專利名稱：一種抗氯霉素單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種抗氯霉素單克隆抗體，特別是一種以氯霉素-牛血清白蛋白為免 疫原制備得到的抗氯霉素單克隆抗體。
背景技術(shù)：
氯霉素是一種廣譜性抗生素，對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均有很好的抑制作 用。由于其優(yōu)良的抗菌性、穩(wěn)定的藥性和低廉的價格，因此作為細(xì)菌性疾病的治療藥物應(yīng)用 于人和動物臨床，并作為飼料添加劑廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)和人工水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)。但是，氯霉 素具有毒性，易引起人體血中毒，長期應(yīng)用可導(dǎo)致再生障礙性貧血和粒細(xì)胞缺乏癥。嬰兒 長期食用氯霉素污染的乳汁，可能會引起“灰嬰綜合征”。此外長期微量攝入氯霉素，不僅 使大腸桿菌、沙門氏菌等產(chǎn)生耐藥性，而且會引起機體正常菌群失調(diào)，使人們易感染各種疾 病。如果氯霉素在食用動物中殘留，可通過食物鏈傳給人類，對人類的健康造成危害，因此， 抗氯霉素單克隆抗體的制備對動物性食品檢測以及人類健康具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種抗氯霉素單克隆抗體，所述單克隆抗體對氯霉素有特異 性，所述抗單克隆抗體由保藏編號為CCTCC NO :C2010110的細(xì)胞株分泌產(chǎn)生。本發(fā)明還提供一種產(chǎn)生抗氯霉素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，保藏于中國典型培 養(yǎng)物保藏中心，地址中國武漢，武漢大學(xué)，保藏編號CCTCC NO :C2010110，保藏日期2010年 12月30日，培養(yǎng)物名稱雜交瘤細(xì)胞株3G12。本發(fā)明所述的抗氯霉素單克隆抗體的制備方法為用氯霉素人工免疫原免疫小 鼠，取小鼠脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，由間接ELISA和間接競爭ELISA兩種方法結(jié)合篩選 出對氯霉素有特異性的雜交瘤細(xì)胞，從雜交瘤細(xì)胞的上清液中或從注射雜交瘤細(xì)胞的動物 腹水中，分離獲得所述抗氯霉素單克隆抗體；所述氯霉素人工免疫抗原為氯霉素-牛血清 白蛋白偶聯(lián)物(CAP-BSA)，是按以下方法自制得到(1)氯霉素溶于乙醇，鹽酸調(diào)pH值為1 2，加入鋅粉，50°C 70°C溫度下反應(yīng) 0.5 2小時，離心取上清液；所述鋅粉的質(zhì)量與氯霉素的質(zhì)量之比為0.1 1 1，所述乙 醇的用量以氯霉素的質(zhì)量計為5 50mL/g ；(2)取步驟(1)得到的上清液在0 5°C溫度下，鹽酸調(diào)pH值為1 2，攪拌下滴 加0. 1 lmol/L的NaNO2溶液，使淀粉碘化鉀試紙變灰藍(lán)，再滴加0. 1 lmol/L尿素溶液， 使淀粉碘化鉀試紙變淺藍(lán)；再加0. 1 lmol/L NaOH溶液調(diào)pH值為7 9，得清液作為溶 液A備用；(3)牛血清蛋白溶于pH值7. 4，濃度為0. OlM磷酸緩沖液中，作為溶液B;步驟(1) 所述氯霉素與牛血清蛋白的物質(zhì)的量之比為100 20 1 ；所述磷酸緩沖液的用量以牛血 清蛋白的質(zhì)量計為5 50mL/g ；(4)在0 5 °C溫度，攪拌下將溶液A全部滴入溶液B中，同時滴加NaOH溶液保持PH值為7 9，滴完后在0 5°C下反應(yīng)6 M小時，然后反應(yīng)液裝入截留分子量為20000 的透析袋，放入0 5°C，pH7. 4，濃度0. OlM的磷酸緩沖液進行透析，冷凍干燥得到所述氯
霉素人工免疫原。所述間接ELISA和間接競爭ELISA篩選雜交瘤細(xì)胞按以下方法進行用包被液將 CAP-OVA抗原(氯霉素-雞卵清蛋白偶聯(lián)物)稀釋，按Iyg/孔包被酶標(biāo)板，設(shè)置空白對照 孔，37°C包被；PBS-T溶液浸洗三次，每孔加入200 μ L待測樣，37°C孵育1小時；PBS-T溶 液浸洗三次，每孔加入100 μ L用BSA溶液按1 3000稀釋的羊抗小鼠IgG-HRP，37°C孵育 1小時；PBS-T溶液浸洗三次，雙蒸水浸洗三次，每孔加入100 μ L鄰苯二胺底物溶液，置于暗 處反應(yīng)5分鐘，陽性孔變?yōu)樽攸S色，每孔加入100 μ L 2Μ 終止反應(yīng)。篩選出的陽性孔 再用CAP-OVA包被的酶標(biāo)板進行競爭抑制性ELISA法，先將細(xì)胞培養(yǎng)上清與2 X 1(Γ3Μ的CAP 溶液等量混合，37°C感作1小時，再加入已包被的酶標(biāo)板中。同時用0. 01M,Ph7. 4的PBS替 代CAP溶液作對照，其余步驟同上。若經(jīng)抑制后的OD值降至對照孔50%以下，則判為陽性 孔。本發(fā)明提供的抗氯霉素單克隆抗體可應(yīng)用于檢測氯霉素殘留量。本發(fā)明還提供一種檢測氯霉素殘留量的試劑盒，所述試劑盒含有本發(fā)明提供的抗 氯霉素單克隆抗體。本發(fā)明提供的抗氯霉素單克隆抗體的質(zhì)量具有很強的可控性和可重復(fù)性。并通過 對所得抗體特性的初步分析及鑒定，為特異、靈敏的CAP免疫測定方法的進一步建立和應(yīng) 用提供了實驗依據(jù)。
四

圖1腹水抗體層析柱純化結(jié)果圖，圖中1為穿透峰，2為抗體洗脫峰。圖2腹水抗體純化中的電泳檢測圖，圖中1為標(biāo)準(zhǔn)蛋白marker，2為腹水，3為穿透 峰，4為洗脫峰。附圖3氯霉素檢測濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。
五具體實施例方式實施例11 材料1.1動物、細(xì)胞株BALB/c小鼠，浙江省動物實驗中心；Fl小鼠，浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心； SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。1.2主要儀器層流超凈臺SCV-4A1，Streamline Laboratory Products ；三目倒置相差顯微 鏡 ELWDO. 3T1-SNCP，Nikon ；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱 3111，Thermo Electron Corporation ； HiTrap r-Protein A FF 層析柱(&nL)、AKTA purifier, GE Healthcare ；無菌培養(yǎng)板、培養(yǎng) 瓶、培養(yǎng)皿、離心管，Corning公司。1. 3主要試劑氯霉素，上海晶純試劑有限公司；HAT培養(yǎng)液、HT培養(yǎng)液、PEG Q000D)，Sigma公司；胎牛血清，民海生物工程有限公司；RPML 1640培養(yǎng)液，吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；羊抗 小鼠IgG-HRP，博士德生物工程有限公司。免疫抗原CAP-BSA和檢測抗原氯霉素-雞卵清蛋白偶聯(lián)物(CAP-OVA)，按以下方法 合成得到；①合成免疫抗原CAP-BSA 稱取氯霉素32;3mg (Immol)，溶于15ml無水乙醇，用 lmol/L鹽酸調(diào)pH值至1，加入鋅粉300mg，65°C水浴加熱50分鐘，離心取上清液，冰浴，在 0 5°C下，lmol/L鹽酸調(diào)pH值至1，磁力攪拌，逐滴加入lmol/L NaNO2溶液，使淀粉碘化鉀 試紙變灰藍(lán)(使NaNO2稍過量，以0. 5-2s內(nèi)變化為準(zhǔn)，保持5_10分鐘)。再滴加0. 2mol/L 尿素水溶液，直至試紙從很深的藍(lán)色(灰藍(lán))變成淺藍(lán)色。再加入0.2mol/L NaOH溶液調(diào) PH值為8，作為溶液A備用。稱取670mg牛血清蛋白(BSA，0. Olmmol)溶于10ml pH值7. 4，濃度為0. OlM的磷
酸緩沖液中，作為溶液B。0 5°C溫度下，將溶液A邊攪拌邊滴加入溶液B中，同時滴加0. lmol/L的NaOH 溶液，保持PH值為8，滴完后攪拌反應(yīng)，0 5°C反應(yīng)12小時，然后將反應(yīng)液裝入截留分子量 為20000的透析袋，放入0 5°C，pH7. 4，0. OlM的磷酸緩沖液中進行透析，換液3次，總透 析時間為7天，冷凍干燥保存得到氯霉素人工免疫原。②合成檢測抗原(CAP-OVA)稱取氯霉素32;3mg (Immol)，溶于15ml無水乙醇，用 lmol/L鹽酸調(diào)pH值至1. 5，加入鋅粉200mg，50°C水浴加熱120分鐘，離心取上清液，冰浴， 鹽酸調(diào)PH值至1，磁力攪拌，逐滴加入lmol/L NaNO2溶液，使淀粉碘化鉀試紙變灰藍(lán)(使 NaNO2稍過量，以0. 5-2s內(nèi)變化為準(zhǔn)，保持5_10分鐘)。再滴加0. lmol/L尿素水溶液，直 至試紙從很深的藍(lán)色(灰藍(lán))變成淺藍(lán)色。再加入0. 2mol/L NaOH溶液調(diào)pH值為7. 5，作 為溶液A備用。稱取2. 25g雞卵清蛋白(0VA,0. 05mmol)溶于10ml pH值7. 4，濃度為0. OlM的磷 酸緩沖液中，作為溶液B。0 5°C溫度下，將溶液A邊攪拌邊滴加入溶液B中，同時滴加lmol/L的NaOH溶 液，保持PH值為7. 5，滴完后攪拌反應(yīng)，0 5°C反應(yīng)8小時。然后將反應(yīng)液裝入截留分子量 為20000的透析袋，放入0 5°C，pH7. 4，0. OlM的磷酸緩沖液中進行透析，換液4次，總透 析時間為5天，冷凍干燥保存得到氯霉素人工免疫原。2 方法2. 1免疫取6周齡的BALB/c小鼠，用上述合成的CAP-BSA抗原淋巴免疫，每次免疫 量為IOOyg/只，第一次免疫與等量的弗氏完全佐劑充分乳化，第二次、第三次免疫與等 量的弗氏不完全佐劑充分乳化，每次間隔7天，融合前三天腹腔直接注射100 μ g抗原加強 免疫。2. 2細(xì)胞融合將小鼠處死，無菌摘取脾臟，研磨制取脾B淋巴細(xì)胞懸液，洗滌調(diào)整 細(xì)胞濃度為(1-5) X IO7AiL備用。將免疫脾B淋巴細(xì)胞與處于對數(shù)生長期的骨髓瘤細(xì)胞按 10 1混合后離心棄上清，緩慢加入分子質(zhì)量2000D的50% PEG ImL,間隔Imin后，緩慢滴 入無血清培養(yǎng)液，終止融合劑的作用，經(jīng)洗滌去除融合劑后加入所含有HAT的細(xì)胞培養(yǎng)液， 分種于96孔培養(yǎng)板孔內(nèi)，每孔200 μ L02. 3雜交瘤細(xì)胞的篩選在接種96孔培養(yǎng)板，經(jīng)過1周的培養(yǎng)后，骨髓瘤細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞的雜交瘤細(xì)胞即被選擇培養(yǎng)出，然后進行單克隆化?？寺』椒ㄓ糜邢尴♂尫?，一般 克隆化3-4次，直至克隆細(xì)胞生長的各個孔檢測100%抗體陽性為止。2. 4腹水抗體的制備用弗氏不完全佐劑0. 5mL/只注射小鼠腹腔，一周后腹腔注射 雜交瘤細(xì)胞5X IO6/只，待7日后每日觀察小鼠的腹部情況及精神狀況，待腹部凸起，顏色 變黑，小鼠精神差，即可抽取腹水，每隔1天抽取一次。2.5間接競爭ELISA測抗體效價及陽性孔將氯霉素-卵清蛋白(CAP-OVA)抗 原Iyg/孔包被酶標(biāo)板，設(shè)置空白對照孔，37°C包被過夜；PBS-T溶液浸洗三次，每孔加入 200 μ L待測樣，以PBS稀釋，37 °C孵育1小時；PBS-T溶液浸洗三次，每孔加入IOOyLffi 1% BSA溶液按1 3000稀釋的羊抗小鼠IgG-HRP，37°C孵育1小時；PBS-T溶液浸洗三次，雙 蒸水浸洗三次，每孔加入100 μ L鄰苯二胺底物溶液，置于暗處反應(yīng)5分鐘，陽性孔變?yōu)樽攸S 色，每孔加入100 μ L 2Μ 終止反應(yīng)。篩選出的陽性孔再用CAP-OVA包被的酶標(biāo)板進行 競爭抑制性ELISA法，先將細(xì)胞培養(yǎng)上清與2 X 10- 的CAP溶液等量混合，37°C感作1小 時，再加入已包被的酶標(biāo)板中。同時用0. 01M, Ph7. 4的PBS替代CAP溶液作對照，其余步 驟同上。若經(jīng)抑制后的OD值降至對照孔50%以下，則判為陽性孔。2. 6抗體的純化選擇5mL HiTrap r-Protein A FF預(yù)裝層析柱純化抗體。取適量 腹水，10，000r/min離心15min，取上清，經(jīng)過0. 22 μ m微孔濾膜過濾后，用20mmol/L磷酸緩 沖液上樣，用0. lmol/L甘氨酸-鹽酸緩沖液洗脫?？疾爝x擇上樣緩沖液的pH值和離子強 度、洗脫緩沖液的PH值，控制樣品流速。2. 7SDS-PAGE法鑒定單抗純度分離膠濃度12%，濃縮膠濃度4%，還原狀態(tài)下處理 樣品，電泳后用考馬斯亮藍(lán)R250染色，乙醇乙酸脫色，然后經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)掃描分析其純度。3 結(jié)果3. ICAP雜交瘤細(xì)胞株的建立3. 1. 1小鼠血清抗體效價檢測CAP-BSA抗原免疫的BALB/c小鼠共四只，眼眶取血 檢測效價。四只小鼠的血清抗體效價都達(dá)到了 10_6以上，免疫效果較好，可進行細(xì)胞融合。3. 1. 2雜交瘤細(xì)胞株的建立方法2. 2細(xì)胞融合后，按照方法2. 3鋪三塊96孔板， 經(jīng)HAT培養(yǎng)液篩選后，按照方法2. 5測出9個陽性孔，取上清效價最高(10_4)的兩孔細(xì)胞株 (ID1JG12)單克隆化4次，第2，3，4次單克隆時，2株細(xì)胞的陽性率均為100%。雜交瘤細(xì)胞 株經(jīng)14周的培養(yǎng)后依舊能穩(wěn)定分泌單克隆抗體。經(jīng)液氮凍存復(fù)蘇后仍能穩(wěn)定分泌抗CAP 單克隆抗體。將3G12雜交瘤細(xì)胞株進行保藏，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國 武漢，武漢大學(xué)，保藏編號CCTCC NO :C2010110，保藏日期2010年12月30日。3. 2單克隆抗體的制備及其性質(zhì)的鑒定3. 2. 1雜交瘤細(xì)胞上清抗體效價的檢測細(xì)胞上清抗體效價達(dá)到了 10_4以上3. 2. 2腹水抗體效價的檢測2株雜交瘤細(xì)胞株(ID1, 3G12)按照方法2. 4制備腹水 抗體，注射小鼠腹腔產(chǎn)生的抗體效價均在10_7以上。3. 3腹水抗體的純化將2株雜交瘤細(xì)胞株(ID1, 3G12)分別制備的腹水抗體按照方法2. 6進行腹水抗體 純化，在上樣緩沖液？116.5、7.0、7.5條件下，目的單抗基本保留在層析介質(zhì)上。在pH7.0的 上樣條件下，洗脫的目的蛋白峰中雜蛋白含量較少，純度略高。
上樣緩沖液的離子強度大于4mol/L時會產(chǎn)生鹽析效應(yīng)，影響抗體的穩(wěn)定性。在 (0 3. 0)mol/L NaCl的離子強度下，目的單抗均能較好地與層析介質(zhì)結(jié)合，在3. Omol/L NaCl的離子強度下，洗脫的目的蛋白峰中雜蛋白含量較少，純度較高。采用pH值為3. 0的0. lmol/L甘氨酸-鹽酸緩沖液進行洗脫時，洗脫峰為單一峰， 而且峰形較好，洗脫較完全，回收率高。樣品在各個流速下進行上樣和洗脫，都可以得到較高的純度和回收率，流速對其 影響較小。因此為了提高效率，可以采用5. Oml/min的流速進行上樣和洗脫。在最優(yōu)選的上樣條件pH7. 0，20mmol/L磷酸緩沖液+3. Omol/L NaCl，和最優(yōu)選的 洗脫條件PH3. 0,0. lmol/L甘氨酸-鹽酸緩沖液下進行腹水抗體純化。純化后抗體純度為 95%，回收率82%。層析結(jié)果如附圖1所示。。電泳鑒定結(jié)果如附圖2所示。經(jīng)柱層析分別 得到單克隆抗體IDl和3G12。實施例2氯霉素單克隆抗體的應(yīng)用動物食品中CAP殘留的檢測1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制將實施例1中獲得的抗氯霉素單克隆抗體3G12包被在96孔酶 標(biāo)板中，分別加入50 μ 1濃度為50，25，10，5，0ng/ml的CAP標(biāo)準(zhǔn)溶液和50 μ 1 CAP-HRP酶 標(biāo)記物競爭底物抗體，加入鄰苯二胺底物溶液顯色，2Μ H2SO4終止反應(yīng)，測495nm下的吸光 值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如附圖3。2、樣品檢測將Iml CAP標(biāo)準(zhǔn)溶液(50，25，10,5,0ng/ml)加入5g勻漿后鯽魚肌肉
中，混勻。按氯霉素試劑盒說明書中方法提取CAP，用競爭ELISA法測CAP的量，即可在標(biāo)準(zhǔn) 曲線上查其含量。
權(quán)利要求
1.一種抗氯霉素單克隆抗體，所述單克隆抗體對氯霉素有特異性，所述抗單克隆抗體 由保藏編號為CCTCC NO :C2010110的細(xì)胞株分泌產(chǎn)生。
2.一種產(chǎn)生如權(quán)利要求1所述的抗氯霉素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，保藏于中國 典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國武漢，武漢大學(xué)，保藏編號CCTCC N0:C2010110，保藏日期 2010年12月30日。
3.如權(quán)利要求1所述的抗氯霉素單克隆抗體的制備方法，所述方法為用氯霉素人工 免疫原免疫小鼠，取小鼠脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，由間接ELISA和間接競爭ELISA兩種 方法結(jié)合篩選出對氯霉素有特異性的雜交瘤細(xì)胞，從雜交瘤細(xì)胞的上清液中或從注射雜交 瘤細(xì)胞的動物腹水中，分離獲得所述抗氯霉素單克隆抗體；其特征在于所述氯霉素人工免 疫抗原為氯霉素-牛血清白蛋白偶聯(lián)物，是按以下方法自制得到(1)氯霉素溶于乙醇，鹽 酸調(diào)PH值為1 2，加入鋅粉，50°C 70°C溫度下反應(yīng)0. 5 2小時，離心取上清液；所述 鋅粉的質(zhì)量與氯霉素的質(zhì)量之比為0.1 1 1，所述乙醇的用量以氯霉素的質(zhì)量計為5 50mL/g ；(2)取步驟⑴得到的上清液在0 5°C溫度下，鹽酸調(diào)pH值為1 2，攪拌下滴加 0. 1 lmol/L的NaNO2溶液，使淀粉碘化鉀試紙變灰藍(lán)，再滴加0. 1 lmol/L尿素溶液，使 淀粉碘化鉀試紙變淺藍(lán)；再加0. 1 lmol/L NaOH溶液調(diào)pH值為7 9，得清液作為溶液A(3)牛血清蛋白溶于pH值7.4，濃度為0.01M磷酸緩沖液中，作為溶液B;步驟(1)所 述氯霉素與牛血清蛋白的物質(zhì)的量之比為100 20 1 ；所述磷酸緩沖液的用量以牛血清 蛋白的質(zhì)量計為5 50mL/g;(4)在0 5°C溫度，攪拌下將溶液A全部滴入溶液B中，同時滴加NaOH溶液保持pH 值為7 9，滴完后在0 5°C下反應(yīng)6 M小時，然后反應(yīng)液裝入截留分子量為20000的 透析袋，放入0 5°C，pH7. 4，濃度0. OlM的磷酸緩沖液進行透析，冷凍干燥得到所述氯霉 素人工免疫原。
4.如權(quán)利要求1所述的抗氯霉素單克隆抗體應(yīng)用于檢測氯霉素殘留量。
5.一種檢測氯霉素殘留量的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒含有權(quán)利要求1所述的 抗氯霉素單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗氯霉素單克隆抗體，所述單克隆抗體對氯霉素有特異性，所述抗單克隆抗體由保藏編號為CCTCC C2010110的細(xì)胞株分泌產(chǎn)生。本發(fā)明提供的抗氯霉素單克隆抗體可應(yīng)用于檢測氯霉素殘留量。本發(fā)明還提供一種檢測氯霉素殘留量的試劑盒，所述試劑盒含有本發(fā)明提供的抗氯霉素單克隆抗體。本發(fā)明提供的抗氯霉素單克隆抗體的質(zhì)量具有很強的可控性和可重復(fù)性。并通過對所得抗體特性的初步分析及鑒定，為特異、靈敏的CAP免疫測定方法的進一步建立和應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。
文檔編號C12N5/20GK102146138SQ20101061872
公開日2011年8月10日 申請日期2011年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月6日
發(fā)明者應(yīng)國清, 易喻, 梅建鳳, 汪竹環(huán), 王鴻, 陳建澍 申請人:浙江工業(yè)大學(xué)