分根須后，將根部浸入步驟(2)的菌液中；
[0018](4)取出侵染后的植株，經(jīng)培育，最終表現(xiàn)為不育性狀。
[0019]優(yōu)選地，上述使用VIGS載體系統(tǒng)培育雙子葉雄性不育植株的方法，包括以下步驟:
[0020](1)克隆COIl基因，構建攜帶COIl基因的重組PTRV2-C0I1病毒載體；[0021](2)將pTRV2-C0Il和pTRVl載體導入農(nóng)桿菌GV3101，將分別含有pTRV2_C0Il和pTRVl載體的農(nóng)桿菌GV3101按1:1的比例配制成0D600為0.6~1.0的菌液；
[0022](3)切除植株的部分根須后，將根部浸入步驟(2)的菌液中；
[0023](4)取出侵染后的植株，經(jīng)過栽種、春化，開花后，最終表現(xiàn)為不育性狀。
[0024]有益效果
[0025]1.本發(fā)明創(chuàng)造性的將VIGS技術應用于雄性不育植株的培育，建立了一個高效實用的植物不育株系創(chuàng)建技術體系。在利用該技術體系培育不育材料的實踐中，不育率超過了 96%，可達到98%。
[0026]2.本發(fā)明創(chuàng)造的雄性不育系具有不穩(wěn)定遺傳的特點，不會在后代中遺傳，因此，在田間生產(chǎn)中不會發(fā)生因不可控生物技術擴散而引起的基因污染或生物安全。
[0027]3.本發(fā)明可快速培育雄性不育植株，可以任意選擇最優(yōu)的品種作為不育親本，不存在像細胞核，細胞質雄性不育體系中所要求的恢保關系，因此親本選擇自由，可任意組配雜交組合，有利于優(yōu)中選優(yōu)，篩選出較強的優(yōu)勢組合。同時，本發(fā)明操作簡單，時間短。在室內對幼苗根部進行浸泡侵染后即可移栽到田里，后面沒有人工去雄和化學去雄的田間操作，田間工作量少，大大節(jié)約成本，提高育種效率。提高植株雜種優(yōu)勢的利用效率以及實現(xiàn)“雜優(yōu)+優(yōu)質”的育種目標。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1實施例2油 菜COIl基因cDNA片段的PCR擴增圖(514bp) =Marker:DNA分子量標準；2，3:煙草COIl基因片段的PCR擴增產(chǎn)物；
[0029]圖2實施例2pTRV2_C0Il載體構建的菌落PCR鑒定圖:Marker:DNA分子量標準；1-6:對不同菌落中PTRV2-C0I1載體鑒定的PCR擴增產(chǎn)物；
[0030]圖3實施例2pTRV2-C0I I質粒酶切鑒定圖:Marker =DNA分子量標準；I，2:PTRV2-C0I1 質粒的 NcoI 與 EcoICRI 雙酶切鑒定；3，4:pTRV2-C0Il 質粒的 EcoICRI 與 SmaI雙酶切鑒定；
[0031]圖4實施例2轉pTRV2-C0Il載體農(nóng)桿菌的菌落PCR檢測圖:Marker:DNA分子量標準；1_3:轉pTRV2-C0Il載體農(nóng)桿菌不同菌落的PCR擴增檢測；
[0032]圖5實施例2C0I1基因沉默油菜中COIl基因的表達水平:對照為使用含空載體農(nóng)桿菌侵染的油菜；L1_5,為5個用含有COIl基因載體農(nóng)桿菌侵染的油菜植株；
[0033]圖6實施例2VIGS侵染油菜的果莢表型:左側為對照油菜果莢，正常結實；右側為VIGS侵染油菜的果莢，無果實；
[0034]圖7實施例2VIGS侵染油菜花序的不育表型，其果莢均未正常結實；
[0035]圖8實施例3以VIGS沉默煙草COIl基因引起的不育表型；
[0036]圖9VIGS系統(tǒng)載體pTRVl和pTRV2結構示意圖。
【具體實施方式】
[0037]下面通過實施例對本發(fā)明進行具體的描述，有必要在此指出的是以下實施例只用于對本發(fā)明進行進一步說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，該領域技術人員可以根據(jù)上述本
【發(fā)明內容】
對本發(fā)明作出一些非本質的改進和調整。[0038]實施例1
[0039]1.構建VIGS沉默油菜COIl基因的載體
[0040]1.1油菜COIl基因cDNA的獲得
[0041]培育油菜幼苗，待其長到IOcm左右時用TRIZOL法提取莖桿和子葉的總RNA,通過反轉錄獲得油菜總RNA對應的cDNA，取少量cDNA作為模板，正向引物為:AAATCTAGAGTGTCTCCGAACCATAGGC，反向引物為:TCTCTCACCTCTCCAAGCTG，PCR 擴增獲得一條大小為 514bp 的一段油菜 COIl 基因 cDNA 片段(SEQ ID N0.1(1181)至(1694))。
[0042]1.2含油菜COIl基因的pTRV2載體的獲得
[0043]用XbaI酶切COIl基因的cDNA片段，用XbaI和EcoICRI雙酶切質粒pTRV2，酶切體系分別為:1.5μ L Buffer (Buf f er3), I μ L Xbal,5y L COII基因cDNA片段，添加水補充至15 μ L ; 1.5 μ L Buffer(Buffer MultiCore)，0.5 μ L Xbal，0.5 μ L EcoICRI0.1 μ L BSA,3μ L pTRV2質粒，添加水補充至15 μ L.經(jīng)過2小時酶切反應后，瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收得COIl片段和載體片段。以下列方案切膠回收:
[0044]紫外燈下切膠，放入1.5ml離心管，按300 μ L / IOOmg膠塊加入溶膠液，將離心管置于準備好的50°C預熱水浴鍋中約lOmin，至膠塊完全融化。將融化好的溶液轉入膠回收吸附柱中，8krpm離心Imin,棄液。向吸附柱中加500 μ L洗漆液,靜置lmin, 12000rpm離心Imin,棄液,重復步驟4?？账?吸附柱12000rpm離心lmin),將`吸附柱轉入一干凈離心管，加26-30 μ L ddH20于中央膜處，室溫靜置4min，12000rpm離心lmin，即得到回收產(chǎn)物。
[0045]將回收COIl片段和pTRV2載體片段于4°C連接過夜，得含油菜COIl基因的pTRV2載體，命名為pTRV2-C0Il，連接體系為:lμL T4DNA連接酶Buffer (IOx) I μ L T4DNA連接酶，IyL PEG4000,6y L COIl 片段，I μ L載體片段。
[0046]2pTRV2-C0I I載體連接產(chǎn)物熱激轉化大腸桿菌DH5 α。
[0047]2.1 轉化
[0048]在-80°C冰箱取感受態(tài)大腸桿菌(DH5 α )，冰水浴約IOmin解凍，將連接產(chǎn)物加入混勻。冰浴30min后，在42°C水浴鍋中熱激60s，立刻冰浴l_2min，加900-1000 μ L LB溶液,37°C 180rpm搖床復蘇約lh。5krpm5min離心，吸棄900 μ L上清液,余下重懸,涂LB平板(含30mg / L的Kan)，37°C倒置過夜培養(yǎng)(約14h)。
[0049]2.2挑取陽性克隆
[0050]在經(jīng)過過夜培養(yǎng)的平板上挑取單菌落進行菌落PCR鑒定，進行初篩。經(jīng)電泳跑膠確認后，將含有正確質粒的菌液(按1:1比例加50%甘油)儲存于-20°c備用。按下列方案提取質粒:
[0051]將搖好的菌液分裝于偶數(shù)只IOml無菌試管7krpm離心4min,棄上清液，向試管中加入200 μ L sol I (4°C )混勻，再加入200 μ L sol II (室溫)，上下顛倒混勻(約10下)，溶液變粘稠(像清鼻涕)。再向試管中加入250 μ L sol 111(室溫)，上下顛倒混勻(約10下)，出現(xiàn)絮狀或塊狀白色沉淀，溶液變清亮。將上述試管離心llkrpm6min,取上清液轉入純化柱內，離心8krpm30s,棄液。向純化柱中加入650 μ L洗漆液,離心8krpm30s,棄液。純化柱空甩(13k rpm2min離心)，將純化柱轉入干凈1.5ml離心管，向純化柱加30 μ L ddH20 (加到纖維膜上)，室溫靜置4min,離心13krpm2min,即得到質粒。
[0052]最后，將提取質粒分別進行Nco1-EcoICRI雙酶切鑒定和EcoICR1-SmaI雙酶切鑒定。酶切鑒定體系分別如下:1.5μ L Buffer,0.5μ L Ncol,0.5μ L EcoICRI,0.1 μ LBSA, 3 μ L pTRV2-C0II 質粒，添加水補充至 15μ L ;1.5μ L Buffer,0.5μ L Smal, 0.5μ LEcoICRIj0.1yL BSA, 3 μ L pTRV2質粒，添加水補充至15 μ L.酶切I小時后，瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切結果。酶切結果與預期一致的為陽性質粒。最后，交由生物公司測序驗證。
[0053]3.農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)制備
[0054](I)農(nóng)桿菌GV3101劃線培養(yǎng)28°C 2天
[0055](2)挑I個單菌落接種于5mlYEB(已加入5μ L Rif)，28 °C過夜培養(yǎng)
[0056](3)取菌液GV31013ml接種于200mlYEB液體培養(yǎng)基，28搖菌至OD ^ 0.6 (約4h)
[0057](4)將搖好的菌液裝入離心瓶離心5krpmllmin,棄液加(冰處理2h)雙蒸水重懸，5krpm離心I lmin,棄液
[0058](5)向離心瓶中加冰冷0.1mM CaC12重懸靜置lOmin, 5000rpm離心Ilmin,棄上清
液
[0059](6)向離心瓶中加2m L冰冷含15%甘油的85mL CaCl2溶液
[0060](7)用1.5ml離心管分裝(100 μ L /管，離心管上做好標記)，迅速放入液氮中處理數(shù)分鐘
[0061](8)將處理好的感受態(tài)細胞從液氮中取出置于_80°C保存
[0062]4.轉化農(nóng)桿菌
[0063](I)取_80°C保存的感受態(tài)農(nóng)桿菌GV31013份于冰上解凍
[0064](2)向每一份農(nóng)桿菌的菌液中分別輕輕加入質粒:5 μ L pTRV2-C0Il, I μ L pTRVl,I μ L pTRV2 (空載體)，小心混勻
[0065](3)將上述混勻的菌液冰水浴5min
[0066](4)冰水浴處理后的菌液液氮處理5min (液氮液面高過菌液面)
[0067](5) 37 °C 水浴熱激 5min
[0068](6)上述處理后的菌液中加入900 μ L室溫放置的YEB于28°C 200rpm搖床復蘇Ih
[0069](7)復蘇后的菌液6krpm離心5min,棄上清900 μ L
[0070](8)余下菌液重懸涂于 YEB 平板(IyL Kan / Iml YEB, I μ L Rif / Iml YEB)
[0071](9) 28°C倒置培養(yǎng)約2d，至長出直徑l_2mm的菌落
[0072]挑取單菌落進行菌落PCR鑒定進行初篩，經(jīng)電泳跑膠確認后獲得含VIGS沉默油菜COIl基因的pTRV2-C0Il載體的農(nóng)桿菌，命名為:GV_C0I1，并將含有pTRV2空載體的農(nóng)桿菌命名為:GV-C，將含有pTRVl載體的農(nóng)桿菌命名為:GV-1。
[0073]實施例2
[0074]1.實驗油菜幼苗播種，春化，育苗
[0075]播種油菜中雙11號，采用塑料纖維做固定物，MS液體培養(yǎng)基為養(yǎng)料，莖桿長到5cm左右噴施I / 500稀釋的矮壯素以抑制油菜幼苗的過分生長.半月后開始春化，春化條件為白天9h，9°C ;黑夜15h，40°C。春化14d后12°C復蘇2d白天9h，黑夜15h。復蘇完后移入25 °C溫室培養(yǎng)。
[0076]2.用含有VIGS載體的農(nóng)桿菌侵染油菜幼苗，培育沉默COIl基因的油菜株系
[0077]2.1侵染用農(nóng)桿菌準備
[0078]分別將GV-C、GV-1 和 6￥-0)11在61111 YEB 培養(yǎng)基中，加入 6 μ L Rif、6yL Kan，并調取三個單菌接種，于28°C，220rpm.搖菌培養(yǎng)過夜；然后，在50ml YEB培養(yǎng)基中，加入50 μ LRif>50y L Kan、5 μ L乙酰丁香酮及500 μ L過夜培養(yǎng)菌液，再28°C，220rpm.培養(yǎng)至明顯變濃(約12h)。
[0079]2.2高濃度侵染
[0080]將二搖培養(yǎng)的各農(nóng)桿菌菌液5krpm離心5min，棄上清，各加20ml新鮮YEB液體培養(yǎng)基重懸，然后將A液:10ml GV-C和IOml GV-1出液:10ml GV-C0I1和IOml GV-1，分別混勻。分別將油菜幼苗100株，用剪刀剪去部分根系，完全浸入到A液；將油菜幼苗100株，用剪刀剪去部分根系，完全浸入B液，置于暗箱中過夜(約12h)。
[0081]2.3低濃度侵染
[0082]將高濃度侵染過的油菜幼苗從高濃度菌液中取出，分別加入少量新鮮MS單獨在暗箱培養(yǎng)IOh.[0083]3.已進行浸根處理的油菜植株的培育
[0084]將已進行浸根處理的油菜幼苗按單株栽種，用蛭石和腐殖土按體積比1:1做栽培土，按處理液A液B液分別為每組油菜命名為GV-C和GV-C0I1，移入溫室培育。用自來水澆灌，其間澆4-5次40ml霍格蘭(Hoagland)營養(yǎng)液。
[0085]結果與分析:
[0086]1.油菜COIl基因cDNA片段的獲得
[0087]通過反轉錄獲得油菜總RNA對應的cDNA，取少量cDNA作為模板通過PCR擴增獲得一條大小約為514bp的油菜COIl基因cDNA片段，如圖1。
[0088]2.pTRV2-C0I I載體轉化大腸桿菌DH5 α后質粒的PCR鑒定
[0089]將酶切油菜COIl基因片段與酶切PTRV2載體的連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5 α后，在過夜培養(yǎng)的平板上挑取單菌落進行菌落PCR鑒定。電泳結果如圖2，與預期相符，表明得到陽性克隆。
[0090]3.對PCR鑒定的陽性克隆的酶切鑒定
[0091]對上一步鑒定為陽性的克隆，提取其中的pTRV2-C0Il載體質粒，繼續(xù)進行酶切鑒定，電泳結果如圖3，酶切結果與預期相符，進一步表明為陽性克隆。
[0092]4.對得到的陽性克隆測序
[0093]測序結果與預期的基因序列相符，表明得到油菜pTRV2-C0Il載體。
[0094]5.pTRV2-C0I I載體載體轉化農(nóng)桿菌后的菌液PCR鑒定
[0095]pTRV2-C0Il載體轉化農(nóng)桿菌GV3101后，進行菌液PCR鑒定，電泳結果如圖4，有目的條帶，表明得到PTRV2-C0I1載體的農(nóng)桿菌陽性克隆。
[0096]6.COIl基因沉默油菜中的COIl基因表達水平明顯下降
[0097]油菜在幼苗期經(jīng)過根部浸泡侵染并正常生長6周后，對對照及以VIGS沉默COIl基因油菜植株中COIl基因的表達水平檢測，表明沉默COIl基因油菜植株中COIl基因的表達水平低于對照的20%，其表達收到了顯著抑制。這說明VIGS方法成功沉默了油菜中的COIl基因。
[0098]7.目的基因沉默的油菜表現(xiàn)不育癥狀
[0099]油菜在幼苗期經(jīng)過根部浸泡侵染后，正常生長開花，到了結實期，對照植株可以正常結實，而目的基因COIl沉默的植株果莢未能正常發(fā)育，表現(xiàn)為不育，如圖6 (對照植株與目的基因沉默植株的單個果莢)，圖7。對照植株的根部侵染液為A液，組成為GV-C+GV-1，即空載體PTRV2的農(nóng)桿菌與輔助載體pTRVl農(nóng)桿菌的混合液。目的基因COIl沉默的植株根部侵染液為B液，其組成為GV-COI1+GV-1，即含有目的基因COIl的重組載體pTRV2_C0Il的農(nóng)桿菌與輔助載體PTRVl農(nóng)桿菌的混合液。實驗結果表明病毒誘導的基因沉默體系成功按預期使油菜不育，培育出油菜雄性不育株系，可作為油菜育種中的父本使用。VIGS侵染油菜中不育油菜植株的統(tǒng)計情況見表1。
[0100]表1VIGS侵染油菜中不育油菜植株的統(tǒng)計結果
[0101]
【權利要求】
1.VIGS載體系統(tǒng)在培育雙子葉雄性不育植株中的應用。
2.如權利要求1所述的VIGS載體系統(tǒng)在培育雙子葉雄性不育植株中的應用，所述雙子葉植物為十字花科植物。
3.如權利要求1或2所述的VIGS載體系統(tǒng)在培育雙子葉雄性不育植株中的應用，其特征在于:所述VIGS載體系統(tǒng)來源于煙草脆裂病毒,包括輔助病毒載體pTRVl和表達病毒載體PTRV2。
4.如權利要求3所述的VIGS載體系統(tǒng)在培育雙子葉雄性不育植株中的應用，其特征在于:所述表達病毒載體pTRV2含有植物育性調控基因。
5.如權利要求4所述的VIGS載體系統(tǒng)在培育雙子葉雄性不育植株中的應用，所述植物育性調控基因為COIl基因、MSPl基因、TDR基因或UDTl基因中的一種或多種。
6.如權利要求3-5任一所述的VIGS載體系統(tǒng)在培育雙子葉雄性不育植株中的應用，其特征在于:所述PTRVl載體包括以下結構:依次為左邊界(LB)、2X35S啟動子、2X35S啟動子驅動表達的煙草脆裂病毒RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)、富半胱氨酸16K蛋白、運動蛋白(MP)、自主剪切核酶(Rz)、轉錄終止子(N0St)、右邊界(RB);所述pTRV2載體包括以下結構:依次為左邊界(LB)、2X35S啟動子、2X35S啟動子驅動表達的煙草脆裂病毒外殼蛋白(CP)、可插入目的基因的多克隆位點(MCS)、自主剪切核酶(Rz)、轉錄終止子(N0St)、右邊界(RB)。
7.如權利要求6所述的VIGS載體系統(tǒng)在培育雙子葉雄性不育植株中的應用，其特征在于所述VIGS載體系統(tǒng)的結構如圖9所示。
8.使用權利要求3-7任一所述VIGS載體系統(tǒng)培育雙子葉雄性不育植株的方法，包括以下步驟:` Cl)克隆植物育性調控基因，構建攜帶植物育性調控基因的重組PTRV2病毒載體； (2)將攜帶植物育性調控基因的重組pTRV2病毒載體導入農(nóng)桿菌，將含攜帶植物育性調控基因的重組PTRV2病毒載體的農(nóng)桿菌配制成0D600為0.6~1.0的菌液； (3)切除植株的部分根須后，將根部浸入步驟(2)的菌液中； (4)取出侵染后的植株，經(jīng)培育，最終表現(xiàn)為不育性狀。
【文檔編號】C12N15/83GK103820490SQ201310634133
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2013年11月29日 優(yōu)先權日:2013年11月29日
【發(fā)明者】張洪博, 王文靜, 李加納, 楊小川, 馬浩然 申請人:西南大學