專利名稱：葉片特異性表達(dá)人工microRNA提高水稻對(duì)白葉枯病抗性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一條21nt水稻抗病相關(guān)DNA分 子的設(shè)計(jì)、驗(yàn)證及應(yīng)用。本發(fā)明人工設(shè)計(jì)了一條21nt的人工microRNA序列，并利用天然 microRNA osa_MIR528前體作為骨架，構(gòu)建了人工microRNA前體。在轉(zhuǎn)基因水稻中，葉片特 異性地表達(dá)這條人工microRNA的前體，可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)白葉枯病的抗性，同時(shí)不影 響轉(zhuǎn)基因水稻的育性等重要農(nóng)藝性狀。
背景技術(shù)：
抗病、蟲育種是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上主要育種目標(biāo)之一。在抗病、蟲育種中，抗性基因資源 是最重要的。因此，育種家和生物學(xué)家們?cè)诖罅康脑耘嗥贩N或野生品種中進(jìn)行大規(guī)模的鑒 定以獲得抗性基因資源。水稻白葉枯病由白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. Oryzae, Xoo)引起，是世界上對(duì)水稻危害最大的細(xì)菌性病害。幸運(yùn)的是，由于生產(chǎn)上抗白葉枯病品種 的應(yīng)用使得這種水稻細(xì)菌性病害在生產(chǎn)生被有效控制。目前在水稻中已鑒定出30多個(gè)抗白葉枯病菌主效基因，其中有5個(gè)是隱性的。 xal3基因是近年來從水稻秈稻品種IRBB13克隆的一種特殊的水稻隱性抗白葉枯病基因 (Chu et al.2006)。xal3與其顯性等位基因Xal3在基因的編碼區(qū)沒有差異，但是xal3啟 動(dòng)子部分的序列變異導(dǎo)致了其在水稻葉片中的表達(dá)顯著下降，從而使得水稻植株獲得了對(duì) 白葉枯病菌菌株P(guān)X099特異性的抗性。組成型抑制xal3等位顯性基因Xal3的表達(dá)可以提 高水稻對(duì)菌株P(guān)X099抗性，但是同時(shí)會(huì)導(dǎo)致花粉育性顯著下降，表明該基因不僅控制水稻 的抗病性還與水稻的育性有關(guān)(Bart et al. 2006 ；Chu et al.2006)。在育種上特別是雜交育種，由于隱性抗性基因的使用并不方便(需要同時(shí)改良雜 交品種的兩個(gè)親本)，因此育種家更重視顯性抗白葉枯基因如Xa21或Xa23等的應(yīng)用。由于 致病菌的進(jìn)化，一種抗病基因在生產(chǎn)上使用幾年或者十幾年后會(huì)逐步喪失其抗性。隱性抗 病基因xal3的功能與抗病和育性有關(guān)，和以往發(fā)現(xiàn)的抗病基因有較大差異，其抗病機(jī)理與 其他抗病基因應(yīng)有較大的差異，是對(duì)抗病基因資源的重要補(bǔ)充。因此人類在生產(chǎn)上與病原 菌進(jìn)行長(zhǎng)期斗爭(zhēng)的過程中，充分利用這些隱性抗性基因具有重要意義。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種RNA介導(dǎo)的基因沉默現(xiàn) 象。利用RNAi技術(shù)特異性地沉默植物內(nèi)源相關(guān)代謝途徑上的關(guān)鍵基因來改良作物品質(zhì)，已 經(jīng)取得了很多成功的例子。比如，提高小麥籽粒中直鏈淀粉含量(Regina et al.2006)；提 高玉米賴氨酸和色氨酸含量(Huang et al.2006)；提高棉籽油中硬脂油和油酸含量(Liu et al. 2002)，降低棉籽中棉酚的含量(Ganesan et al.)；提高油菜油酸含量，降低芥酸含 量(Peng et al. 2010)；提高番茄中類胡蘿卜素和類黃酮含量(Davulurj et al.2005)，延 長(zhǎng)番茄成熟期(Xiong et al. 2005)；降低木薯塊莖氰苷含量(Jorgensen et al. 2005)等 等。由于RNAi導(dǎo)致基因沉默的分子機(jī)理是通過RNA介導(dǎo)的反式作用方式來實(shí)現(xiàn)的，因而利 用RNAi機(jī)理改良的作物性狀均為顯性遺傳。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，利用水稻和擬南芥來源的葉片特異性啟 動(dòng)子，精確地抑制Xal3基因在葉片中的表達(dá)而不影響其在花藥中發(fā)揮功能，既能提高轉(zhuǎn)基 因水稻對(duì)白葉枯病的抗性，又不影響其的育性。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的參考Chu等人(2006)發(fā)表的文獻(xiàn)獲得Xal3基因的基因序列號(hào)編號(hào)并在網(wǎng)上查到 其序歹lU 禾丨J用 amiRNA 設(shè)計(jì)軟件(http://wmd3.weigelworld.org/cgi_bin/webapp.cgi ？ page = Designer ；project = stdwmd)設(shè)計(jì)21nt的amiRNA序列。通過人工分析,挑選其 中2條amiRNA序列命名為amiA和amiB，并設(shè)計(jì)引物，利用PCR的方法構(gòu)建amiRNA的植物 表達(dá)載體。由于Xal3的基因功能與水稻花粉發(fā)育相關(guān)，本發(fā)明使用葉片特異性表達(dá)啟動(dòng)子 水稻的rbcS啟動(dòng)子(Osrbcsp)以及擬南芥rbcSIA啟動(dòng)子(Atrbcsp)驅(qū)動(dòng)amiRNA前體的 表達(dá)。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化將amiRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到水稻優(yōu)良恢復(fù)系明恢63中。 人工接種檢測(cè)表明，轉(zhuǎn)含amiB表達(dá)載體的水稻植株高抗白葉枯病菌菌株P(guān)0X99，而轉(zhuǎn)amiA 表達(dá)載體的水稻植株抗性增強(qiáng)不明顯。對(duì)這些轉(zhuǎn)基因植株的育性進(jìn)行考察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因水 稻植株花粉發(fā)育正常，育性與野生型明恢63無顯著差異。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于(1)利用基因沉默技術(shù)將隱性抗病性狀轉(zhuǎn)化為顯性抗病性狀；(2)利用組織特異性啟動(dòng)子，將目標(biāo)基因的沉默限定在特定組織內(nèi)，減少基因沉默 導(dǎo)致的其他不良后果如育性下降。


序列表SEQ ID NO :1是人工microRNA :amiA的前體DNA序列，長(zhǎng)度為257nt。序列表SEQ ID NO 2是人工microRNA amiA的DNA序列，長(zhǎng)度為21nt。序列表SEQ ID NO 3是人工microRNA :amiB的前體DNA序列，長(zhǎng)度為257nt。序列表SEQ ID NO 4是人工microRNA amiB的DNA序列，長(zhǎng)度為21nt。序列表SEQ ID NO :5是水稻來源的葉片特異性啟動(dòng)子Osrbcsp的序列，長(zhǎng)度為 1631bp。序列表SEQ ID NO :6是擬南芥來源的葉片特異性啟動(dòng)子Atrbcsp的序列，長(zhǎng)度為 1703bp。序列表SEQ ID NO :7_37是本發(fā)明的相關(guān)引物序列。圖1 本發(fā)明所涉及的基礎(chǔ)質(zhì)粒載體pC1300示意圖。圖2 本發(fā)明所涉及的中間載體PC1300-N0S示意圖。圖3 本發(fā)明所涉及的中間載體pC1300-amiA-N0S示意圖。圖4 本發(fā)明所涉及的中間載體pC1300-amiB-N0S示意圖。圖5 :4個(gè)最終表達(dá)載體的示意圖。a)載體Osrbcsp+amiA ；b)載體Atrbcsp+amiA ； c)載體 Osrbcsp+amiB ;d)載體 Atrbcsp+amiB。圖6 轉(zhuǎn)基因植株的葉片及花藥中amiRNA的RT-PCR檢測(cè)，TO被作為內(nèi)源對(duì)照。檢 測(cè)結(jié)果表明野生型明恢63的葉片及花藥中均無amiRNA表達(dá)。轉(zhuǎn)基因植株的葉片中amiA和amiB均可高效表達(dá)，而花藥中幾乎沒有表達(dá)。a)和g)野生型明恢63葉片；d)和g)野 生型明恢 63 花藥；b)0srbcsp+amiA 葉片；c) Atrbcsp+amiA 葉片；e) Osrbcsp+amiA 花藥；f) Atrbcsp+amiA 花藥；h) Osrbcsp+amiB 葉片；i) Atrbcsp+amiB 葉片；k) Osrbcsp+amiB 花藥； 1) Atrbcsp+amiB 花藥。圖7 部分抗病轉(zhuǎn)基因株系葉片中Xal3基因的相對(duì)表達(dá)量。這些轉(zhuǎn)基因家系的葉 片中Xal3的表達(dá)量下降了 57% -95%，證明了 amiRNA的表達(dá)的確導(dǎo)致了 Xal3表達(dá)量的下 降。圖8 轉(zhuǎn)基因水稻接種PX099菌株14天后的表現(xiàn)。a)野生型明恢63 ；b) Osrbcsp+amiB ；c)Atrbcsp+amiB ；d)Osrbcsp+amiA ；e)Atrbcsp+amiA圖9:轉(zhuǎn)基因水稻的花粉的碘化鉀染色觀察。轉(zhuǎn)基因水稻的花粉碘化鉀染色 率和野生型的無明顯差異。a)野生型明恢63 ；b)Osrbcsp+amiA ；c)Atrbcsp+amiA ；d) Osrbcsp+amiB ；e)Atrbcsp+amiB
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 amiRNA序列的設(shè)計(jì)以及amiRNA前體的構(gòu)建根據(jù)Chu等人(2006)發(fā)表的文獻(xiàn)獲得Xal3基因在Genebank中的序列 號(hào) “DQ421395”，根據(jù)該序列號(hào)在 NCBI 網(wǎng)站(www. ncbi. nlm. nih. gov)的 Genebank 中 獲得DQ421395的序列。根據(jù)DQ421395的序列在TIGR Rice網(wǎng)站(http //rice, plantbiology. msu. edu/LocusNameSearch. shtml)進(jìn)行 blastn 獲得其在 TIGR Rice 中的 locus identifier :0s08g42350. 1。在 Web MicroRNA Designer 網(wǎng)頁(yè)上(http://wmd3. weigelworld.org/cgi_bin/webapp.cgi ？ page = Designer ；project = stdwmd)輸 A 0s08g42350. 1，軟件返回17條Xal3的amiRNA序列，人工篩選出其中的2條分別命名為 amiA(序列為 TAGACTACTAGTAGATCCGCT)和 amiB (序列為 TGTAGCGAGAATCTGTCGCCG)進(jìn)行下 一步的研究。參考Warthmarm等人(2008)發(fā)表的方法，以質(zhì)粒pNW55為模板(含有水稻天然 miRNA 0sa-miR528的前體序列，由德國(guó)Max Planck發(fā)育生物所Prof. Detlef ffeigel惠 贈(zèng))，利用PCR的方法分別構(gòu)建含有amiA和amiB的amiRNA前體，該amiRNA前體通過TA克 隆的方法構(gòu)建到T-easy vector上(購(gòu)自美國(guó)Promega公司)。PCR MM 白勺弓L fi Web MicroRNA Designer N M (http://wmd3. weigelworld. org/cgi-bin/webapp. cgi ？ page = Oligo ；project = stdwmd)設(shè)計(jì)，弓丨物序列見表 1。amiRNA前體的構(gòu)建為兩輪PCR，下面是amiA前體的構(gòu)建過程，amiB的構(gòu)建過程完 全一樣，僅所用引物不同。第一輪PCR有3個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)，使用如下所示的引物對(duì)PCR1 :G-4368+Xal3MIRa-II PCR2 :Xal3MIRa_I+Xal3MIRa_IV ；PCR3 Xal3MIRa-III+G-4369反應(yīng)體系為10xPCRbuffer 5u l,2mM dNTPs 5 ii 1，10 ii M 的引物各 2 ii 1，pNW55 質(zhì)粒10ng，Pfu酶(購(gòu)自美國(guó)Promega公司)0. 5 yl，加滅菌雙蒸水至50 yl。反應(yīng)程序?yàn)?5°C2min ；95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s 重復(fù) 34 個(gè)循環(huán)；72°C 7min反應(yīng)完成后，1 %瓊脂糖凝膠電泳并回收PCR產(chǎn)物。
5
第二輪PCR 反應(yīng)體系:10xPCRbuffer 5u l,2mM dNTPs 5 u 1，10 ii M 的引物G-4368 和G-4369 各2iU，PCR1、PCR2、PCR3的回收產(chǎn)物各lyl，Ex-Taq酶(購(gòu)自寶生物工程大連有限公 司)0. 5 ill，加滅菌雙蒸水至50 u 1反應(yīng)程序:94°C2min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s 重復(fù) 32 個(gè)循環(huán)；72°C 7min將PCR產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并TA克隆于T-easy vector (購(gòu)自美國(guó) Promega 公司)0將構(gòu)建完成的TA克隆進(jìn)行測(cè)序分析，確認(rèn)amiA和amiB的前體被正確構(gòu)建。本發(fā) 明所涉及到的相關(guān)引物的DNA序列如表1所示。表1本發(fā)明所涉及到的引物序列表中引物名序列號(hào)引物序列引物用途X13MR a-ISEQ NO7IDagTAGACTACTAGTAGATCCGCTcagga gattcagtttga構(gòu)建ami A前體X13MR a-IISEQ NO8IDtgAGCGGATCTACTAGTAGTCTActgctg ctgctacagcc構(gòu)建amiA前體X13MR a-IIISEQ NO9IDctAGCGGTTCTTCTAGTAGTCTAttcctgc tgctaggctg構(gòu)建amiA前體X13MR a-IVSEQ NO10IDaaTAGACTACTAGAAGAACCGCTagag aggcaaaagtgaa構(gòu)建amiA前體X13MR b-ISEQ NO11IDagTGTAGCGAGAATCTGTCGCCGcagg agattcagtttga構(gòu)建amiB前體X13MR b-IISEQ NO12IDtgCGGCGACAGATTCTCGCTACActgct gctgctacagcc構(gòu)建amiB前體X13MR b-IIISEQ NO13IDctCGGCGTCAGTTTCTCGCTACAttcctg ctgctaggctg構(gòu)建amiB前體X13MRSEQIDaaTGTAGCGAGAAACTGACGCCGagag構(gòu)建amiB前體b-IVNO14aggcaaaagtgaaG4368SEQ NO15IDCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAAC構(gòu)建amiRNA前體通用 引物G4369SEQ NO16IDGCGGATAACAATTTCACACAGGAAA CAG構(gòu)建amiRNA前體通用 引物OsrbcS-FSEQ NO17IDAAGCTTTCGGGTCGAGGTGAACTTT A擴(kuò)增Osrbcsp啟動(dòng)子OsrbcS-RSEQ NO18IDCTGCAGAGATGCACTGCTCTGCACA C擴(kuò)增Osrbcsp啟動(dòng)子AtrbcS- FSEQ NO19IDCTGCAGTCCGTGGTCGAGATTGTGT A擴(kuò)增Atrbcsp啟動(dòng)子AtrbcS-RSEQ NO20IDGTCGACTCTTTGTGTGACTGAGGTT TGG擴(kuò)增Atrbcsp啟動(dòng)子Htp-IFSEQ NO:21IDAGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGA潮霉素抗性基因PCRHtp-IRSEQ NO22IDTCAAGACCAATGCGGAGCATATAC潮霉素抗性基因PCRGAPDH -FSEQ NO23IDCTGCAACTCAGAAGACCGTTGReal time PCR內(nèi)參引物
權(quán)利要求
一種提高水稻對(duì)白葉枯病抗性的DNA分子，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO4所述。
2.一種提高水稻對(duì)白葉枯病抗性的轉(zhuǎn)基因的方法，其特征在于，利用序列表SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6所示的來源于水稻及擬南芥的葉片特異性表達(dá)啟動(dòng)子，以及序列 表SEQ IDN0 3所示的人工amiRNA前體構(gòu)建獲得如圖5所示的表達(dá)載體Osrbcsp+amiB 和Atrbcsp+amiB，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將所述的表達(dá)載體Osrbcsp+amiB和 Atrbcsp+amiB導(dǎo)入水稻受體中，使其在轉(zhuǎn)基因水稻中表達(dá)21nt的人工microRNA，特異性地 抑制水稻中Xal3基因在葉片中的表達(dá)，使轉(zhuǎn)基因植株增強(qiáng)對(duì)白葉枯病的抗性。
3.權(quán)利要求1所述的DNA分子在增加水稻對(duì)白葉枯病抗性中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一條21nt水稻抗病相關(guān)DNA分子的設(shè)計(jì)、驗(yàn)證及應(yīng)用。本發(fā)明人工設(shè)計(jì)了一條21nt的人工microRNA序列，并利用天然microRNAosa-mi528的前體作為骨架，構(gòu)建了人工microRNA前體。在轉(zhuǎn)基因水稻中，利用水稻或擬南芥來源的葉片特異性啟動(dòng)子特異性地表達(dá)這條人工microRNA的前體，可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)白葉枯病的抗性，同時(shí)不影響轉(zhuǎn)基因水稻的育性等重要農(nóng)藝性狀。
文檔編號(hào)C12N15/82GK101979548SQ201010286238
公開日2011年2月23日 申請(qǐng)日期2010年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月16日
發(fā)明者李昌焱, 林擁軍, 陳浩 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)