專利名稱：脂肪酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物化工領(lǐng)域，特別地涉及脂肪酶，編碼該脂肪酶的多核苷酸，含有該 多核苷酸的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)化體，以及制備該脂肪酶的方法。
背景技術(shù)：
脂肪酶是指水解羧酸甘油三酯中酯鍵的脂肪酶，它主要是催化甘油三酯為甘油二 酯、單甘酯、脂肪酸和甘油。從1834年發(fā)現(xiàn)兔胰脂肪酶到現(xiàn)在已經(jīng)100多年。脂肪酶具有 催化疏水性的油脂變成水溶性的脂肪酸和甘油的生物功能，在無(wú)機(jī)溶劑中的保持高催化活 力和極強(qiáng)穩(wěn)定性，以及脂肪酶對(duì)底物的廣譜性/特殊專一性，賦予了脂肪酶在食品油脂加 工工業(yè)、洗滌劑工業(yè)、酯鍵化合物的合成和手性藥物合成等工業(yè)的巨大應(yīng)用價(jià)值。文獻(xiàn)報(bào)道 2004年全球商業(yè)用酶的規(guī)模約為20億美元，并預(yù)計(jì)以3. 3%的年增長(zhǎng)速率到2009年市場(chǎng) 規(guī)模達(dá)23. 5億美元市場(chǎng)規(guī)模。脂肪酶已經(jīng)成為蛋白酶、淀粉酶之后的第三大工業(yè)用酶。然而，目前脂肪酶的生產(chǎn)效率仍然較低和生產(chǎn)成本也較高。因而現(xiàn)有的脂肪酶生 產(chǎn)技術(shù)仍有待改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問(wèn)題之一。為此，本發(fā)明需要 提供一種新型的脂肪酶。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，提供了一種脂肪酶，其由下列氨基 酸序列構(gòu)成AASPRANDAP IVLLHGFTGff GREEMLGFKY WGGVRGDIEQffLNDNGYRTY TLAVGPLSSN WDRACEAYAQ LVGGTVDYGA AHAAKHGHARFGRTYPGLLP ELKRGGRVHI IAHSQGGQTA RMLVSLLENG SQEEREYAKAHNVSLSPLFE GGHHFVLSVT TIATPHDGTT LVNMVDFTDR FFDLQKAVLKAAAVASNVPY TSQVYDFKLD QffGLRRQPGE SFDHYFERLK RSPVffTSTDTARYDLSIPGA EKLNQffVQAS PNTYYLSFST ERTHRGALTG NYYPELGMNAFSAVVCAPFL GSYRNEALGI DDRffLENDGI VNTVSMNGPK RGSSDRIVPYDGTLKKGVffN DMGTCNVDHL EVIGVDPNPS FDIRAFYLRL AEQLASLRP(SEQ IDNO :1)。另外，在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，還提供了 一種編碼上述脂 肪酶的多核苷酸，其包含下列核苷酸序列GCG GCA TCC CCG CGC GCC AAT GAT GCA CCG ATCGTG CTG CTG CAT GGT TTT ACG GGC TGG GGT CGT GAAGAA ATG CTG GGC TTC AAA TAT TGG GGC GGC GTG CGTGGC GAT ATC GAA CAG TGG CTG AAC GAT AAC GGC TATCGT ACG TAT ACG CTG GCG GTG GGC CCG CTG TCG AGCAAC TGG GAT CGC GCG TGT GAA GCG TAC GCC CAG CTGGTG GGC GGC ACG GTG GAT TAT GGC GCG GCC CAT GCGGCG AAA CAC GGT CAT GCG CGC TTT GGC CGC ACG TATCCG GGC TTG CTG CCG GM TTG MA AGA GGC GGC CGCGTG CAT ATC ATC GCG CAT AGC CAG GGC GGC CAG ACGGCC CGC ATG CTG GTG TCT CTG CTA GAA AAC GGC AGCCAG GAA GAA CGC GAA TAC GCC AAA GCG CAT AAC GTGTCG TTG TCG CCG TTG TTT GAA GGC GGC CAT CAT TTTGTG TTG AGT GTG ACG ACC ATT GCC ACG CCG CAT GATGGT ACG ACG CTG GTG AAT ATG GTG GAT TTC ACGGATCGC TTC TTT GAT CTG CAG AAA GCG GTG TTG AAA GCGGCG GCG GTG GCC AGC AAT GTG CCG TAC ACG AGT CAGGTT TAC GAT TTT AAA CTG GAT CAG TGG GGT CTG CGCCGC CAG CCG GGT GM TCG TTC GAT CAT TAT TTT GMCGC CTG AM CGT TCC CCG GTT TGG ACG TCG ACGGAT ACG GCC CGC TAC GAT TTA TCC ATT CCG GGC GCGGAA AAA TTG AAT CAG TGG GTG CAG GCC AGC CCG AATACG TAT TAT TTG AGC TTT TCC ACC GAA CGC ACG CACCGC GGC GCG CTG ACC GGC AAC TAT TAT CCG GAA CTGGGC ATG AAT GCA TTC AGC GCG GTG GTT TGC GCC CCGTTT CTG GGC TCG TAC CGC AAT GAA GCG CTG GGC ATTGAT GAT CGC TGG CTG GAA AAC GAT GGC ATC GTG AACACG GTT TCG ATG AAC GGT CCG AAA CGT GGC TCG AGCGAT CGC ATC GTG CCG TAT GAT GGT ACG TTG AAAAAA GGC GTT TGG AAT GAT ATG GGT ACG TGC AACGTG GAT CAT TTG GAA GTG ATC GGC GTT GAT CCGAAT CCG TCG TTT GAT ATC CGC GCC TTT TAT TTGCGT CTG GCC GAA CAG TTG GCG AGT TTG CGC CCG TAA (SEQ ID NO :2)。根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí) 施例，上述多核苷酸為DNA序列。在本發(fā)明的又一方面中，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，提供了一種表達(dá)載體，其包含上述 的多核苷酸序列。在本發(fā)明的另外一方面中，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，提供了一種轉(zhuǎn)化體，該轉(zhuǎn)化體是 通過(guò)利用上述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞獲得的。在本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施例中，所述宿主細(xì) 胞選自大腸桿菌(E. coli)、酵母和曲霉。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，還提供了一種制備脂肪酶的方法，其包括下列步驟a)在適于脂肪酶表達(dá)的條件下培養(yǎng)前述的轉(zhuǎn)化體，以便表達(dá)脂肪酶；以及b)分離所述脂肪酶。根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施例，所述步驟a)中包括添加誘導(dǎo)劑。根據(jù)本發(fā)明的進(jìn) 一步的實(shí)施例，所述誘導(dǎo)劑為選自乳糖和IPTG的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的又一實(shí)施例，所 述步驟b)包括b-l)超聲破碎轉(zhuǎn)化體獲得裂解液；和b-幻從所述裂解液分離純化所述脂肪酶。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所獲得的脂肪酶具有高酶促活性，并且利用根據(jù)本發(fā)明實(shí) 施例的制備方法能夠以高生產(chǎn)效率制備脂肪酶。本發(fā)明附加的方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變 得明顯，或通過(guò)本發(fā)明的實(shí)踐了解到。


本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對(duì)實(shí)施例的描述中將變 得明顯和容易理解，其中圖 1 顯示 PEASY-BTL2-M0BL21 (DE3)培養(yǎng)物的 SDS-PAGE 結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例。所描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明， 而不能解釋為對(duì)本發(fā)明的限制。下文的公開提供了許多不同的實(shí)施例或例子用來(lái)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的不同實(shí)施方式。為 了簡(jiǎn)化本發(fā)明的公開，下文中對(duì)特定實(shí)施例或示例進(jìn)行描述。當(dāng)然，它們僅僅為示例，并且目的不在于限制本發(fā)明。此外，本發(fā)明提供了的各種特定工藝和材料的例子，本領(lǐng)域普通技 術(shù)人員可以意識(shí)到其他工藝的可應(yīng)用性和/或其他材料的使用。除非另有說(shuō)明，本發(fā)明的 實(shí)施將采用本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)的化學(xué)、分子生物學(xué)等領(lǐng)域的傳統(tǒng)技術(shù)。另外， 除非另有說(shuō)明，在本文中，核酸以5’至3’的方向從左向右書寫，氨基酸序列則以氨基端到 羧基端的方向從左向右書寫。本發(fā)明是基于下列事實(shí)完成的將現(xiàn)有來(lái)自Bacillus thermocatenulatus的脂 肪酶基因2 (簡(jiǎn)稱為BTL2，其序列參見SEQ ID NO :3)中5’端部分序列切除后獲得的蛋白 質(zhì)具有高脂肪酶活性，另外申請(qǐng)人驚奇地發(fā)現(xiàn)在將編碼脂肪酶的基因中進(jìn)行若干突變后， 其表達(dá)脂肪酶的效率得到顯著提高。脂肪酶在本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“脂肪酶”是指具有催化甘油三酯為甘油二酯、單甘酯、脂 肪酸和甘油活性的蛋白質(zhì)(多肽)。在本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”和“多肽”是可以互 換的，其是指若干個(gè)氨基酸殘基通過(guò)肽鍵連接所形成的寡聚物或者高聚物。通常而言，蛋白 質(zhì)或多肽的序列可以由三字母或者單字母縮寫表示的氨基酸序列來(lái)表征。在本發(fā)明中采用 了單字母來(lái)作為氨基酸的縮寫，其含義是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，提供了一種脂肪酶，其具有SEQ ID NO :1所示氨基酸序 列。與 Bacillus thermocatenulatus 的脂肪酶基因 2 (BTL2 基因，SEQ ID NO 3)所編碼的 脂肪酶(BTU)相比，本發(fā)明的脂肪酶的N末端被截短觀個(gè)氨基酸。本發(fā)明的脂肪酶可以 由將BTL2基因的5，端部分序列(下面SEQ ID NO 3中下劃線的84個(gè)堿基)切除后而獲 得的多核苷酸序列編碼ATG ATG AAA GGC TGC CGG GTG ATG GTT GTG TTGCTT GGA TTA TGG TTT GTG TTC GGC CTG TCG GTCCCG GGA GGG CGG ACG GM GCG GCA TCC CCA CGC GCCMT GAT GCA CCC ATC GTG CTT CTC CAT GGG TTT ACAGGA TGG GGG CGA GAG GAA ATG CTT GGA TTC AAA TATTGG GGC GGC GTG CGT GGC GAT ATC GAA CAA TGG CTGAAC GAC AAC GGA TAT CGT ACG TAT ACG CTG GCG GTCGGA CCG CTC TCG AGC AAC TGG GAC CGG GCG TGT GAAGCG TAC GCC CAG CTT GTC GGC GGA ACG GTC GAT TATGGC GCG GCC CAT GCG GCG AAG CAC GGT CAT GCG CGGTTT GGC CGC ACG TAT CCG GGC TTG CTG CCG GAA TTGMA AGA GGC GGC CGC GTC CAT ATC ATC GCT CAT AGCCAA GGA GGA CAG ACG GCC CGC ATG CTT GTG TCT CTCCTA GAG AAC GGA AGC CAA GAA GAG CGG GAG TAC GCCAAG GCG CAT AAC GTG TCG TTG TCG CCG TTG TTT GAAGGC GGA CAT CAT TTT GTG TTG AGT GTG ACA ACC ATTGCC ACT CCT CAT GAC GGG ACG ACA CTT GTC AAT ATGGTC GAT TTC ACT GAT CGC TTC TTT GAC CTG CAA AAAGCG GTG TTG AAA GCG GCG GCT GTC GCC AGC AAT GTGCCG TAC ACG AGT CAA GTA TAC GAT TTT AAG CTC GACCAA TGG GGG CTG CGC CGC CAG CCG GGT GAA TCGTTC GAC CAT TAT TTT GAA CGG CTC AAA CGA TCCCCT GTT TGG ACG TCG ACG GAT ACT GCC CGC TAC GATTTA TCC ATT CCC GGA GCT GAG AAG TTG AAT CAA TGGGTG CAA GCC AGC CCG AAT ACG TAT TAT TTG AGC TTTTCC ACC GAA CGG ACG CAC CGC GGA GCG CTC ACC GGCAAC TAT TAT CCC GAA CTC GGA ATG AAT GCA TTC AGCGCG GTC GTA TGC GCC CCG TTT CTC GGC TCG TAC CGCAAT GAG GCG CTC GGC ATT GAC GAC CGC TGG CTG GAGAAC GAT GGC ATC GTC AAC ACG GTT TCG ATG AAC GGTCCA AAG CGT GGA TCA AGC GAT CGG ATC GTG CCGTAT GAC GGG ACG TTG AAA AAA GGA GTT TGG AATGATATG GGG ACG TGC AAC GTC GAC CAT TTG GAAGTG ATC GGC GTT GAC CCG AAT CCG TCA TTT GATATC CGC GCC TTT TAT TTG CGA CTT GCC GAG CAGTTG GCG AGT TTG CGG CCT TAA(SEQ ID NO 3, BTL2 基因序列)。申請(qǐng)人:發(fā)現(xiàn)在將BTL2的N端截短觀個(gè)氨基酸后獲得的脂肪酶(即本發(fā)明的脂肪 酶)與BTL2脂肪酶相比，具有更高的脂肪酶活性。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，從多核苷酸序列中除去預(yù)定部分序列的方法不受特別限 制，例如可以采用PCR方法。另外，在本發(fā)明的實(shí)施例中，可以通過(guò)任何已知的方法鑒定所 表達(dá)蛋白質(zhì)的脂肪酶活性。多核苷酸在本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”可以包括DNA或者RNA，它們可以是單鏈或者 多鏈的。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，作為遺傳密碼簡(jiǎn)并性的結(jié)果，許多不同的多核苷酸能夠 編碼相同的多肽。另外，應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠使用常規(guī)的技術(shù)進(jìn)行核苷酸取代， 所述取代不會(huì)影響本發(fā)明中所使用的多核苷酸編碼的多肽序列。另外，還可以使用本領(lǐng)域 中的已知的方法對(duì)多核苷酸進(jìn)行修飾，以增強(qiáng)本發(fā)明多核苷酸在體內(nèi)的活性或者存活期。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，提供了一種多核苷酸，其可以編碼一種蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具 有SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)遺傳密碼表，基于SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，設(shè)計(jì) 多種多核苷酸，進(jìn)而獲得氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示、具有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，提供了一種編碼脂肪酶的多核苷酸，其包含SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列。該多核苷酸所編碼的脂肪酶與BTL2脂肪酶相比缺失N末端的觀 個(gè)氨基酸。在本文中，將SEQ ID N0:1所示的脂肪酶基因命名為BTL2-M。申請(qǐng)人驚奇地發(fā) 現(xiàn)利用BTL2-M能夠以比其它核苷酸序列高得多的產(chǎn)率表達(dá)脂肪酶蛋白。SEQ ID N0:1所示 的核苷酸序列與BTL2脂肪酶基因的序列(SEQ ID NO 3)相比，缺失了 5，端的84個(gè)堿基， 并且在108個(gè)核苷酸位點(diǎn)存在核苷酸堿基突變。BTL2-M與BTL-O (對(duì)應(yīng)BTL2脂肪酶基因切 除5’末端84個(gè)堿基的多核苷酸序列)的比對(duì)結(jié)果如下所示BTL2-M1 GCGGCATCCCCGCGCGCCAATGATGCACC GATCGTGCTGCTGCATGGTTTTACGGGCTGG 60I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I IBTL2--01 Gr C GGC AT CCC CACGCGC CAA TGAT GCACCATCGTGCTT CT CCA TG GGT TTACAGG ATG G60
AASRANDA IVHiPW
BTL2--M61G GTC GT GAA GAAATGC TGG GCTT CAAAATTGGGGCGG CG TGC GT GGC GATATCG AAC AG120I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I IB T L 2-0 61 GGGCGAGAGGAAATGCTTGGATTCAAAT ATTGGGGCGGCGTGCGTGGCGATATCGAACAA 120I·； M FKYffGGVRGDIEQ
BTL2-M121TGGCTGAACGATAACGGCTATCGTACGTATACGCTG GC GGTGGGCCCGCTGTCGAGCAAC180
III
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BTL2-M181TGGGATCGCGCGTGTGAAGCGTACGCCCAGCTGGTG GG CGGCACGGTGGATTATGGCGCG240
III
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BTL2-M241GCCCATGCGGCGAAACACGGTCATGCGCGCTTTGGC CG CACGTATCCGGGCTTGCTGCCG300
II
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[0075 [0076
0077
0078
[0079 [0080
008
0082
[0083 [008權(quán)利要求
1.一種脂肪酶，其由SEQ ID NO 1的氨基酸序列構(gòu)成。
2.一種編碼權(quán)利要求1所述脂肪酶的多核苷酸，其包含SEQ ID NO :1的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多核苷酸，其為DNA序列。
4.一種表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求2所述的多核苷酸。
5.一種轉(zhuǎn)化體，其是通過(guò)利用權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞獲得的。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)化體，其中，所述宿主細(xì)胞選自大腸桿菌、酵母和曲霉。
7.一種制備脂肪酶的方法，其包括下列步驟a)在適于脂肪酶表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求5或6所述的轉(zhuǎn)化體；以及b)分離所述脂肪酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述步驟a)中包括添加誘導(dǎo)劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述誘導(dǎo)劑為選自乳糖和IPTG的至少一種。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述步驟b)包括 b-Ι)超聲破碎轉(zhuǎn)化體獲得裂解液；和b-2)從所述裂解液分離純化所述脂肪酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種脂肪酶，其由SEQ ID NO1的氨基酸序列構(gòu)成。還公開了編碼該脂肪酶的多核苷酸，含有該多核苷酸的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)化體，以及制備該脂肪酶的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的脂肪酶具有顯著大于現(xiàn)有脂肪酶的活性，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的脂肪酶的制備方法具有較高的產(chǎn)率。
文檔編號(hào)C12N15/09GK102120991SQ20101059910
公開日2011年7月13日 申請(qǐng)日期2010年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月21日
發(fā)明者劉德華, 杜偉, 歐先金 申請(qǐng)人:清華大學(xué)