專利名稱：一種固定化活性益生菌及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及飼料和飼料添加劑領(lǐng)域，具體為一種固定化活性益生菌的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
抗生素藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的限制使用迫切需要其替代物，益生菌因?yàn)樵诖龠M(jìn)動(dòng)物健康方面的獨(dú)特作用已引起研究者越來越多的關(guān)注?？莶菅挎邨U菌是我國農(nóng)業(yè)部正式批準(zhǔn)使用的益生菌，具有菌種單一、對抗生素?zé)o耐藥性及對水產(chǎn)動(dòng)物無毒性等特點(diǎn)，枯草芽孢桿菌因能耐受飼料制備過程中高溫(100°c)高壓，因此非常適用于飼料添加劑?？莶菅挎邨U菌繁殖過程中分泌大量的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶，提高宿主消化酶濃度，也能合成維生素和輔酶因子提高動(dòng)物消化酶活性。并且其細(xì)胞的脂磷壁酸LTA和肽聚糖-磷壁酸復(fù)合物還具有很強(qiáng)的免疫佐劑活性作用，因此能提高動(dòng)物免疫力。此外，枯草芽孢桿菌大量好氧，能形成腸道厭氧環(huán)境，有益于乳酸菌等有益菌增殖，完善腸道生物屏障的作用，抵抗病原菌的定植和侵害。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，其作為飼料添加劑能顯著提高水產(chǎn)動(dòng)物增重率、免疫力和抗病力，作為水體修復(fù)劑在降低水體氨氮、亞硝酸鹽和COD等污染物中有明顯作用。麥飯石是一種高效無毒的藥物礦石，在我國資源豐富。它含有多種對生物生長發(fā)育有益的常量、微量元素以及被稱作動(dòng)物生長調(diào)節(jié)劑的稀土元素和微量氨基酸，因其具有礦化性、吸附性，現(xiàn)已廣泛用于礦化飲用水生產(chǎn)，并且可以有效捕獲水體中重金屬和細(xì)菌。 麥飯石作為載體用于益生菌固定載體擴(kuò)大了麥飯石的使用范圍，該方法避免微生物在水體中懸浮流失并保證細(xì)胞酶活性不受影響，現(xiàn)已廣泛用于水質(zhì)凈化。當(dāng)前，我國海參、鮑魚等水產(chǎn)動(dòng)物高密度養(yǎng)殖導(dǎo)致水體嚴(yán)重污染，極易產(chǎn)生致病菌大量滋生，一旦外界環(huán)境發(fā)生突變，就會(huì)爆發(fā)大規(guī)模病害。而飼料中添加益生菌能直接提高動(dòng)物腸壁對病原菌的屏障能力、提高免疫力，并明顯提高飼料利用率。因此，飼料中添加益生菌補(bǔ)充動(dòng)物體內(nèi)有益菌數(shù)量提高動(dòng)物抗病力和增重率、降低殘餌和糞便對水體污染十分必要。然而，實(shí)際應(yīng)用中由于海參、鮑魚等水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物攝食方式的特殊性(舔食和刮食)， 造成飼料中添加益生菌大部分在水體中散失而造成浪費(fèi)。因此，如何利用簡便的工藝對益生菌固定化并保持益生菌活性，是解決益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖實(shí)際應(yīng)用的最佳途徑。目前，已有用于水產(chǎn)飼料的益生菌固定方法，但工藝復(fù)雜且對設(shè)備要求較高。

發(fā)明內(nèi)容
結(jié)合上述麥飯石的特征，本發(fā)明旨在提供一種以其為固定載體的活性益生菌飼料添加劑的生產(chǎn)方法。為此目的，本發(fā)明首先提供如下固定化活性益生菌的生產(chǎn)方法，該方法包括將固定載體與益生菌接觸的步驟，所述的固定化載體是麥飯石。作為載體的麥飯石粉末，其粒徑大小決定比表面積的大小，會(huì)影響對活性菌吸附的效果。本發(fā)明的技術(shù)方案中，優(yōu)選使用粒度100 200目的麥飯石。
麥飯石與活性益生菌結(jié)合并不具有菌種的選擇性，可以認(rèn)為所有適宜濃度的在現(xiàn)有技術(shù)體系下的益生菌均可作為備選使用的菌種，本發(fā)明優(yōu)選使用枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)。本發(fā)明提供的固定載體與益生菌接觸的優(yōu)選方式之一是將麥飯石粉末加入到益生菌發(fā)酵培養(yǎng)液中，均勻混合后靜置足夠長的時(shí)間至出現(xiàn)明顯分層。其中麥飯石粉末和益生菌發(fā)酵培養(yǎng)液的用量比優(yōu)選1 3g 10ml?？莶菅挎邨U菌發(fā)酵培養(yǎng)液的菌體濃度優(yōu)選 IO8 IO9 個(gè)/ml。針對本發(fā)明的優(yōu)選菌種，枯草芽孢桿菌，其發(fā)酵液的制備方法是將枯草芽孢桿菌菌粉以0. 5g/100ml的接種量接入到培養(yǎng)基中，36°C培養(yǎng)14 16h ；其中所用的培養(yǎng)基的制備方法是將20g蔗糖、15g大豆蛋白胨和0. 5g牛肉膏溶于IL海水中，調(diào)pH7. 5，無需高壓滅菌。上述方法中，所述的枯草芽孢桿菌菌粉購自滄州華雨藥業(yè)有限公司，活菌數(shù)>200 億個(gè)/克，水份<8%。所述的海水鹽度為33%。左右的天然海水，經(jīng)過普通定性濾紙過濾即可使用。上述本發(fā)明的方法中，麥飯石粉末與益生菌發(fā)酵培養(yǎng)液混合的方式有多種，目的是保證麥飯石粉末和活性益生菌的充分接觸，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)已有的條件靈活選擇混合方式。本發(fā)明人優(yōu)選使用搖床振蕩混合，搖床振蕩頻率150 200rpm，時(shí)間是 1 5小時(shí)，優(yōu)選1 汕。上述本發(fā)明的固定化活性益生菌的生產(chǎn)方法中還包括產(chǎn)品的后處理步驟，即麥飯石粉末與益生菌發(fā)酵培養(yǎng)液接觸后收集沉淀、烘干粉碎并過200目篩網(wǎng)的步驟。所述的烘干溫度優(yōu)選60 80°C。本發(fā)明另一方面的目的則是提供使用麥飯石為載體、通過讓麥飯石與益生菌接觸的步驟來制備得到的固定化活性益生菌。本說明書所述及的任何一種方法所生產(chǎn)的麥飯石為載體的固定化活性益生菌均屬于本發(fā)明保護(hù)的范疇。進(jìn)一步通過試驗(yàn)證明，作為飼料添加劑，麥飯石可提供微量元素、礦物質(zhì)，枯草芽孢桿菌分泌胞外消化酶，在提高生物增重率和抗病力方面具有協(xié)同增效作用。進(jìn)入養(yǎng)殖水體中，麥飯石吸附水體氨氮和亞硝酸鹽，并為枯草芽孢桿菌提供氧氣，枯草芽孢桿菌在有氧環(huán)境中可有效分解水體中氨氮和亞硝酸鹽，二者在氨氮、亞硝酸鹽清除作用中具有協(xié)同增效作用。應(yīng)用本發(fā)明的方法生產(chǎn)固定化活性益生菌，方法簡便易行、設(shè)備要求較低、成本低、易于大規(guī)模生產(chǎn)。所得的產(chǎn)品具有如下突出優(yōu)點(diǎn)1)有效防止益生菌在水體中的散失造成益生菌無效或低效；幻增強(qiáng)水產(chǎn)動(dòng)物免疫力和抗病力；；3)有效降低水體氨氮和亞硝酸鹽濃度；4)產(chǎn)生多種酶類，提高水產(chǎn)動(dòng)物飼料利用率，提高動(dòng)物增重率力)協(xié)同發(fā)揮益生菌和麥飯石有益功能，補(bǔ)充飼料微量元素。此外，產(chǎn)品常溫下可長期保存，益生菌不失活，細(xì)菌數(shù)不降低。產(chǎn)品添加到飼料中可以任意制粒、壓片而不影響益生菌活性。


本發(fā)明附圖4幅圖1是基礎(chǔ)飼料中添加不同成分的刺參飼喂實(shí)驗(yàn)，60天后考查刺參增重率，圖示數(shù)據(jù)顯示各實(shí)驗(yàn)組相對于對照組的增重率。圖2是不同時(shí)間測試枯草芽孢桿菌、麥飯石和載菌麥飯石對養(yǎng)殖廢水中氨氮清除效果，所用測試品用量為150ppm。圖3是不同時(shí)間測試枯草芽孢桿菌、麥飯石和載體麥飯石對養(yǎng)殖廢水中亞硝酸鹽的清除效果，所用測試品用量為150ppm。圖4是存放60d后，平板檢測載菌麥飯石粉末中益生菌菌數(shù)和存活情況照片。
具體實(shí)施例方式下面的非限制性實(shí)施例用于進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不以任何形式限制本發(fā)明。無特殊說明，本說明書中的枯草芽孢桿菌菌粉購自滄州華雨藥業(yè)有限公司；麥飯石粉購自阜新麥飯石供銷公司；海水為過濾后天然海水，鹽度約為33%。；大豆蛋白胨購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司(批號(hào)20060306)、牛肉膏購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司 (批號(hào)20060112)；立式恒溫?fù)u床(SPH-2102C)，購自上海民儀電子有限公司；恒溫干燥箱 (DHG-9240A)，購自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。制備實(shí)施例1一種固定化活性益生菌的生產(chǎn)方法，具體包括以下步驟1、枯草芽孢桿菌菌粉以0. 5g/100ml接種量接入到培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基配制方法如下20g蔗糖、15g大豆蛋白胨、0.5g牛肉膏溶于IL海水中，pH7.5。無需高壓滅菌，于36°C 培養(yǎng)14h后，得到發(fā)酵培養(yǎng)益生菌，菌濃度1. OX IO8 1. OX IO9個(gè)/ml，此培養(yǎng)液為發(fā)酵培養(yǎng)液。2、將粒度為100 200目麥飯石粉末作為吸附載體按1 10重量體積比(g/ml) 加入到益生菌發(fā)酵培養(yǎng)液中，搖床高速振蕩混合，振蕩頻率為170rpm，振蕩時(shí)間為池。3、室溫靜置30min至出現(xiàn)明顯分層后收集沉淀，于70°C烘干后超微粉碎，過200目篩網(wǎng)制成。制備實(shí)施例2一種固定化活性益生菌的生產(chǎn)方法，具體包括以下步驟1、枯草芽孢桿菌菌粉，以0. 5g/100ml接種量接入到培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基配制方法如下20g蔗糖、15g大豆蛋白胨、0.5g牛肉膏溶于IL海水中，pH7.5。無需高壓滅菌，于36°C 培養(yǎng)14h后，得到發(fā)酵培養(yǎng)益生菌，菌濃度1. OX IO8 1. OX IO9個(gè)/ml，此培養(yǎng)液為發(fā)酵培養(yǎng)液。2、將粒度為100 200目麥飯石粉末作為吸附載體按2 10重量體積比(g/ml) 加入到益生菌發(fā)酵培養(yǎng)液中，搖床高速振蕩混合，振蕩頻率為170rpm，振蕩時(shí)間為池。3、室溫靜置30min至出現(xiàn)明顯分層后收集沉淀，于70°C烘干后超微粉碎，過200目篩網(wǎng)制成。制備實(shí)施例3一種固定化活性益生菌的生產(chǎn)方法，具體包括以下步驟1、枯草芽孢桿菌菌粉以0. 5g/100ml接種量接入到培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基配制方法如下20g蔗糖、15g大豆蛋白胨、0.5g牛肉膏溶于IL海水中，pH7.5。無需高壓滅菌，于36°C 培養(yǎng)14h后，得到發(fā)酵培養(yǎng)益生菌，菌濃度1. OX IO8 1. OX IO9個(gè)/ml，此培養(yǎng)液為發(fā)酵培養(yǎng)液。2、將粒度為100 200目麥飯石粉末作為吸附載體按3 10重量體積比(g/ml) 加入到益生菌發(fā)酵培養(yǎng)液中，搖床高速振蕩混合，振蕩頻率為170rpm，振蕩時(shí)間為池。3、室溫靜置30min至出現(xiàn)明顯分層后收集沉淀，于70°C烘干后超微粉碎，過200目篩網(wǎng)制成。麥飯石對益生菌吸附率實(shí)驗(yàn)、載菌麥飯石飼喂和凈化水質(zhì)實(shí)驗(yàn)以及飼料中益生菌存活情況如下實(shí)施例4麥飯石對益生菌吸附率試驗(yàn)將粒度為100 200目麥飯石粉末作為吸附載體按2 10重量體積比(g/ml)加入到益生菌發(fā)酵培養(yǎng)液中，搖床高速振蕩混合，振蕩頻率為170rpm，振蕩時(shí)間為分別設(shè)置為 0,30,60和120min共4組，除對照組外，每組設(shè)2個(gè)重復(fù)。振蕩停止后于室溫靜置30min至出現(xiàn)明顯分層后，取上清液0. Iml至枯草芽孢桿菌平板OOg蔗糖、15g大豆蛋白胨、15g瓊脂、0. 5g牛肉膏溶于IL過濾海水中，pH7. 5，高壓滅菌后倒板，冷卻凝固后使用)。用涂布器將菌液均勻涂布在平板表面，36°C培養(yǎng)1 后計(jì)數(shù)菌落。按照下述方法計(jì)算吸附率(對照組上清液菌落數(shù)-實(shí)驗(yàn)組上清液菌落數(shù))/對照組上清液菌落數(shù)X100%所得實(shí)驗(yàn)組平均吸附率如表1所示從試驗(yàn)結(jié)果可以看出麥飯石粉末對益生菌的吸附率在0 120min內(nèi)隨振蕩時(shí)間延長而增加，在60min時(shí)，吸附率明顯增加，120min達(dá)到最大值。表 1
振蕩時(shí)間(min)上清液中菌數(shù)上清液中菌數(shù)平均吸附率020483076868864.5609611694.8120385997.6注表中麥飯石和益生菌培養(yǎng)液重量體積比為2 10實(shí)施例5海刺參飼喂試驗(yàn)本實(shí)施例所用刺參為大連瓦房店某大型刺參育苗場同批刺參幼體(小白點(diǎn))，于養(yǎng)殖場室內(nèi)育苗池(體積為25m3)內(nèi)工廠化養(yǎng)殖，每天更換1/3體積海水，每周全換水一次， 每天下午投喂飼料，水溫在13-16°C間，鹽度保持在觀-31%0。養(yǎng)殖試驗(yàn)分4組，分別是對照組、枯草芽孢桿菌組、麥飯石組和載菌麥飯石組，其中載菌麥飯石按制備實(shí)施例2制得。每個(gè)試驗(yàn)組為一個(gè)育苗池的全部幼體(約上億個(gè)體， 初始體重 0)，養(yǎng)殖試驗(yàn)共60d，試驗(yàn)結(jié)束稱量體重，計(jì)算增重率。增重率計(jì)算公式為(實(shí)驗(yàn)組體重-對照組體重)/對照組體重X 100%分別在基礎(chǔ)飼料中添加3種飼料添加劑，按照質(zhì)量百分比，添加劑量為枯草芽孢桿菌5% ；麥飯石5% ；載菌麥飯石5%。各組飼料配方見表2 (質(zhì)量份)。表權(quán)利要求
1.一種固定化活性益生菌的生產(chǎn)方法，包括將固定載體與益生菌接觸的步驟，其特征在于所述的固定載體是麥飯石。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的麥飯石粒度100 200目。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的益生菌是枯草芽孢桿菌。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于固定載體與益生菌接觸的具體方式是將麥飯石粉末按照質(zhì)量體積比1 3g IOml加入到枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)液中，均勻混合后靜置至出現(xiàn)明顯分層。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述的枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)液的菌體濃度為 IO8 IO9 個(gè)/ml。
6.權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述的枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)液的制備方法是將枯草芽孢桿菌菌粉以0. 5g/100ml的接種量接入到培養(yǎng)基中，36°C培養(yǎng)14 16h。
7.權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于麥飯石粉末加入到益生菌發(fā)酵培養(yǎng)液后，搖床振蕩混合，搖床振蕩頻率150 200rpm，時(shí)間是1 池。
8.權(quán)利要求4所述的方法，還包括靜置后收集沉淀、烘干粉碎并過200目篩網(wǎng)的步驟。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述的烘干溫度是60 80°C。
10.按照權(quán)利要求1 9中任一項(xiàng)的方法生產(chǎn)出來的固定化活性益生菌。
全文摘要
一種固定化活性益生菌的生產(chǎn)方法，包括將固定化載體與益生菌接觸的步驟，其中所述的固定化載體是麥飯石。應(yīng)用本發(fā)明的方法生產(chǎn)固定化活性益生菌，方法簡便易行、設(shè)備要求較低、成本低、易于大規(guī)模生產(chǎn)。所得的產(chǎn)品具有如下突出優(yōu)點(diǎn)1)有效防止益生菌在水體中的散失造成益生菌無效或低效；2)增強(qiáng)水產(chǎn)動(dòng)物免疫力和抗病力；3)有效降低水體氨氮和亞硝酸鹽濃度；4)產(chǎn)生多種酶類，提高水產(chǎn)動(dòng)物飼料利用率，提高動(dòng)物增重率；5)協(xié)同發(fā)揮益生菌和麥飯石有益功能，補(bǔ)充飼料微量元素。此外，產(chǎn)品常溫下可長期保存，益生菌不失活，細(xì)菌數(shù)不降低。產(chǎn)品添加到飼料中可以任意制粒、壓片而不影響益生菌活性。
文檔編號(hào)C12N11/14GK102181423SQ20111006712
公開日2011年9月14日 申請日期2011年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月18日
發(fā)明者孫永欣, 李樹英, 溫志新 申請人:遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大連生物技術(shù)研究所