專利名稱：一個水稻條紋葉枯病抗性新基因(qStv10^tq)的分子標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一個水稻條紋葉枯病抗性新基因qStvl(T的分子標(biāo)記，屬于水稻抗病 育種和分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，適用于在水稻抗病育種中引入新的抗性基因qStvlO、并利用分子 標(biāo)記對該基因進行條紋葉枯病的輔助選擇育種和聚合育種。
背景技術(shù)：
水稻條紋葉枯病是由水稻條紋病毒(Rice Stripe Virus, RSV)所引起的病毒病， 以灰飛虱(Laodelplax striatellus)為主要的傳播介體。此病害的主要癥狀是植株心葉 沿葉脈出現(xiàn)褪綠短條斑，以后逐漸擴大并連片，危害嚴(yán)重時會出現(xiàn)假枯心和假白穗，從而導(dǎo) 致作物減產(chǎn)(Toriyama，1986)。隨著免耕、稻套麥、麥套稻等輕簡型栽培技術(shù)以及感病高產(chǎn) 品種的推廣應(yīng)用，加速了水稻條紋葉枯病的媒介灰飛虱帶毒群體的擴大和為害?；绎w虱刺 吸時間短、傳毒持久，使治蟲防病十分困難，利用分子標(biāo)記進行培育抗病品種無疑是行之有 效的手段。隨著抗源品種在育種計劃中的運用，在部分病區(qū)開始有了緩解的勢頭。揚州大學(xué) 的潘學(xué)彪課題組在精細(xì)定位的基礎(chǔ)上，對前人報道的條紋葉枯病抗性基因位點進行比較發(fā) 現(xiàn)，目前生產(chǎn)上所用抗源品種(如鎮(zhèn)稻88)的抗性均來自位于第11染色體上的Stvbi等位 基因。根據(jù)我們對專利數(shù)據(jù)庫的搜索，目前申請的條紋葉枯病抗病基因的標(biāo)記專利均是圍 繞這個位點進行的。這個從一個側(cè)面說明，目前抗條紋葉枯病育種存在抗病基因單一的隱 患。我們知道，病毒有著基因組小且變異快的特點，單靠一個基因想要獲得持久抗性是十分 困難的，因此我們在抗病育種中需要有足夠的預(yù)見性和前瞻性。只有挖掘新的抗性基因并 引入育種實踐，通過不同抗性基因的聚合或者輪換使用，才能實現(xiàn)對該病毒病害長期有效 的防治。對于控制復(fù)雜性狀的基因定位效果受到所用研究群體的極大影響。前人研究所用 的初級定位群體大多為F2及其衍生的重組自交家系，雖然能夠最大程度的保留遺傳變異， 但是由于遺傳背景復(fù)雜，因此使得一些重要的位點往往表現(xiàn)成為數(shù)量性狀位點，而且獲得 的連鎖標(biāo)記距離較遠(yuǎn)。在條紋葉枯病的研究中同樣存在這樣的現(xiàn)象，例如對位于第11染色 體長臂上的Stvbi,在不同研究者的結(jié)果中表現(xiàn)為大小差異較大的染色體區(qū)間。這樣的結(jié) 果只有通過利用片段導(dǎo)入系這樣的群體才能進一步的明確。中國農(nóng)科院作物科學(xué)研究所的 黎志康課題組培育了來自抗病親本特青和感病親本Lemont的雙向?qū)胂担z傳背景分別 接近特青和Lemont，攜帶有較少的導(dǎo)入片段，可以用于對復(fù)雜性狀進行較為精確的遺傳分 析。本發(fā)明將其用于條紋葉枯病的鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一個位于第10染色體上的抗性新基因 位點(QMvlOtt1)，其解釋的遺傳變異與Mvbi接近，而且獲得的遺傳標(biāo)記與該位點的距離僅 有0. 7cM，有望用于新基因的標(biāo)記輔助選擇育種。已知的Stvbi也在同一群體中被定位在 RM209-RM229的較小區(qū)間內(nèi)，而且與RM229的遺傳距離僅為0. 8cM，應(yīng)證了前人的結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
(一)技術(shù)問題本發(fā)明針對上述研究背景，利用抗病親本特青和感病親本Lemont的雙向?qū)胂担?通過連鎖分析，定位第10染色體上的條紋葉枯病抗性新基因(QMvlOttO，獲得與之緊密連 鎖的基于PCR的實用經(jīng)濟型標(biāo)記RGB10-1，該標(biāo)記可以有效的進行抗性基因型的輔助選擇， 主要應(yīng)用于條紋葉枯病的聚合育種和抗性基因輪替。( 二 )技術(shù)方案條紋葉枯病抗性新基因的分子標(biāo)記方法，其特征在于用一對特異擴增水稻位于第10染色體上抗條紋葉枯病新基因(qStvKT)標(biāo) 記的引物RGB10-1，其中正向引物序列為CTGGCCATTAGTCCTTGG ；反向引物序列為 GCTTGCGGCTCTGCTTAC，共同擴增育種材料的基因組DNA，如果RGB10-1的引物能夠擴增出與 特青大小類似(150bp左右)的片段，那么推測該品種很可能含有qStvKT抗性等位基因。(三)有益效果通過本發(fā)明鑒定到第10染色體上的條紋葉枯病抗性新基因(qMvKT)以及可對 其進行基因型鑒別的共顯性分子標(biāo)記。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點及效果1.由于qStvKT是與Mvbi不同的基因位點，因此能夠有效的防止過度使用單一 抗性基因(Mvbi)而可能出現(xiàn)的對病毒選擇壓力過大而導(dǎo)致抗性的過早喪失。2.通過新基因標(biāo)記的篩選，能夠獲得以往單一通過Mvbi標(biāo)記篩選而遺漏的有利 抗性資源。3.另一方面，9乂？1(^與Mvbi之間存在顯著的累加效應(yīng)，因此還能夠進行兩個基 因的聚合育種，獲得抗性更好的育種材料。4.本發(fā)明的分子標(biāo)記可用于條紋葉枯病抗性新基因的分子標(biāo)記聚合育種和抗性 基因輪替，由于可以進行基因型選擇，可以省去抗病性鑒定的過程，提高育種效率。


圖IM份地方品種的SSR標(biāo)記RGBio-I的PCR擴增產(chǎn)物在1 %瓊脂糖凝膠電泳的 帶型圖譜及其對應(yīng)的條紋葉枯病抗感表型(1- 為地方品種；M為DNA Ladder ；Lemont為 感病親本；特青為抗病親本；a為200bp，b為IOObp)。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施實例，進一步闡述本發(fā)明。其中所用方法如無特別說明均為常 規(guī)方法。(一 )條紋葉枯病抗性新基因的完備復(fù)合區(qū)間定位1.供試材料利用源自美國的長粒粳稻Lemont與來自中國廣東的短粒秈稻特青構(gòu)建雜交組 合，將Lemont/Teqing的Fl雜交后代分別與Lemont和特青連續(xù)回交3_4代，產(chǎn)生一系列的 隨機導(dǎo)入系。最終共獲得遺傳穩(wěn)定的Lemont背景導(dǎo)入系201份，特青背景導(dǎo)入系252份。2. DNA提取、PCR擴增及凝膠電泳
參考Temnyld1等(2000年)的DNA提取方法，對各株系的代表單株分別混合提取 基因組DNA。根據(jù)參考圖譜，選取均勻分布于全基因組的142個SSR標(biāo)記，合成引物。以各 個株系的基因組DNA為模板進行，聚合酶鏈?zhǔn)?PCR)反應(yīng)。PCR反應(yīng)的產(chǎn)物通過聚丙烯酰胺 凝膠電泳進行分離，溴化乙啶染色后，在凝膠成像系統(tǒng)下成像。參考雙親的擴增條帶，對后 代株系的帶型進行判別記錄。3.完備區(qū)間作圖分析根據(jù)后代株系的擴增條帶所表示的基因‘將其對應(yīng)的條紋葉枯病調(diào)查的結(jié)果作為表型 值，輸入由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所王建康課題組所發(fā)展的完備區(qū)間作圖軟件(ICIMapping V3. 0，免費軟件)，進行數(shù)據(jù)分析，獲得與條紋葉枯病抗性相關(guān)的候選區(qū)間及相關(guān)標(biāo)記。篩選效應(yīng)較大的主效基因位點。我們共獲得了三個效應(yīng)較大的主效基因，分別位 于第9、10和11染色體。同時考慮到分子輔助選擇所用標(biāo)記的實用性，我們淘汰了與標(biāo)記 連鎖距離較遠(yuǎn)的第9染色體位點(距離最近的標(biāo)記尚有9.8cM)；保留下來的兩個位點中， 位于第11染色體的位點與RM229的距離僅為0. 8cM,比較前人的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)是已知的 Stvbi基因，而冊2四正是目前用于該基因輔助育種選擇的分子標(biāo)記之一；另外一個位于第 10染色體上的位點與RGBlO-I的距離僅為0. 7cM，該染色體上目前尚未有任何已知的條紋 葉枯病抗性基因位點或者QTL被報道。( 二 )單標(biāo)記驗證和極端亞群體分析根據(jù)初步定位到的兩個主效區(qū)間側(cè)翼標(biāo)記，進行單標(biāo)記回歸分析，驗證上述標(biāo)記 位點的效應(yīng)。結(jié)果如表1所示。表1在Lemont/特青雙向回交導(dǎo)入系群體中定位到的兩個主效位點的緊密連鎖標(biāo)
記效應(yīng)。
權(quán)利要求
1.條紋葉枯病抗性新基因(qStvliT)分子標(biāo)記方法，其特征在于以Lemont/特青雙 向回交導(dǎo)入系為作圖群體，通過抗病性鑒定結(jié)果和SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)間的連鎖分析，在第10染 色體上獲得與抗條紋葉枯病新基因(qStvliT)緊密連鎖的SSR標(biāo)記RGB10-1。
2.按照權(quán)利1所獲得一種與Lemont/特青雙向回交導(dǎo)入系中第10染色體上抗條紋葉 枯病新基因(qStvliT)連鎖分子標(biāo)記的應(yīng)用，其特征在于以感病品種(Lemont)為背景的 抗病品種(特青)導(dǎo)入系以及地方品種為對象，通過RGB10-1標(biāo)記的帶型數(shù)據(jù)，預(yù)測其由 qStvl(T抗性等位基因所控制的條紋葉枯病抗性。
全文摘要
本發(fā)明涉及一個水稻條紋葉枯病抗性新基因qStv10tq的分子標(biāo)記，屬于水稻抗病育種和分子遺傳學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明實質(zhì)是根據(jù)連鎖分離規(guī)律，利用抗病親本特青和感病親本Lemont的雙向?qū)胂?，通過連鎖分析和關(guān)聯(lián)分析等方法，定位第10染色體上的條紋葉枯病抗性新基因(qStv10tq)，獲得與之緊密連鎖的基于PCR的實用經(jīng)濟型標(biāo)記RGB10-1。將本發(fā)明應(yīng)用于水稻條紋葉枯病抗性的輔助聚合育種和抗性基因輪替，能夠獲得新的抗性資源，防止過度使用Stvbi可能出現(xiàn)的抗性過早喪失問題；獲得抗性更好的qStv10tq與Stvbi的聚合育種材料；通過基因型選擇可以省去抗病性鑒定的步驟，提高育種效率，加快育種進程。
文檔編號C12Q1/68GK102146380SQ20101062277
公開日2011年8月10日 申請日期2010年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月29日
發(fā)明者仲維功, 孫勇, 徐建龍, 朱苓華, 楊杰, 王韻, 鄭天清, 黎志康 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所