專利名稱：Tt1基因在提高植物抗病性中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及TTl基因在提高植物抗病性中的用途。
背景技術(shù)：
植物在自然界中經(jīng)常遭受病原物的侵害，這些病原物包括細(xì)菌、真菌、線蟲和病毒 等。對(duì)于農(nóng)作物來(lái)說(shuō)，病害是制約農(nóng)作物高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的重要因素。比如全球每年由各種病 害造成的水稻產(chǎn)量損失足以養(yǎng)活9000萬(wàn)人以上，中國(guó)常年發(fā)生面積580余萬(wàn)公頃，由于其 危害面積與危害程度日趨嚴(yán)重，已成為水稻持續(xù)高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的嚴(yán)重障礙。植物真菌病，是由植物病原真菌引起的病害，約占植物病害的70 80%。一種作 物上可發(fā)現(xiàn)幾種甚至幾十種真菌病害。主要有藻菌綱中霜霉菌(Peronospora)引起的霜霉 ??；子囊菌綱中囊殼菌(Gibberella)引起的水稻惡苗病、麥類赤霉?。粨?dān)子菌綱中銹菌引 起的銹病，黑粉菌(Ustilago)引起的黑粉病，半知菌類引起的稻瘟病、稻胡麻斑病等。稻曲病(Ustilaginoidea virens (cooke) Tak)是世界性真菌病害，屬于子囊菌綱 麥角菌科。稻曲病也是我國(guó)近幾年逐步蔓延、日趨嚴(yán)重的水稻危險(xiǎn)性病害之一。稻曲病又 稱偽黑穗病、綠黑穗病、谷花病、青粉病，俗稱“豐產(chǎn)果”。該病只發(fā)生于穗部，為害部分谷粒。 受害谷粒內(nèi)形成菌絲塊漸膨大，內(nèi)外穎裂開，露出淡黃色塊狀物，即孢子座，后包于內(nèi)外穎 兩側(cè)，呈黑綠色，初外包一層薄膜，后破裂，散生墨綠色粉末，即病菌的厚垣孢子，有的兩側(cè) 生黑色扁平菌核，風(fēng)吹雨打易脫落。河北、長(zhǎng)江流域及南方各省稻區(qū)時(shí)有發(fā)生。稻曲病的危 害損失不僅限于病粒，而且影響整個(gè)稻穗，隨著病粒的增加，結(jié)實(shí)率不斷降低，產(chǎn)量損失逐 漸加大。水稻稻瘟病作為水稻栽培中的一個(gè)主要病害，病原稱灰梨孢、稻梨孢 (Pyriculariagrisea (Cooke) Sacc)，屬半知菌亞門真菌。從秧田中的苗瘟、葉瘟到移栽大田 后的節(jié)瘟、頸瘟、谷粒瘟和葉枕瘟(葉片與葉鞘交界處)均可發(fā)病，幾乎貫穿水稻的整個(gè)生 育期，嚴(yán)重危害水稻的正常生長(zhǎng)，對(duì)產(chǎn)量構(gòu)成很大的威脅，嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)40% 50%，甚至顆 粒無(wú)收。世界各稻區(qū)均勻發(fā)生。本病在各地均有發(fā)生，其中以葉部、節(jié)部發(fā)生為多，發(fā)生后 可造成不同程度減產(chǎn)，尤其穗頸瘟或節(jié)瘟發(fā)生早而重，可造成白穗以致絕產(chǎn)。近年來(lái)，稻瘟 病年發(fā)生面積出現(xiàn)逐年增加趨勢(shì)，局部大爆發(fā)并不少見，目前，稻瘟病可能發(fā)生在國(guó)內(nèi)的任 何年頭、任何季節(jié)。赤霉病是全球性小麥主要病害之一，也是影響中國(guó)小麥生產(chǎn)的重要病害。該病 由多種鐮刀菌弓I起，有禾谷鐮孢(Fusarium graminearum Schw)、燕麥鐮孢(F. avenaceum Sacc)、黃色鐮孢(F. culmorum Sacc)、串珠鐮孢(F. moniliforme Sheld)等，都屬于半知菌 亞門真菌。小麥赤霉病從苗期至穗期均可發(fā)生，引起苗腐、基腐、稈腐和穗腐，其中以穗腐危 害最大。穗腐一般于小麥揚(yáng)花后6 IOd出現(xiàn)癥狀，最初在小穗和穎殼上呈現(xiàn)水漬狀褐色 斑點(diǎn)，后逐漸擴(kuò)展至全部小穗，病部呈褐色或青黃色，受害處的以上部分全部枯黃而死。受 害麥粒皺縮干癟，呈白色或粉紅色霉層，從而影響小麥產(chǎn)量和品質(zhì)。隨著全球性氣候變暖和 玉米-小麥輪作制度的增加，近10多年來(lái)小麥赤霉病在北美和歐洲也大面積發(fā)生，造成了嚴(yán)重的產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)損失。同樣，中國(guó)黃淮麥區(qū)和關(guān)中麥區(qū)近年來(lái)小麥赤霉病發(fā)生也日趨嚴(yán) 重，從而影響著國(guó)內(nèi)小麥主產(chǎn)區(qū)的糧食安全和食品安全。紋枯病為我國(guó)麥區(qū)常發(fā)病害。病原 Ceratobasidium cornigerum(Borud.)Rogers 稱喙角擔(dān)菌，屬擔(dān)子菌亞門真菌。小麥?zhǔn)芗y枯菌侵染后，在各生育階段出現(xiàn)爛芽、病苗枯死、 花稈爛莖、枯株白穗等癥狀。爛芽芽鞘褐變，后芽枯死腐爛，不能出土 ；病苗枯死發(fā)生在3-4 葉期，初僅第一葉鞘上現(xiàn)中間灰色，四周褐色的病斑，后因抽不出新葉而致病苗枯死；花稈 爛莖拔節(jié)后在基部葉鞘上形成中間灰色，邊緣淺褐色的云紋狀病斑，病斑融合后，莖基部呈 云紋花稈狀；枯株白穗病斑侵入莖壁后，形成中間灰褐色，四周褐色的近圓形或橢圓形眼 斑，造成莖壁失水壞死，最后病株因養(yǎng)分、水分供不應(yīng)求而枯死，形成枯株白穗。實(shí)踐證明，采用基因工程與常規(guī)育種相結(jié)合的方法，利用植物自身所攜帶抗性基 因培育和推廣抗病品種是防治和控制病害最經(jīng)濟(jì)、有效、環(huán)保的方法。但是，禾谷類作物種 類多，病害類型也多，抗病機(jī)理復(fù)雜，至今有許多問題還未被澄清。抗病基因的篩選盡管經(jīng) 過(guò)多年來(lái)的努力，至今禾谷類作物的抗病基因/蛋白質(zhì)還沒有篩選與分離出來(lái)。目前主要 從非寄主植物抗病系統(tǒng)的轉(zhuǎn)移等方面入手進(jìn)行探索。隨著分子生物技術(shù)的迅速發(fā)展和基因克隆技術(shù)的不斷完善，植物基因工程研究正 向縱深發(fā)展，抗性基因研究已由單面抗性向多面抗性(抗生物脅迫與非生物脅迫)轉(zhuǎn)移。但 是目提高植物多面抗性的備選基因還較少，需要為此提供新的有效選擇。在申請(qǐng)人之前遞 交的中國(guó)專利申請(qǐng)200810045667. 8中記載了分離自油菜的新基因，命名為TT1。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是為提高植物抗病性的轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域提供一種新的 有效選擇。本發(fā)明解決該技術(shù)問題的技術(shù)方案是提供了 TTl基因在提高植物抗病性中的用 途。其中，上述TTl基因的核苷酸序列(1)如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列或其簡(jiǎn)并序列；或O)在⑴限定的核苷酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加至少一個(gè)核苷酸衍生所 得的核苷酸序列，且與SEQ ID NO. 1的序列編碼功能相同或相似的多肽。進(jìn)一步的，上述( 為在(1)限定的核苷酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加1個(gè)或 幾個(gè)(10個(gè)以內(nèi))核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且與SEQ ID NO. 1的序列編碼功能相同 或相似的多肽。本發(fā)明同時(shí)提供了 TTl基因編碼的多肽在提高植物抗病性中的用途。上述TTl基因具有如下核苷酸序列(1)如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列或其簡(jiǎn)并序列；或O)在(1)限定的核苷酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加至少一個(gè)核苷酸衍生所 得的核苷酸序列，且與SEQ ID NO. 1的序列編碼功能相同或相似的多肽。進(jìn)一步的，上述⑵為在⑴限定的核苷酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加1個(gè)或 幾個(gè)(10個(gè)以內(nèi))核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且與SEQ ID NO. 1的序列編碼功能相同 或相似的多肽。
其中，上述用途中植物可為一般的各種農(nóng)作物。進(jìn)一步的，上述植物為禾本科 (Poaceae)植物。其中，上述用途中所述的病為真菌性病。進(jìn)一步的，上述用途中所述的病為稻瘟 病、稻曲病、紋枯病或赤霉病。進(jìn)一步的上述的方法中所述的病為水稻稻瘟病、水稻稻曲病、 小麥紋枯病或小麥赤霉病。進(jìn)一步的，上述用途為TTl基因在提高禾本科植物對(duì)真菌性病的抗性中的用途。本發(fā)明還提供了一種培育抗病植物的方法。該方法包括以下步驟(1)將上述TTl基因可操作地連于載體上的表達(dá)調(diào)控序列后，形成所述TTl基因的 重組載體；(2)將步驟(1)中的重組載體轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞；(3)經(jīng)篩選獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞，然后將轉(zhuǎn)化細(xì)胞培育成轉(zhuǎn)基因抗病植株及其后代，所述 后代包括植物種子及植物組織。上述TTl基因具有如下核苷酸序列(1)如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列或其簡(jiǎn)并序列；或O)在(1)限定的核苷酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加至少一個(gè)核苷酸衍生所 得的核苷酸序列，且與SEQ ID NO. 1的序列編碼功能相同或相似的多肽。進(jìn)一步的，上述⑵為在⑴限定的核苷酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加1個(gè)或 幾個(gè)(10個(gè)以內(nèi))核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且與SEQ ID NO. 1的序列編碼功能相同 或相似的多肽。其中，上述植物可為一般的各種農(nóng)作物。上述植物為禾本科(Poaceae)植物。其中，上述方法中所述的病為真菌性病。其中，上述方法中所述的病為稻瘟病、稻曲病、紋枯病或赤霉病。進(jìn)一步的上述的 方法中所述的病為水稻稻瘟病、水稻稻曲病、小麥紋枯病或小麥赤霉病。本發(fā)明中所述的TTl基因，其基本核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :1所示，該 基因來(lái)源于十字花科(Brassicaceae，也名Cruciferae)中芥屬(Brassica)的植物油菜 (Brassicanapus)，以油菜中的atp6基因?yàn)檎T餌蛋白，根據(jù)酵母雙雜交方法，篩選到油菜中 的一個(gè)EST序列(SEQ ID NO :3)，再根據(jù)這段篩選到的序列，通過(guò)5’ RACE的方法獲得序列 表中SEQ IDNO :1所示的核苷酸序列。然后根據(jù)SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列設(shè)計(jì)一對(duì) PCR引物，從油菜cDNA中擴(kuò)增出SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。在本發(fā)明中，“在SEQ ID NO=I中的核苷酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加至少一個(gè)核 苷酸衍生序列”的TTl基因序列一般是指編碼具有SEQ ID NO :1所編碼的蛋白活性的多肽 的核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指所述序列中有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相 同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與SEQ ID NO 1同源性低至約89%的簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQ ID NO :1所述的序列。另外，“在SEQ ID NO 1中的核苷酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加至少一個(gè)核苷酸衍生序列”的含義還包括能在 中度嚴(yán)謹(jǐn)條件下，更佳的在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO :1核苷酸序列雜交的核苷酸序列。 該術(shù)語(yǔ)還包括與SEQ ID NO :1中的核苷酸序列的同源性至少80%，較佳地至少89%，更佳 地至少90 %，最佳地至少95 %的核苷酸序列。在本發(fā)明中的相同功能是指提高植物的抗病 性。
該術(shù)語(yǔ)還包括能編碼具有與天然的SEQ ID NO :1相同功能的蛋白的SEQ ID NO=I 中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1 90個(gè)，較佳地1 60個(gè)，更佳地1 20個(gè)，最佳地1 10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或 取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為 10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。比如SEQ ID NO :5所示的核苷酸序列，其編碼的 多肽也能提高植物的抗病性。本發(fā)明所述重組載體，是將TTl基因插入到載體中獲得，上述載體可選用本領(lǐng)域 已知的各種載體，尤其是真核表達(dá)載體(如PBI121或pCAMBIA2301)。本發(fā)明用上述重組載 體轉(zhuǎn)化宿主植物細(xì)胞，篩選獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞。然后將轉(zhuǎn)化細(xì)胞培育成轉(zhuǎn)基因抗病植株及其后 代，所述后代包括植物種子及植物組織。本發(fā)明中所述的“可操作地連于”表示如下情況即線性DNA序列的某些部分能夠 影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號(hào)肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽 的分泌，那么信號(hào)肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA ；如果啟動(dòng)子控制序 列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位 置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對(duì)于分泌前 導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明提供了 TTl基因在提高植物抗病性方面的用途， 在本發(fā)明的實(shí)施例中也通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明轉(zhuǎn)入了 TTl基因并過(guò)表達(dá)的植物抗病性有了顯著的 提高。尤其是提供TTl基因在提高禾本科植物對(duì)真菌性疾病中的用途，經(jīng)試驗(yàn)證明，過(guò)表達(dá) TTl基因的多種植物對(duì)多種真菌性疾病表現(xiàn)出了良好的抗性。本發(fā)明培育出抗病植物的方 法也簡(jiǎn)便而有效，為提高植物抗病性尤其是禾本科植物對(duì)真菌病的抗性提供了新的有效選 擇，具有好的應(yīng)用前景。


圖1為轉(zhuǎn)基因水稻植株中hpt (潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，為表達(dá)載體自帶的抗性篩 選基因)基因的PCR檢測(cè)。從左至右依次為分子量MakeH片段從上到下依次為2000bp， IOOObp，750bp, 500bp, 250bp, IOObp)，陽(yáng)性對(duì)照(+)，野生型陰性對(duì)照(_)，待檢測(cè)植株1 6。圖2為轉(zhuǎn)基因水稻植株中TTl基因的PCR檢測(cè)。從左至右依次為分子量Maker (片 段從上到下依次為2000bp, 1000bp，750bp，500bp，250bp，IOObp)，陽(yáng)性對(duì)照(+)，野生型陰 性對(duì)照(_)，待檢測(cè)植株1 5。圖3為大田水稻染病情況對(duì)比圖。圖左為野生型，圖右為轉(zhuǎn)基因型，如圖可見，野 生日本晴水稻染病程度較轉(zhuǎn)基因型高。圖左圈內(nèi)麥穗上黑色斑點(diǎn)即為稻曲病霉斑。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)施例并結(jié)合附圖，進(jìn)一步說(shuō)明而不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中，凡未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的，均為按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī) 條件，例如 Sambrook，Russell 的分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York Co Id Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。下述實(shí)施例中，所用農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciensp)采用章魚堿型菌系的LBA4404菌株；大腸桿菌 (E.coli)采用DH5a菌株，菌株均購(gòu)自于Qiagen公司。表達(dá)載體I^zhOl、pCAMBIA1304購(gòu) 自于Clontech公司。其余化學(xué)實(shí)際均為市售分析純。下述實(shí)施例中，“SEQ ID NO 1”單獨(dú)出現(xiàn)時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解1其為“SEQ IDNO 1所示核苷酸序列”的簡(jiǎn)稱。實(shí)施例一TTl基因的克隆及獲取以油菜中的atp6(genebank gi :89279377)基因?yàn)檎T餌蛋白，根據(jù)酵母雙雜交方 法(見Clontech公司所公開的資料)，篩選到油菜中的一個(gè)EST序列(SEQ ID NO :3所示， 其編碼序列如SEQ ID NO 4所示)，再根據(jù)這段篩選到的序列，通過(guò)5，RACE(見Takara公 司所公開的資料)的方法獲得本發(fā)明所述提高植物抗病性的基因，其核苷酸序列如序列表 中SEQ ID NO 1所示，其編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。根據(jù)SEQ ID NO 1所示核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，上游引物5，-ATGTCGGATCATTTGAGTTTATG-3，(SEQID NO 5),下游引物5，-TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3，(SEQID NO :6)。
然后經(jīng)PCR從油菜cDNA中擴(kuò)增SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。PCR程序如下1. 95°C 4min (預(yù)變性)2. 95°C 30s (變性)3. 53°C 30s (復(fù)性)4. 72°C 50s (延伸)5. 2 4步驟循環(huán)30次6. 72 "C 5min(終延伸)7.4V保存。對(duì)PCR產(chǎn)物純化(見Qiagen公司所公開的PCR產(chǎn)物純化資料)，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，得到 序列SEQ ID NO 1的基因片段。實(shí)施例二 過(guò)表達(dá)TTl基因的水稻植株制備1、采用的水稻材料(Oryza sativa L.)為粳稻日本晴，為四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究 所保存。農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciensp)采用章魚堿型菌系的LBA4404菌株；大腸 桿菌(E. coli)采用DH5 α菌株。根據(jù)SEQ ID NO 1所示核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，構(gòu)建目的基因過(guò)量表達(dá)重組質(zhì)粒上游引物5，-CGC GGATCCATGTCGGATCATTTGAGTTTATG-3‘ (SEQ ID NO 7),下游引物5‘ -CCGGAGC TCTCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3‘ (SEQ ID NO :8)。經(jīng)PCR，從油菜cDNA中擴(kuò)增完整的SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列，PCR程序如下1. 95°C4min (預(yù)變性)2. 95°C30s (變性)3. 53°C30s (復(fù)性)
4. 72 "C5. 2 6. 72 "C7. 4"C
50s (延伸) 4步驟 循環(huán)30次
5min (終延伸)保存。對(duì)PCR產(chǎn)物純化(見Qiagen公司所公開的資料)，然后用BamHl與Mcl酶切，膠 回收，與載體I3ZhOl連接(連接位點(diǎn)=BamHl與Mel)，獲得含SEQ ID NO :1序列的過(guò)量表達(dá) 重組質(zhì)粒。在大腸桿菌DH5ci中繁殖后，提取質(zhì)粒(見Qiagen公司公開資料)，將含SEQID NO 1的過(guò)量表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404中。2、外植體培養(yǎng)方法幼胚愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代取田間開花后12-15天的水稻未成熟穎果，剝殼后 在75%酒精中浸泡1分鐘，用無(wú)菌水沖洗干凈后，0. 升汞滅菌20分鐘，再用無(wú)菌水沖洗 干凈。在超凈工作臺(tái)上晾干，用鑷子剝?nèi)∮着呓臃N在誘導(dǎo)培養(yǎng)基(NB+2，4-D 2.5mg/L)上， 于^TC下暗培養(yǎng)。一周后統(tǒng)計(jì)愈傷組織的誘導(dǎo)情況并進(jìn)行繼代，以后每2周繼代一次。成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代選取外觀健康，飽滿，無(wú)病斑的成熟種子脫去穎 殼，75%酒精中浸泡1分鐘，用無(wú)菌水沖洗干凈后，0. 1 %升汞滅菌20分鐘，再用無(wú)菌水沖洗 干凈。在超凈工作臺(tái)上晾干，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，于26°C下暗培養(yǎng)。2周后統(tǒng)計(jì)愈傷組織 的誘導(dǎo)情況并進(jìn)行繼代，以后每2周繼代一次。3、水稻基因轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)方法3-1工程菌的活化用無(wú)菌牙簽在平板上挑取農(nóng)桿菌單菌落，放在IOmlYEP培養(yǎng)液(酵母提取物 (YeastExtract) IOg+ 姨蛋白腺(Tryptone) 5g+NaCl IOg+ 力口 /K 至 1L+Rif 50 μ g/mL+Hyg 25μ g/mL)中培養(yǎng)；或著取保存于_20°C冰箱無(wú)菌農(nóng)桿菌菌液50-100 μ 1于2ml的含相應(yīng) 抗生素的YEP培養(yǎng)基上，250r/min, 培養(yǎng)過(guò)夜。取過(guò)夜培養(yǎng)液300 μ 1于3ml的含相應(yīng) 抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中，在250r/min，28°C的條件下遮光振動(dòng)培養(yǎng)，至菌液達(dá)0D600 = 0.5左右，即可用于轉(zhuǎn)化。上述含目的基因的菌液在無(wú)菌的50ml的離心管中以5000r/min離心5分鐘后回 收菌體，用30ml的NBCO (NB+2，4_D 2. Omg/L+AS (乙酰丁香酮)100 μ mol/L)液體培養(yǎng)基重 懸含目的基因的菌體。選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的，顆粒狀胚性愈傷組織用無(wú)菌鑷子將其適當(dāng)夾 小，創(chuàng)造傷口，然后放在菌液中浸泡，一般浸染時(shí)間為10 30min，之后放入有濾紙的平皿 中吸干多余菌液。3-2共培養(yǎng)將吸干菌液的愈傷置于NBC0(NB+2，4-D 2. Omg/L+AS (乙酰丁香酮)100 μ mol/L) 固體培養(yǎng)基上，共培養(yǎng)培養(yǎng)基上放1層濾紙，濾紙上放愈傷組織。22-25°C暗培養(yǎng)2-3天，直 至愈傷組織上出現(xiàn)少量菌斑為止。3-3脫菌與篩選共培養(yǎng)的愈傷組織放在廣口瓶中，用無(wú)菌水清洗至清澈，再浸泡于含Cef(頭孢霉 素)500mg/l NBCO液體培養(yǎng)基中，在搖床上中速振蕩30-60min，棄液，將愈傷組織用無(wú)菌濾 紙吸干或在超凈工作臺(tái)上吹干后接放在一篩培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)三周，再轉(zhuǎn)入二篩培養(yǎng)基上暗 培養(yǎng)三周，溫度控制在25-27 °C。
3-4分化與生根選擇將兩次篩選后新長(zhǎng)出的抗性愈傷組織接種到預(yù)分化培養(yǎng)基(NB+KTlmg/L+NAA 0. 25mg/L)上，暗培養(yǎng) 10 天。再轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基(NB+KTlmg/L+NAA 0. 25mg/L+6_BAlmg/ L+Hyg(潮霉素)25mg/L)上光照培養(yǎng)，用日光燈每天照明12小時(shí)，溫度控制在25_27°C。約 1-2個(gè)月，可獲得2cm左右高的幼苗。將幼苗轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，當(dāng)根長(zhǎng)到2cm左右高 時(shí)取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，移栽于大田。3-5轉(zhuǎn)基因水稻的檢測(cè)3-5-1取一小片再生植株新鮮葉片，抽提總DNA(見Qiagen公司所公開的資料)， 以提取的DNA做模板，分別進(jìn)行檢測(cè)。3-5-1-1轉(zhuǎn)基因水稻植株中hpt基因的PCR檢測(cè)hpt基因的PCR引物序列為hpt-Ι :5，-TAGGAGGGCGTGGATATGTC-3，(SEQ ID NO 9)hpt-2 :5，-TACACAGCCATCGGTCCAGA-3，(SEQ ID NO 10)。PCR程序如下1. 95°C4min (預(yù)變性)2. 95°C30s (變性)3. 53°C30s (復(fù)性)4. 72°C50s (延伸)5. 2 4步驟 循環(huán)37次6. 72 "C 5min (終延伸)7.4V 保存以上PCR反應(yīng)完成后，在瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)是否有目標(biāo)條帶出現(xiàn)，若有則代 表目的基因已轉(zhuǎn)入水稻中，如圖1。3-5-1-2轉(zhuǎn)基因水稻植株中TTl基因的PCR檢測(cè)TTl基因的PCR引物序列為上游引物TTl-I :5，-ATTTCATTTGGAGAGAACACGG-3，(SEQ ID NO 11)下游引物TT1-2 :5，-TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATATTG-3，(SEQ ID N0:12)。PCR程序如下1. 95°C4min (預(yù)變性)2. 95"C30s (變性)3. 53"C30s (復(fù)性)4. 72"C50s (延伸)5. 2 4步驟 循環(huán)37次6. 72 "C5min (終延伸)7.4V保存以上PCR反應(yīng)完成后，在瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)。若有目標(biāo)條帶出現(xiàn)則代表目的 基因已轉(zhuǎn)入水稻中，見圖2。繼續(xù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植株，留種以備后續(xù)試驗(yàn)。實(shí)施例三過(guò)表達(dá)TTl基因的小麥植株制備1、采用的小麥材料為 Bobwhite。農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciensp)采用章魚堿型菌系的LBA4404菌株；大腸桿菌(E. coli)采用DH5 α菌株，構(gòu)建目的基因過(guò)量表達(dá) 重組質(zhì)粒pCAMBIA1304(具體方法參見本發(fā)明實(shí)施例二)。2、外植體培養(yǎng)方法幼胚愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代采集揚(yáng)花后12-15天的麥穗，取小麥幼穗中部大小 一致的未成熟子粒，將幼胚消毒后接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(NB+2，4-D 2mg/L)表面， 25°C下暗培養(yǎng)，20d后轉(zhuǎn)入相同培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)。3、小麥基因轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)方法3-1工程菌的活化用無(wú)菌牙簽在平板上挑取農(nóng)桿菌單菌落，放在IOmlYEP培養(yǎng)液(酵母提取物 (YeastExtract) IOg+ 姨蛋白腺(Tryptone) 5g+NaCl IOg+ 力口 /K 至 1L+Rif 50 μ g/mL+Hyg 25μ g/mL)中培養(yǎng)；或著取保存于_20°C冰箱無(wú)菌農(nóng)桿菌菌液50-100 μ 1于2ml的含相應(yīng) 抗生素的YEP培養(yǎng)基上，250r/minJ8°C培養(yǎng)過(guò)夜。取過(guò)夜培養(yǎng)液300 μ 1于3ml的含相應(yīng) 抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中，在250r/min，28°C的條件下遮光振動(dòng)培養(yǎng)，至菌液達(dá)0D600 = 0.5左右，即可用于轉(zhuǎn)化。上述含目的基因的菌液在無(wú)菌的50ml的離心管中以5000r/min離心5分鐘后回 收菌體，用30ml的NBCO (NB+2，4_D 2. Omg/L+AS (乙酰丁香酮)100 μ mol/L)液體培養(yǎng)基重 懸含目的基因的菌體。選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的，顆粒狀胚性愈傷組織用無(wú)菌鑷子將其適當(dāng)夾 小，創(chuàng)造傷口，然后放在菌液中浸泡，一般浸染時(shí)間為10 30min，之后放入有濾紙的平皿 中吸干多余菌液。3-2共培養(yǎng)將吸干菌液的愈傷置于NBC0(NB+2，4-D 2. Omg/L+AS (乙酰丁香酮)100 μ mol/L) 固體培養(yǎng)基上，共培養(yǎng)培養(yǎng)基上放1層濾紙，濾紙上放愈傷組織。2416°C暗培養(yǎng)3-4天，直 至愈傷組織上出現(xiàn)少量菌斑為止。3-3脫菌與篩選共培養(yǎng)的愈傷組織放在廣口瓶中，用無(wú)菌水清洗至清澈，再浸泡于含Cef(頭孢霉 素)500mg/l NBCO液體培養(yǎng)基中，在搖床上中速振蕩30-60min，棄液，將愈傷組織用無(wú)菌濾 紙吸干或在超凈工作臺(tái)上吹干后接放在繼代培養(yǎng)基上，避光恢復(fù)培養(yǎng)15-20天繼代一次。 培養(yǎng)30天后，轉(zhuǎn)到篩選培養(yǎng)基上，培養(yǎng)15天。3-4分化與生根選擇將篩選后新長(zhǎng)出的抗性愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基(NB+KT lmg/L+NAA 0. 5mg/L+6-BA lmg/L+潮霉素25mg/L)上光照培養(yǎng)，用日光燈每天照明12小時(shí)，溫度控制在 25-27°C。試管苗經(jīng)過(guò)在壯苗生根培養(yǎng)基中生根、壯苗后，移入花盆，長(zhǎng)至10-15cm時(shí)移栽于 大田。3-5轉(zhuǎn)基因小麥的檢測(cè)取一小片再生植株新鮮葉片，抽提總DNA(見Qiagen公司所公開的資料)，以提取 的DNA做模板，進(jìn)行檢測(cè)。TTl基因的PCR引物序列為TTl-I :5，-ATTTCATTTGGAGAGAACACGG-3，(SEQ ID NO 11)TT1-2 :5，-TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATATTG-3，(SEQ ID NO 12)。
PCR反應(yīng)完成后，在瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)。若有目標(biāo)條帶出現(xiàn)則代表目的基因已 轉(zhuǎn)入小麥中。繼續(xù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植株，留種以備后續(xù)試驗(yàn)。實(shí)施例四水稻稻曲病抗性測(cè)試1、孢子懸浮液的制備采用組織培養(yǎng)法對(duì)稻曲球進(jìn)行組織切割，然后置于馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)液(稱取去皮 馬鈴薯小塊200克，加水1000毫升，煮沸20分鐘后，過(guò)濾。在濾汁中補(bǔ)足水分到1000毫 升，即成20%馬鈴薯煮汁。在20%馬鈴薯煮汁中加入20克蔗糖，煮沸，使它溶解后，補(bǔ)足水 分，分裝，滅菌，備用。使用該培養(yǎng)基對(duì)PH值要求不嚴(yán)格，可以不測(cè)定。)中，放在搖床上進(jìn) 行27°C和130rpm的振蕩培養(yǎng)，5天后可獲得大量菌絲和薄壁分生孢子。然后將振蕩培養(yǎng)液 倒人組織搗碎機(jī)，高速打碎菌絲，形成菌絲片段與薄壁分生孢子的混合液，用4%的馬鈴薯 煮汁(稱取馬鈴薯小塊40克，加水1000毫升，煮沸20分鐘后，過(guò)濾。在濾汁中補(bǔ)足水分到 1000毫升，即成4%馬鈴薯煮汁)稀釋2倍后備用。2、接種稻曲病侵染的時(shí)期在水稻孕穗至開花期侵染為主，抽穗揚(yáng)花期遇雨及低溫則發(fā)病 重。為鑒定轉(zhuǎn)基因水稻的抗病性，此實(shí)驗(yàn)選取田中抽穗前3-10天的水稻植株進(jìn)行抗病實(shí) 驗(yàn)。用馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)液培養(yǎng)的病菌分生孢子，在多數(shù)植株抽穗前3-10天進(jìn)行第1次 噴霧接種，第2次在多數(shù)植株抽穗達(dá)20% -60%進(jìn)行，接種于下午4-6時(shí)進(jìn)行。在接種液里 添加少量吐溫，噴霧時(shí)要求整個(gè)穗部能見到菌液。3、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)于品種的臘熟期轉(zhuǎn)黃熟期，即大約于第2次接種后25-30天進(jìn)行調(diào)查。調(diào)查內(nèi)容 包括病叢數(shù)和不同病粒的穗數(shù)，每個(gè)株系50叢穗，計(jì)算病叢率、病穗率(結(jié)果見表1)。表1病叢率、病穗率檢測(cè)結(jié)果
權(quán)利要求
1.TTl基因在提高植物抗病性中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述TTl基因具有如下核苷酸序列 (1)如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；或O)在(1)限定的核苷酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加至少一個(gè)核苷酸衍生所得的 核苷酸序列，且與SEQ ID NO :1的序列編碼功能相同或相似的多肽。
3.TTl基因編碼的多肽在提高植物抗病性中的用途。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于所述TTl基因具有如下核苷酸序列 (1)如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；或O)在(1)限定的核苷酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加至少一個(gè)核苷酸衍生所得的 核苷酸序列，且與SEQ ID NO :1的序列編碼功能相同或相似的多肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 4任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于所述的植物為禾本科的植物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 5任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于所述的病為真菌性病。
7.根據(jù)權(quán)利要求1 6任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于所述的病為稻瘟病、稻曲病、紋 枯病或赤霉病。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于所述的病為水稻稻瘟病、水稻稻曲病、小麥 紋枯病或小麥赤霉病。
9.一種培育抗病植物的方法，其特征在于包括以下步驟(1)將TTl基因可操作地連于載體上的表達(dá)調(diào)控序列后，形成所述TTl基因的重組載體；(2)將步驟(1)中的重組載體轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞；(3)經(jīng)篩選獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞，然后將轉(zhuǎn)化細(xì)胞培育成轉(zhuǎn)基因抗病植株及其后代，所述后代 包括植物種子及植物組織。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述TTl基因具有如下核苷酸序列 (1)如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；或O)在(1)限定的核苷酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加至少一個(gè)核苷酸衍生所得的 核苷酸序列，且與SEQ ID NO 1的序列編碼功能相同或相似的多肽。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的方法，其特征在于所述的植物為禾本科植物。
12.根據(jù)權(quán)利要求9或10或11所述的方法，其特征在于所述的病為真菌性病。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于所述的病為稻瘟病、稻曲病、紋枯病或赤 霉病。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于所述的病為水稻稻瘟病、水稻稻曲病、小 麥紋枯病或小麥赤霉病。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及TT1基因在提高植物抗病性中的用途。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是為提高植物抗病性的轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域提供一種新的有效選擇。本發(fā)明解決技術(shù)問題的技術(shù)方案是提供了TT1基因在提高植物抗病性方面的用途，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明轉(zhuǎn)入了TT1基因并過(guò)表達(dá)的植物，尤其是禾本科植物對(duì)多種疾病都表現(xiàn)出了良好的抗性。本發(fā)明培育出抗病植物的方法也簡(jiǎn)便而有效，為本領(lǐng)域提供了新的有效選擇。
文檔編號(hào)C12N15/29GK102127553SQ20101059362
公開日2011年7月20日 申請(qǐng)日期2010年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月18日
發(fā)明者楊毅 申請(qǐng)人:四川貝安迪生物基因工程有限公司