專利名稱：一種高親和力的抗egfr單克隆抗體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程產(chǎn)品領域，更具體地，本發(fā)明公開了一種具有高親和力的抗 EGFR單克隆抗體和其在制備抗腫瘤藥物中的用途。
背景技術：
惡性腫瘤是當今世界嚴重危害人類健康的疾病，在各種疾病所致死亡中高居第二位，其中，轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌(CRC)是世界范圍內(nèi)第三大常見腫瘤類型，每年新診斷病例估計達950，000，同時它還是歐洲和北美的第二大致死癌種。一項調(diào)查表明，2005年歐共體地區(qū)預計新發(fā)病280，000例，死亡150，000例。I期和II期病人的治療以手術為主，大部分患者適用于根治性切除術，但10%至15%的病人伴有轉(zhuǎn)移性腫瘤，術后復發(fā)或腫瘤相關致死率很 I^J。表皮生長因子受體(EGFR)家族(HER家族)由4個相關的蛋白酪氨酸激酶受體組成，分別為(l)EGFR，erb B-I, c-erb-B ； (2) erb B-2/neu，Her-2/neu ； (3) erb B_3，Her-3 ； 與(4) erb B-4, Her_4。EGFR在腫瘤細胞中轉(zhuǎn)導調(diào)節(jié)多種不同的影響惡性生長的細胞功能網(wǎng)絡，包括增殖、存活、損傷修復、粘附、遷移以及新血管生成。EGFR在多種人上皮組織來源的癌癥中有不同水平的表達。表達EGFR的上皮腫瘤通常包括膀胱、乳腺、宮頸、結(jié)腸、頭頸、 腎、肺、胰腺、以及前列腺等。EGFR在CRC表達率為25-77%，且與腫瘤的惡化以及不良預后相關。EGFR的特異性配體為EGF和EGF相關多肽，包括轉(zhuǎn)化生長因子α (TGF-α)，雙調(diào)蛋白以及肝素結(jié)合EGF樣生長因子。EGF和TGF-α刺激躍遷通過臨近細胞周期Gl期末端的限制點——R點——所必須的分子事件。一旦過了 R點，即使在沒有生長因子的情況下細胞仍可以繼續(xù)通過細胞周期的其它期。為了激活EGFR，配體EGF(單體)同時結(jié)合并連接兩個相鄰的受體鏈，使受體的胞內(nèi)激酶局域在多個酪氨酸上相互磷酸化，酪氨酸激酶活性提高從而可以激活數(shù)個信號通路如ras-MAPK通路，PI3激酶通路以及JAK/STAT通路等。EGFR受體過表達或突變后結(jié)構激活(不需要配體)以及自分泌刺激導致的過度EGFR功能與多種癌癥發(fā)生相關。人結(jié)腸、頭頸、胰腺、肺、乳腺、腎、卵巢、腦和膀胱腫瘤頻發(fā)EGFR的過表達。 EGFR的致瘤效應包括DNA合成啟動，促進細胞生長、侵襲以及轉(zhuǎn)移。特異性敲除EGFR可導致細胞周期俘獲、細胞凋亡以及癌細胞的分化。Cetuximab是Imclone公司開發(fā)的鼠/人嵌合的單克隆抗EGFR抗體。在兩個重鏈上有兩個N-連接的糖基化位點，分子量大約為152kD (包括糖部分)。Cetuximab可以與 EGFR受體胞外域高親和力結(jié)合，從而競爭性拮抗配體與EGFR的結(jié)合，封鎖受體與配體的結(jié)合繼而抑制配體介導的EGFR酪氨酸激酶的激活。作為結(jié)果，腫瘤細胞或腫瘤微環(huán)境中的基質(zhì)細胞中多種由EGFR信號通路調(diào)節(jié)的細胞過程被阻斷，包括EGFR下調(diào)，細胞內(nèi)信號的抑制，細胞周期的抑制，凋亡的誘導，DNA修復的抑制，血管生成的抑制，腫瘤細胞運動性、侵襲性以及轉(zhuǎn)移性的抑制等等。抗體依賴的細胞毒作用(ADCC)可以導致EGFR的降解。美國 FDA于2004年2月批準該抗體用于結(jié)直腸癌的治療，2006年又增加頭頸部腫瘤的適應癥。雖然目前已經(jīng)有相關的抗EGFR單克隆抗體應用于臨床，為了增強抗體的特異性，提高檢測靈敏度，增強抗體的功能同時降低抗體的用量，進而提高對腫瘤的殺傷效果仍然需要親和力更高的抗體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的申請人進行了大量的實驗，采用基因工程技術構建了多種具有高親和力的抗EGFR單克隆抗體突變體。這些突變抗體與Cetuximab相比具有更高的親和力活性，能夠更加有效的識別EGFR抗原。高親和力的抗EGFR單克隆抗體突變體可用于制備治療EGFR 的過表達疾病如結(jié)直腸癌及頭頸部腫瘤的藥物。與Cetuximab相比，突變抗體親和力提高， 抗體特異性增強，對腫瘤的殺傷效果也顯著提高。本發(fā)明公開了 1，一種高親和力的抗EGFR單克隆抗體，其特征在于所述抗體與EGFR的親和力和 Cetuximab相比提高至少2倍。2，上述1所述的抗EGFR單克隆抗體，其特征在于所述抗體包括如SEQ ID NO :5所示的重鏈可變區(qū)和/或如SEQ ID NO :6所示的輕鏈可變區(qū)的下述任何一個或多個氨基酸位點上的氨基酸被取代的抗體，所述位點為重鏈可變區(qū)第57、102位和/或輕鏈可變區(qū)第93 位氨基酸的位置。3，上述2所述的抗EGFR單克隆抗體，其特征在于所述氨基酸被谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、絲氨酸或蘇氨酸取代。4，上述3所述的抗EGFR單克隆抗體，其特征在于所述抗體的重鏈可變區(qū)(VH)的氨基酸序列為 SEQ ID NO :7，SEQ ID NO :8，SEQ ID NO :9，SEQ ID NO :10，SEQ ID NO :11， 或 SEQ ID NO 14 之一。5，上述4所述的抗EGFR單克隆抗體，其特征在于所述抗體的輕鏈可變區(qū)(VL)的氨基酸序列為SEQ ID NO :6或SEQ ID NO :12。6，上述1、2或3所述的抗EGFR單克隆抗體，其特征在于所述抗體與EGFR的親和力和Cetuximab相比提高至少4倍。7，上述6所述的抗EGFR單克隆抗體，其特征在于所述抗體的重鏈可變區(qū)(VH)的氨基酸序列為 SEQ ID NO -J, SEQ ID NO 11 或 SEQ ID NO :14 之一.8，上述7所述的抗EGFR單克隆抗體，其特征在于所述抗體的輕鏈可變區(qū)(VL)的氨基酸序列為SEQ ID NO :6或SEQ ID NO :12。9，上述1、2或3所述的抗EGFR單克隆抗體，其特征在于所述抗體與EGFR的親和力和Cetuximab相比提高至少10倍。10，上述9所述的抗EGFR單克隆抗體，其特征在于所述抗體的重鏈可變區(qū)(VH)的氨基酸序列為SEQ ID NO 14.11，上述10所述的抗EGFR單克隆抗體，其特征在于所述抗體的輕鏈可變區(qū)(VL) 的氨基酸序列為SEQ ID NO :6或SEQ ID NO :12。12，一種制劑，含有上述1至11任一所述的抗EGFR單克隆抗體和 可藥用的載體。13，上述1至12任一所述的抗EGFR單克隆抗體或其制劑在制備抗結(jié)直腸癌及頭頸部腫瘤的藥物中的用途。更具體地，本發(fā)明的申請人通過大量實驗，首先參照美國專利US7060808公開的抗EGFR單抗資料及序列，構建了抗EGFR嵌合抗體C225的輕、重鏈可變區(qū)和恒定區(qū)基因，然后通過表達、純化，獲得嵌合抗體C225。根據(jù)圖1所示的氨基酸突變位點，采用overlapPCR 的方式對嵌合抗體C225進行構建，其構建與表達、純化的方法與未突變的嵌合抗體C225相同。所述突變抗體包括重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)的下述任何一個或多個氨基酸位點上的氨基酸取代，所述位點為重鏈可變區(qū)第57、102位，輕鏈可變區(qū)第93位氨基酸的位置，取代氨基酸為谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、絲氨酸或蘇氨酸。對 于本發(fā)明，任何合適的真核表達載體都可以使用，這些載體可以為 pcDNA3. 1 (+)，pDRl, pDHFF 之一。本發(fā)明的申請人對上述C225突變抗體進行了親和力檢測。實驗結(jié)果表明，申請人構建的C225抗體的親和力與市售的Cetuxiamb的親和力相似。相對于未突變的原本 C225抗體或市售的Cetuxiamb，提高親和力程度較高的單點突變抗體為重鏈可變區(qū)第57 位谷氨酸或第102位賴氨酸取代的突變抗體(H57TE或H102YK)，親和力提高了至少4倍左右；重鏈可變區(qū)第102位精氨酸或絲氨酸或蘇氨酸取代的突變抗體(H102YR或H102YS或 H102YT)，親和力提高了 2倍左右；輕鏈可變區(qū)第93位精氨酸取代的突變抗體(L93NR)，其親和力也提高了。針對上述重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)的突變點進行兩點或三點的組合突變，親和力均提高了 10倍以上，最終提高親和力程度最高的組合突變抗體為重鏈可變區(qū)第57位谷氨酸、第102位賴氨酸，以及輕鏈可變區(qū)第93位精氨酸三個突變點同時取代的突變抗體(H57TE，H102YK, L93NR)。以上實驗結(jié)果說明，高親和力的C225突變抗體，其最佳突變位點為重鏈可變區(qū)第 57、102位，輕鏈可變區(qū)第93位氨基酸的位置；取代的氨基酸為谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、絲氨酸或蘇氨酸，其中，最佳取代的氨基酸為谷氨酸、賴氨酸或精氨酸。并且，多個單點組合突變抗體的親和力要高于單點突變抗體。申請人:還針對Cetuximab突變體(C225突變抗體)的功能進行研究。通過對 Cetuximab突變體的ADCC功能檢測，隨著Cetuximab突變體親和力的提高，ADCC功能也顯著增強，三點組合突變Cmut8的ADCC殺傷活性顯著高于Cetuximab。通過對Cetuximab突變體凋亡功能檢測，結(jié)果顯示，親和力的提高不能顯著地增加Cetuximab突變體的凋亡功能， 但是三突變體CmutS卻顯示出了較強的促凋亡能力；雖然加入不同濃度的caspasd半胱氨酸蛋白酶)抑制劑可以部分的抑制CmutS引起的凋亡，但是其仍然顯示出了較強的促凋亡能力。通過研究高親和力Cetuximab突變體(Cmut8)對Cetuximab抵制型細胞的殺傷，結(jié)果顯示，CmutS不能提高對Cetuximab抵制型細胞的補體介導的細胞毒(CDC)殺傷，但是能夠引起較強的ADCC殺傷；CmutS在Cetuximab抵制型細胞株上仍然表現(xiàn)出較強的促凋亡能力。通過高親和力Cetuximab突變體體內(nèi)小鼠生存實驗，結(jié)果顯示，Cmut8較Ceuximab在 A431細胞動物模型上，顯示出良好的治療效果(P < 0. 01)。本發(fā)明公開上述高親和力的C225突變抗體，可以和藥學上可以接受的輔料一起組成藥物制劑組合物從而更穩(wěn)定地發(fā)揮療效，制劑可為制藥領域常用的混懸、水針、凍干等制劑，優(yōu)選水針或凍干制劑，對于本發(fā)明公開的上述C225突變抗體的水針或凍干制劑，藥學上可以接受的輔料包括表面活性劑、溶液穩(wěn)定劑、等滲調(diào)節(jié)劑和緩沖液之一或其組合， 其中表面活性劑包括非離子型表面活性劑如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐溫20或80)； poloxamer (如poloxamer 188) ；Triton ；十二烷基硫酸鈉(SDS)；月桂硫酸鈉；十四烷基、亞油基或十八烷基肌氨酸；Pluronics ；M0NAQUAT 等，其加入量應使C2B8突變抗體顆粒化趨勢最小，溶液穩(wěn)定劑可以為糖類，包括還原性糖和非還原性糖，氨基酸類包括谷氨酸單鈉或組氨酸，醇類包括三元醇、高級糖醇、丙二醇、聚乙二醇之一或其組合，溶液穩(wěn)定劑的加入量應該使最后形成的制劑在本領域的技術人員認為達到穩(wěn)定的時間內(nèi)保持穩(wěn)定狀態(tài)，等滲調(diào)節(jié)劑可以為氯化鈉、甘露醇之一，緩沖液可以為TRIS、組氨酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液之一。上述制劑為包含高親和力的C225突變抗體的組合物，在對包括人在內(nèi)的動物給藥后，抗腫瘤效果明顯。具體來講，對腫瘤的預防和/或治療有效，可以作為預防和/或治療腫瘤的藥物使用。
本發(fā)明中C225突變抗體及其組合物在對包括人在內(nèi)的動物給藥時，給藥劑量因病人的年齡和體重，疾病特性和嚴重性，以及給藥途徑而異，可以參考動物實驗的結(jié)果和種種情況，總給藥量不能超過一定范圍。具體講靜脈注射的劑量是0. 1 3000mg/天。本發(fā)明公開的C225突變抗體及其組合物還可以和其他的抗腫瘤藥聯(lián)合給藥，用于腫瘤的治療，這些抗腫瘤藥包括1、細胞毒類藥物(1)作用于DNA化學結(jié)構的藥物烷化劑如氮芥類、亞硝尿類、甲基磺酸酯類；鉬類化合物如順鉬、卡鉬和草酸鉬等；絲裂霉素 (MMC) ； (2)影響核酸合成的藥物二氫葉酸還原酶抑制劑如甲氨喋呤(MTX)和Alimta等； 胸腺核苷合成酶抑制劑如氟尿嘧啶類(5FU、FT-207、卡培他濱)等；嘌呤核苷合成酶抑制劑如6-巰基嘌呤(6-MP)和6-TG等；核苷酸還原酶抑制劑如羥基脲(HU)等；DNA多聚酶抑制劑如阿糖胞苷(Ara-C)和健擇(Gemz)等；(3)作用于核酸轉(zhuǎn)錄的藥物選擇性作用于DNA模板，抑制DNA依賴RNA聚合酶，從而抑制RNA合成的藥物如放線菌素D、柔紅霉素、阿霉素、 表阿霉素、阿克拉霉素、光輝霉素等；(4)主要作用于微管蛋白合成的藥物紫杉醇、泰索帝、長春花堿、長春瑞濱、鬼白鹼類、高三尖杉酯堿；(5)其他細胞毒藥門冬酰胺酶主要抑制蛋白質(zhì)的合成；2、激素類抗雌激素三苯氧胺、屈洛昔芬、依西美坦等；芳香化酶抑制劑 氨魯米特、蘭特隆、來曲唑、瑞寧德等；抗雄激素氟它氨RH-LH激動劑/拮抗劑諾雷德、依那通等；3、生物反應調(diào)節(jié)劑主要通過機體免疫功能抑制腫瘤干擾素；白細胞介素_2 ；胸腺肽類；4、單克隆抗體Cetuximab (C225)；赫賽汀(Trastuzumab)Bevacizumab(Avastin) ；5、 其他括一些目前機制不明和有待進一步研究的藥物；細胞分化誘導劑如維甲類；細胞凋亡誘導劑。本發(fā)明公開的C2B8突變抗體及其組合物可以和上述的抗腫瘤藥物之一或其組合聯(lián)合用藥。本發(fā)明所指的腫瘤包括結(jié)直腸癌、頭頸部腫瘤及肺鱗狀細胞癌等EGFR陽性的上皮來源腫瘤，這里不再一一列舉。本發(fā)明所稱的抗腫瘤藥物，指具有預防和/或治療腫瘤的藥物，可以包括伴隨腫瘤生長相關癥狀發(fā)展的延遲和/或這些癥狀嚴重程度的降低，它進一步還包括已存在的腫瘤生長伴隨癥狀的減輕并防止其他癥狀的出現(xiàn)，還也減少或防止轉(zhuǎn)移。


圖1. Cetuxiamb (又稱C225抗體)重鏈和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列和氨基酸序列；圖中第一行序列表示Cetuxiamb的重鏈、輕鏈的堿基序列，第二行序列表示氨基酸序列，其中有下劃線的地方表示構建突變體的突變點。圖2. biacore檢測Cetuxiamb及C225抗體突變體；不同突變體按照相同濃度，等倍比稀釋在50 μ 1/min流速和25°C環(huán)境下進行檢測；圖中所示為不同C225抗體突變體在相同濃度下的sensorgram圖，其中WT表示申請人自行構建的未突變的C225抗體圖3. Cetuximab突變體結(jié)合飽和曲線；檢測125碘標記的不同cetuximab突變體對 A431細胞的結(jié)合飽和曲線；對不同的抗體突變體按照相同濃度等倍比稀釋，37°C孵育2h， 通過離心分離，檢測結(jié)合在細胞上的125碘標記的抗體片段；飽和結(jié)合實驗的數(shù)據(jù)通過非線性最小二乘法進行擬合并確定結(jié)合常數(shù)。圖4. Cetuximab突變體ADCC功能檢測；圖中4-1 4-4分別顯示的是E T為 50 1,25 1，5 1和1 1四種比率下，ADCC殺傷作用與不同濃度Cetuximab突變體的關系。圖5. Cetuimab突變體凋亡功能檢測；圖5_1顯示不同條件下的Cetuximab突變體的凋亡功能檢測結(jié)果；圖5-2 5-3顯示加入不同濃度的caspase抑制劑ZVAD (圖5_2)和 VDVAD(圖5-3)后，Cetuximab突變體的凋亡功能檢測結(jié)果。圖6.高親和力Cetuximab突變體小鼠生存率實驗；每日觀察小鼠狀況，當腫瘤體積大于2000mm3時，處死該小鼠；生存曲線做圖參照Kaplan-Meier的方法進行，組間比較采用 log-rank 檢驗進行分析[Bland JM, Altman DG. Survival probabilities (the Kaplan-Meier method). BMJ. 1998 ；317 :1572·]。
具體實施例方式以下實施例僅對本發(fā)明進行進一步的說明，不應理解為對本發(fā)明的限制。實施例不包括對傳統(tǒng)方法的詳細描述，如那些用于構建載體和質(zhì)拉的方法，將編碼蛋白的基因插入到這樣的載體和質(zhì)粒的方法或?qū)①|(zhì)粒引入宿主細胞的方法。這樣的方法對于本領域中具有普通技術的人員是眾所周知的，并且在許多出版物中都有所描述，包括Sambrook， J.，F(xiàn)ritsch，Ε. F. andManiais, Τ. (1989)Molecular Cloning :A Laboratory Manual， 2ndedition, Cold springHarbor Laboratory Press.在本發(fā)明的下述實施例中，使用的淋巴細胞分離液購自鼎國生物技術發(fā)展公司， Trizol 試劑購自 Invitrogen 公司，Lipofectamine2000 Reagent 購自 Invitrogen 公司， HRP-羊抗人 IgG(κ )購自 Southern Biotechnology Associates 公司，Human myeloma IgGl, κ購自Sigma公司，羊抗人IgG(Fe)購自(Zymed公司)，人EGFR分子購自R&D公司， LDH試劑盒購自Promega公司，ZVAD和VDVAD均購自Sigma公司，EGTA購自Sigma公司，羊抗人 κ F(ab' )2 的片段購自 Southern Biotechnology, Annexin V-Fluos 試劑盒購自 BD 公司。在本發(fā)明的下述實施例中，使用的pGEM-T載體購自promega公司，質(zhì)粒 pcDNA3. 1(+)購自美國Invitrogen公司，pcDNA3. 1載體(是否與質(zhì)粒pcDNA3. 1(+)不同？) 購自美國 Invitrogen 公司，CH0-K1 細胞為 ATCC CRL-9618，A431 細胞為 ATCC CRL-1555， SCID小鼠購自必凱公司。在本發(fā)明的下述實施例中，使用的Protein A親和柱和SA芯片均購自GE公司。實施例1.人抗體輕、重鏈恒定區(qū)基因的克隆用淋巴細胞分離液分離健康人淋巴細胞，用Trizol試劑提取總RNA，根據(jù)文獻(Clonedhuman and mouse kappa immunoglobulin constant and J region genesconserve homology infunctional segments. Hieter PA,Max EE, Seidman JG, Maizel JV Jr,Leder P. Cell. 1980 Nov ；22(lPt 1) : 197—207.)和文獻(The nucleotide sequence of a human immunoglobulin C gamma1 gene. Ellison JW,Berson BJ,Hood LE. Nucleic Acids Res. 1982 Jul 10 ；10(13) :4071_9·)報道的序列分別設計引物采用RT-PCR反應擴增抗體重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化回收并克隆到pGEM-T載體中，測序驗證后確認獲得了正確的克隆，其中，SEQ IDNO :1和SEQ ID NO :2分別顯示了重鏈恒定區(qū)(CH)的核苷酸序列和氨基酸序列，SEQ IDNO :3和SEQ ID NO :4分別顯示了輕鏈恒定區(qū)(CL)的核苷酸序列和氨基酸序列。將本例中的重鏈恒定區(qū)的正確克隆記作pGEM-T/ CH,輕鏈恒定區(qū)的正確克隆記作pGEM-T/CL。實施例2.抗EGFR嵌合抗體C225的表達載體構建 參照美國專利US7060808公開的抗EGFR單抗資料及序列，委托上海生工生物工程有限公司全基因合成抗EGFR單克隆抗體C225重鏈可變區(qū)基因(C225VH)及輕鏈可變區(qū)基因(C225VL)。圖1顯示了 C225重鏈和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列和氨基酸序列。以C225VH基因和pGEM_T/CH載體為模板通過重疊PCR合成嵌合抗體重鏈基因，反應條件為95°C 15分鐘；94°C 50秒，58°C 50秒，72°C 50秒，30個循環(huán)；72°C 10分鐘。得到 PCR產(chǎn)物C225VHCH，其5'端含有限制酶位點HindIII和信號肽基因序列，3'端含有翻譯終止密碼TAA和限制酶位點EcoR I，信號肽基因序列如SEQ ID N0:15所示。最后瓊脂糖凝膠電泳分離PCR擴增產(chǎn)物，回收目的條帶并克隆到pGEMT載體中，篩選陽性克隆測序。挑選測序正確的克隆用HindIII和EcoR I酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化回收嵌合抗體重鏈片段 C225VHCH，與用HindIII和EcoR I酶切的質(zhì)粒pcDNA3. 1⑴進行連接，構建成嵌合重鏈真核表達載體 pcDNA3. 1 (+) (C225VHCH)。以C225VL基因和pGEM_T/CL載體為模板通過重疊PCR合成嵌合抗體輕鏈基因，反應條件為95°C 15分鐘；94°C 50秒，58°C 50秒，72°C 50秒，30個循環(huán)；72°C 10分鐘。得到 PCR產(chǎn)物C225VLCL，其5'端含有限制酶位點HindIII和信號肽基因序列，3‘端含有翻譯終止密碼TAA和限制酶位點EcoR I，信號肽基因序列如SEQ ID NO 16所示。挑選測序正確的克隆用HindIII和EcoR I酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化回收嵌合抗體輕鏈片段C225VLCL， 與用HindIII和EcoR I酶切的質(zhì)粒pcDNA3. 1載體進行連接，構建成嵌合輕鏈真核表達載體 pcDNA3. 1(C225VLCL)。實施例3.嵌合抗體的穩(wěn)定表達與純化于加有含血清培養(yǎng)基的3. 5cm組織培養(yǎng)皿中接種3 X IO5CHO-Kl細胞，細胞培養(yǎng)至 90% -95%融合時進行轉(zhuǎn)染，具體轉(zhuǎn)染過程如下取質(zhì)粒IOyg (質(zhì)粒 pcDNA3. 1 ( + ) (C2 2 5VHCH) 4 μ g 禾口質(zhì)粒 pcDNA3. 1 (C225VLCL) 6 μ g)和 20 μ 1 Lipofectamine2000 Reagent 分別溶于 500 μ 1 無血清DMEM培養(yǎng)基，室溫靜置5分鐘，將以上2種液體混合，室溫孵育20分鐘以使DNA-脂質(zhì)體復合物形成，其間用3ml無血清的DMEM培養(yǎng)基替換培養(yǎng)皿中的含血清培養(yǎng)基，然后將形成的DNA-脂質(zhì)體復合物加入到培養(yǎng)皿中，置于CO2孵箱培養(yǎng)4小時后補加2ml含10%血清的 DMEM完全培養(yǎng)基，置于CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。 轉(zhuǎn)染進行24h后，用含600 μ g/ml G418選擇培養(yǎng)基篩選抗性克隆，其中，篩選方法為取細胞培養(yǎng)上清用ELISA檢測篩選高表達克隆，篩選過程如下
將羊抗人IgG(Fc)包被于ELISA板，4°C過夜，用2% BSA-PBS于37°C封閉2h，加入待測的抗性克隆培養(yǎng)上清或標準品Human myeloma IgGl, κ，37°C溫育2h，加入HRP-羊抗人IgG ( κ )進行結(jié)合反應，37°C溫育lh，加入TMB (四甲基聯(lián)苯胺)于37°C作用5分鐘，最后用H2SO4終止反應，測A45tl值。將篩選得到的高表達克隆用無血清培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，用Protein A親和柱分離純化嵌合抗體C225。將純化抗體用PBS進行透析，最后以紫外吸收法定量確定純化后抗體的濃度。實施例4. C225抗體突變體的構建及表達采用overlapPCR的方式進行C225抗體突變體的構建，其構建與表達、純化的方法與C225嵌合抗體相同，構建的抗體突變體共10個，分別命名為Cmutl CmutlO，各突變抗體的突變位點分別如表1所示，其中，突變抗體的重鏈恒定區(qū)(CH)和輕鏈恒定區(qū)(CL)的氨基酸序列分別見SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :4，重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)的氨基酸序列分別見SEQ ID NO :5 14，其中，SEQ ID NO :5為C225的重鏈可變區(qū)氨基酸序列， SEQ ID NO :6為C225輕鏈的可變區(qū)氨基酸序列，SEQ ID NO :7為C225重鏈可變區(qū)氨基酸序列的57位氨基酸殘基由T突變?yōu)镋的突變序列，SEQ ID NO :8為C225重鏈可變區(qū)氨基酸序列的102位氨基酸殘基由Y突變?yōu)镽的突變序列，SEQ ID NO 9為C225重鏈可變區(qū)氨基酸序列的102位氨基酸殘基由Y突變?yōu)镾的突變序列，SEQ ID NO 10為C225重鏈可變區(qū)氨基酸序列的102位氨基酸殘基由Y突變?yōu)門的突變序列，SEQ ID NO 11為C225重鏈可變區(qū)氨基酸序列的102位氨基酸殘基由Y突變?yōu)镵的突變序列，SEQ ID NO :12為C225輕鏈可變區(qū)氨基酸序列的93位氨基酸殘基由N突變?yōu)镽的突變序列，SEQ ID NO 13為C225輕鏈可變區(qū)氨基酸序列的93位氨基酸殘基由N突變?yōu)镵的突變序列，SEQ ID NO 14為C225 重鏈可變區(qū)氨基酸序列的57位氨基酸殘基由T突變?yōu)镋且102位氨基酸殘基由Y突變?yōu)?K的突變序列。實施例5. C225及突變體的biacore鑒定將SA芯片在50 μ 1/min的PBS溶液中25°C平衡30min，然后用IM NaCl和50mM NaOH的活化液活化3次，每次Imin ；將biotin標記的人EGFR分子稀釋成終濃度為1 μ g/ ml,以10μ 1/min的流速進行包被(ARu = 1000)；然后用PBS緩沖液50 μ 1/min平衡 IOmin0將平衡后的芯片用0.04%的生物素溶液封閉芯片。將抗體以等兩倍比稀釋五個濃度，50 μ 1/min上樣75秒，然后用PBS解離10分鐘。在相同樣品濃度下，突變抗體Cmutl、 5、6和8的biacore檢測的sensorgram結(jié)果如圖2所示；突變抗體的親和力的相對值如表 1所示。圖2和表1的結(jié)果顯示申請人構建的C225抗體的親和力與市售的Cetuxiamb的親和力相似。相對于未突變的原本C225抗體，提高親和力程度較高的單點突變抗體為=Cmutl 和Cmut5親和力分別提高了 6. 08和3. 96倍；Cmut2，3，4，親和力提高了近2倍。最終，親和力提高最高的為三點組合突變體CmutS，其親和力最終提高了 15. 47倍。相對于市售的Cetuxiamb，提高親和力程度較高的單點突變抗體為=Cmutl和 Cmut5親和力分別提高了 7. 73和5. 04倍；Cmut2，3，4，親和力提高了 2倍多。最終，親和力提高最高的為三點組合突變體CmutS，其親和力最終提高了 19. 68 倍。
表1. biacore檢測抗體突變體的親和力
權利要求
1.一種高親和力的抗EGFR單克隆抗體，其特征在于所述抗體與EGFR的親和力和 Cetuximab相比提高至少2倍。
2.權利要求1所述的抗EGFR單克隆抗體，其特征在于所述抗體包括如SEQID N0:5所示的重鏈可變區(qū)和/或如SEQ ID NO :6所示的輕鏈可變區(qū)的下述任何一個或多個氨基酸位點上的氨基酸被取代的抗體，所述氨基酸位點為重鏈可變區(qū)第57、102位，輕鏈可變區(qū)第93 位氨基酸的位置。
3.權利要求2所述的抗EGFR單克隆抗體，其特征在于所述氨基酸被取代為谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、絲氨酸或蘇氨酸。
4.權利要求3所述的抗EGFR單克隆抗體，其特征在于所述抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列為 SEQ ID NO :7，SEQ ID NO :8，SEQ ID NO :9，SEQ ID NO :10，SEQ ID NO 11 或 SEQID NO :14 之一。
5.權利要求4所述的抗EGFR單克隆抗體，其特征在于所述抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列為 SEQ ID NO 6 或 SEQ ID NO :12。
6.權利要求1至3中任一項所述的抗EGFR單克隆抗體，其特征在于所述抗體與EGFR 的親和力和Cetuximab相比提高至少4倍。
7.權利要求6所述的抗EGFR單克隆抗體，其特征在于所述抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列為 SEQ ID NO -J, SEQ ID NO :11 或 SEQ ID NO 14 之一。
8.權利要求7所述的抗EGFR單克隆抗體，其特征在于所述抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列為 SEQ ID NO 6 或 SEQ ID NO :12。
9.權利要求1至3中任一項所述的抗EGFR單克隆抗體，其特征在于所述抗體與EGFR 的親和力和Cetuximab相比提高至少10倍。
10.權利要求9所述的抗EGFR單克隆抗體，其特征在于所述抗體的重鏈可變區(qū)(VH)的氨基酸序列為SEQ ID NO :14ο
11.權利要求10所述的抗EGFR單克隆抗體，其特征在于所述抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列為 SEQ ID NO 6 或 SEQ ID NO :12。
12.—種制劑，含有權利要求1至11任一所述的抗EGFR單克隆抗體和可藥用的載體。
13.權利要求1至11任一所述的抗EGFR單克隆抗體或其制劑在制備治療EGFR的過表達疾病藥物中的用途。
14.權利要求13所述的用途，其中EGFR的過表達疾病為結(jié)直腸癌或頭頸部腫瘤。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程產(chǎn)品領域，更具體地，本發(fā)明公開了一種具有高親和力的抗EGFR單克隆抗體和其在制備抗腫瘤藥物中的用途；其中重鏈可變區(qū)(VH)的氨基酸序列為SEQ IDNO14，輕鏈可變區(qū)(VL)的氨基酸序列為SEQ ID NO6或SEQ ID NO12的抗體與EGFR的親和力和Cetuximab相比提高至少10倍。
文檔編號C07K16/28GK102219855SQ201010148069
公開日2011年10月19日 申請日期2010年4月15日 優(yōu)先權日2010年4月15日
發(fā)明者侯盛, 寇庚, 戴建新, 李博華, 王皓, 趙健, 郭亞軍 申請人:上?？贵w藥物國家工程研究中心有限公司