專利名稱：凝固蛋白原原料及其制造方法、使用它測(cè)定來(lái)自生物的生理活性物質(zhì)的方法和測(cè)定裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于迅速或高靈敏度地進(jìn)行內(nèi)毒素、β-D-葡聚糖等來(lái)自生物的生理活性物質(zhì)的檢測(cè)或濃度測(cè)定的試劑、其制造方法、以及使用該試劑的測(cè)定方法和測(cè)定裝置。
背景技術(shù)：
內(nèi)毒素是存在于革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁中的脂多糖，是最有代表性的致熱原。如果被該內(nèi)毒素污染的輸液、注射藥、血液等進(jìn)入人體，則可能引起發(fā)熱、休克等嚴(yán)重的副作用。因此，需要管理上述藥物等以使其不被內(nèi)毒素污染。在鱟(力f卜力二)的血細(xì)胞提取物(以下也稱為“LAL 鱟變形細(xì)胞溶解物”)中存在被內(nèi)毒素激活的酶——絲氨酸蛋白酶。并且在LAL與內(nèi)毒素反應(yīng)時(shí)，根據(jù)內(nèi)毒素量而激活的絲氨酸蛋白酶產(chǎn)生酶級(jí)聯(lián)，由此，存在于LAL中的凝固蛋白原被水解成凝固素，凝固素締合生成不溶性的凝膠。利用該LAL的特性，可以高靈敏度地檢測(cè)內(nèi)毒素。另外，β -D-葡聚糖是構(gòu)成真菌中特征性細(xì)胞膜的多糖。通過(guò)測(cè)定β -D-葡聚糖， 不僅在如念珠菌(Candida) ^il· ^ il· % (Spergillus)、隱球菌(Cryptococcus)的一般臨床中常見(jiàn)的真菌中，而且在也包含稀有真菌的廣范圍內(nèi)對(duì)于真菌感染病的篩選等是有效的。在β -D-葡聚糖的測(cè)定中，也利用鱟的血細(xì)胞提取成分被β -D-葡聚糖凝固(凝膠凝固)的特性，可以高靈敏度地檢測(cè)β-D-葡聚糖。對(duì)這種內(nèi)毒素、β-D-葡聚糖等可由鱟的血細(xì)胞提取成分檢測(cè)的來(lái)自生物的生理活性物質(zhì)(以下也稱為規(guī)定生理活性物質(zhì))進(jìn)行檢測(cè)或濃度測(cè)定的方法是半定量凝膠化法，其中將要進(jìn)行規(guī)定生理活性物質(zhì)的檢測(cè)或濃度測(cè)定(以下也簡(jiǎn)稱為“規(guī)定生理活性物質(zhì)的測(cè)定”)的樣品與基于LAL制造的試劑(LAL試劑)混合所得的混合液靜置，在一定時(shí)間后將容器倒轉(zhuǎn)，通過(guò)樣品有無(wú)垂落來(lái)判定是否凝膠化，從而檢查樣品中是否含有一定濃度以上的內(nèi)毒素。還有比濁法、比色法等，在比濁法中，LAL試劑與規(guī)定生理活性物質(zhì)的反應(yīng)導(dǎo)致凝膠的生成，隨時(shí)間測(cè)量伴隨凝膠生成的樣品濁度進(jìn)行分析；在比色法中，使用由于酶級(jí)聯(lián)而水解并顯色的合成底物。在通過(guò)上述比濁法進(jìn)行規(guī)定生理活性物質(zhì)的測(cè)定的情況下，在經(jīng)干熱滅菌處理的玻璃制測(cè)定池內(nèi)生成測(cè)定樣品與LAL試劑的混合液。然后，從外部對(duì)混合液的凝膠化進(jìn)行光學(xué)測(cè)定。但是，在比濁法中，特別是在規(guī)定生理活性物質(zhì)的濃度低的樣品中，存在混合液發(fā)生凝膠化需要很長(zhǎng)時(shí)間的情況。為此，需要可進(jìn)行規(guī)定生理活性物質(zhì)的短時(shí)間測(cè)定的方法。已提出了激光散射顆粒測(cè)量法等，該方法例如用磁性攪拌子來(lái)攪拌測(cè)定樣品與LAL試劑的混合液，由此生成凝膠微粒，根據(jù)由凝膠顆粒散射的激光強(qiáng)度或者透過(guò)混合液的光強(qiáng)度，可在短時(shí)間內(nèi)測(cè)定樣品中規(guī)定生理活性物質(zhì)的存在。LAL試劑是以鱟的血細(xì)胞提取物為主要原料制造的。因此，在制造中，內(nèi)毒素、 β-D-葡聚糖可能以一定的概率混入，形成無(wú)法作為試劑利用的廢棄物。另外，在內(nèi)毒素或β -D-葡聚糖中任一種的測(cè)定方法中，測(cè)定試劑的原料都為有限資源的鱟的血細(xì)胞提取物， 因此必須努力減少試劑的使用量、或者降低試劑制造上的損耗。作為減少試劑使用量的嘗試，當(dāng)然可以單純地減少樣品容量，另外提高測(cè)定靈敏度因而降低測(cè)定次數(shù)也是有效的。另一方面，為了減少制造上的損耗，如何抑制內(nèi)毒素、 β-D-葡聚糖帶來(lái)的污染是重要的。進(jìn)一步地，還必須考慮如何從制造過(guò)程中變得無(wú)法作為試劑使用的原料中除去內(nèi)毒素、β-D-葡聚糖，進(jìn)行再利用，或者作為輔助性的試劑添加物利用等。在作為輔助性的試劑添加物利用的情況下，考慮作為起試劑粘性調(diào)節(jié)劑的作用、在凝膠化·凝集中起中心作用的凝固蛋白原原料的利用等。但是，如果只是除去例如被內(nèi)毒素污染而變得無(wú)法使用的原料中的內(nèi)毒素，仍不可能除去已經(jīng)被激活的酶組。只使原料中的酶活性失活而仍保持凝固蛋白原的功能，即，被激活的凝固酶水解形成凝固素、發(fā)生凝膠化·凝集反應(yīng)的功能的原料的制造方法尚未見(jiàn)報(bào)道。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
專利文獻(xiàn)
專利文獻(xiàn)1 日本特許第2667695號(hào)公報(bào)； 專利文獻(xiàn)2 日本特開(kāi)2004-061314號(hào)公報(bào)； 專利文獻(xiàn)3 日本特開(kāi)平10-2931 號(hào)公報(bào)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)上述問(wèn)題而提出，其目的在于提供獲得凝固蛋白原原料的技術(shù)，所述原料保持LAL試劑或者被來(lái)自生物的生理活性物質(zhì)污染的LAL試劑等中的凝固蛋白原功能、同時(shí)使凝固酶活性不可逆地失活，并且可用于試劑。為解決上述課題，本發(fā)明的最大特征在于通過(guò)在某種溫度條件下對(duì)允許混入一些規(guī)定生理活性物質(zhì)的LAL試劑進(jìn)行加熱處理，只使LAL試劑中的酶活性不可逆地失活。在本發(fā)明中，此時(shí)凝固蛋白原原本的活性得以保持，該凝固蛋白原原本的活性是被激活的凝固酶水解形成凝固素，引發(fā)凝膠化·凝集反應(yīng)。更具體地說(shuō)，本發(fā)明是凝固蛋白原原料的制造方法，該凝固蛋白原原料在下述情況下使用使含有規(guī)定的酶組和凝固蛋白原的鱟的血細(xì)胞提取物L(fēng)AL與來(lái)自生物的規(guī)定的生理活性物質(zhì)反應(yīng)，通過(guò)上述生理活性物質(zhì)激活上述酶組，發(fā)生酶級(jí)聯(lián)，由此，凝固蛋白原被水解為凝固素，利用該性質(zhì)檢測(cè)上述生理活性物質(zhì)或測(cè)定上述生理活性物質(zhì)的濃度；本發(fā)明的凝固蛋白原原料的制造方法的特征在于將LAL以規(guī)定溫度加熱處理規(guī)定時(shí)間，從而使該LAL中的上述酶組的至少一部分失活，同時(shí)保持凝固蛋白原的活性。由此，可以使LAL中構(gòu)成酶級(jí)聯(lián)的酶組的至少一部分失活，由此來(lái)抑制酶級(jí)聯(lián)的發(fā)生，可以獲得即使被內(nèi)毒素、β-D-葡聚糖等污染也難以被水解形成凝固素的凝固蛋白原原料。另外，由此，可以使由于內(nèi)毒素、β -D-葡聚糖等的污染而變得不可使用的LAL試劑的凝固蛋白原在保持其功能的情況下獲得，因此可以更有效地活用由鱟的血細(xì)胞獲得的有限的資源。這里，規(guī)定的酶組例如是指LAL中的C因子、B因子、G因子、凝固酶前體等，它們通過(guò)內(nèi)毒素、β-D-葡聚糖等發(fā)生酶級(jí)聯(lián)，可生成最終水解凝固蛋白原的凝固酶的酶類。即，不使LAL中的全部的酶失活，而是使至少一部分酶失活，即使存在內(nèi)毒素或β -D-葡聚糖等， 也不會(huì)生成最終水解凝固蛋白原的凝固酶，則可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。另外，在上述描述中，來(lái)自生物的規(guī)定的生理活性物質(zhì)是指具有下述特性的生理活性物質(zhì)激活LAL中的規(guī)定的酶組，發(fā)生酶級(jí)聯(lián)，生成最終水解凝固蛋白原的凝固酶，例如如上所述，可舉出內(nèi)毒素、β-D-葡聚糖。不過(guò)，其意圖也包含具有同等特性的其它生理活性物質(zhì)，并不限于上述2種物質(zhì)。在上述描述中，在LAL以溶液的形式供給的情況下，可以使規(guī)定溫度為60°C以上。 這里，根據(jù)本發(fā)明人的深入研究，了解到將溶液形式的LAL試劑在60°C以上加熱處理，則可以使絲氨酸蛋白酶等酶組的酶活性大致完全失活。因此，在LAL以溶液的形式供給的情況下，通過(guò)使規(guī)定溫度為60°C以上，可以更確實(shí)地獲得即使被內(nèi)毒素、β-D-葡聚糖等污染， 也不會(huì)被水解生成凝固素的凝固蛋白原原料。另外，在上述描述中，在LAL以溶液形式供給的情況下，規(guī)定溫度可以是80°C以下。這里，根據(jù)本發(fā)明人的深入研究，了解到在將LAL試劑加熱處理至比80°C高的溫度、使酶活性失活的情況下，由于LAL中蛋白質(zhì)的變性而使試劑發(fā)生白濁。這樣，可能不適合通過(guò)試劑的透射光、散射光，通過(guò)光學(xué)方法進(jìn)行規(guī)定生理活性物質(zhì)的檢測(cè)或濃度測(cè)定的目的。因此，在本發(fā)明中，在LAL以溶液形式供給的情況下，通過(guò)使規(guī)定溫度為80°C以下，可以獲得也適合光學(xué)測(cè)定的、利用價(jià)值更高的凝固蛋白原原料。并且，在上述描述中，在LAL以溶液的形式供給的情況下，規(guī)定時(shí)間可以是10分鐘以上且8小時(shí)以下。這里，在將溶液形式的LAL試劑在60°C以上加熱處理的情況下，可知加熱時(shí)間10分鐘左右可以使絲氨酸蛋白酶等酶組的酶活性大致完全失活。因此，通過(guò)使規(guī)定時(shí)間為10分鐘以上，可以在廣范圍的加熱溫度下使絲氨酸蛋白酶等酶組的酶活性大致完全失活。另外，在加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的情況下，即使在低溫下LAL中的蛋白質(zhì)也會(huì)變性，產(chǎn)生白濁。因此，在本發(fā)明中，通過(guò)使規(guī)定時(shí)間為10分鐘以上且8小時(shí)以下，可以更確實(shí)地獲得即使被內(nèi)毒素、β -D-葡聚糖等污染也不會(huì)被水解形成凝固素的適合光學(xué)測(cè)定的凝固蛋白原原料。并且，在上述描述中，在LAL以冷凍干燥物的形式供給的情況下，規(guī)定溫度可以是 100°C以上且250°C以下。這里可知，在LAL以冷凍干燥物的形式供給的情況下，與以溶液的形式供給時(shí)比較，必須以更高的溫度加熱處理。在這種情況下，通過(guò)使LAL試劑為100°C以上且250°C以下，可以更確實(shí)地獲得即使被內(nèi)毒素、β -D-葡聚糖等污染也不會(huì)被水解形成凝固素的適合光學(xué)測(cè)定的、利用價(jià)值更高的凝固蛋白原原料。另外，在這種情況下，可以使規(guī)定時(shí)間為300分鐘以上。這里，在LAL以冷凍干燥物的形式供給的情況下可知，通過(guò)將LAL試劑在120°C下加熱300分鐘，可以使絲氨酸蛋白酶等酶組的酶活性大致完全失活。因此，通過(guò)使規(guī)定時(shí)間為300分鐘以上，可以在更廣范圍的加熱溫度下更確實(shí)地獲得即使被內(nèi)毒素、β -D-葡聚糖等污染也不會(huì)被水解形成凝固素的凝固蛋白原原料。另外，本發(fā)明也為凝固蛋白原原料，該凝固蛋白原原料在下述情況下使用使含有規(guī)定的酶組和凝固蛋白原的鱟的血細(xì)胞提取物L(fēng)AL與來(lái)自生物的規(guī)定的生理活性物質(zhì)反應(yīng)，通過(guò)上述生理活性物質(zhì)激活上述酶組，發(fā)生酶級(jí)聯(lián)，由此，凝固蛋白原被水解為凝固素，利用該性質(zhì)檢測(cè)上述生理活性物質(zhì)或測(cè)定上述生理活性物質(zhì)的濃度；
所述凝固蛋白原原料的特征在于將LAL以規(guī)定溫度加熱處理規(guī)定時(shí)間，從而使該LAL 中的上述酶組的至少一部分失活。在該凝固蛋白原原料中，與規(guī)定生理活性物質(zhì)反應(yīng)而發(fā)生酶級(jí)聯(lián)的酶組失活，因此可以抑制由于少量的規(guī)定生理活性物質(zhì)污染而使凝固蛋白原水解、生成凝固素的情況， 可以獲得操作性更良好的凝固蛋白原原料。在這種情況下，在LAL以溶液的形式供給的情況下，規(guī)定溫度可以是60°C以上。還可以是80°C以下。并且規(guī)定時(shí)間可以是10分鐘以上且 8小時(shí)以下。另一方面，在LAL以冷凍干燥物的形式供給的情況下，規(guī)定溫度可以是100°C 以上且250°C以下。另外，規(guī)定時(shí)間可以是300分鐘以上。另外，本發(fā)明中可以是用于上述生理活性物質(zhì)的檢測(cè)或上述生理活性物質(zhì)濃度測(cè)定的LAL試劑，其特征在于通過(guò)將上述得到的凝固蛋白原原料與未經(jīng)加熱處理的LAL混合，提高上述未經(jīng)加熱處理的LAL中的凝固蛋白原濃度。即，通過(guò)將使規(guī)定的酶組失活的凝固素原料加入到未經(jīng)加熱處理的LAL中，可以制備凝固蛋白原濃度比通常更高的LAL試劑。由此，可以使凝固蛋白原的量相對(duì)增加，該凝固蛋白原被與規(guī)定生理活性物質(zhì)反應(yīng)而激活的酶組水解、形成凝固素。因此，可以使規(guī)定生理活性物質(zhì)引起的LAL試劑的凝膠化更為顯著，可以更高靈敏度地進(jìn)行規(guī)定生理活性物質(zhì)的測(cè)定。另外，本發(fā)明可以是用于測(cè)定內(nèi)毒素的、結(jié)合凝固蛋白原的微珠，其特征在于將上述得到的凝固蛋白原原料中的凝固蛋白原結(jié)合或吸附于比該凝固蛋白原直徑大的多個(gè)微粒的表面來(lái)制備。這里可知，使內(nèi)毒素等的規(guī)定生理活性物質(zhì)與凝固蛋白原結(jié)合或吸附于例如樹(shù)脂制微粒上的狀態(tài)的LAL作用時(shí)，與使規(guī)定生理活性物質(zhì)與LAL單體作用的情形比較，早期生成更大的凝集塊。這是由于微粒上的凝固蛋白原被LAL中的酶級(jí)聯(lián)水解，形成凝固素，它們使微粒之間產(chǎn)生締合。還明確了，該凝集反應(yīng)難以受樣品的濁度、顏色的影響，并且該凝集反應(yīng)與由LAL單體所引發(fā)的凝集反應(yīng)相比非常強(qiáng)大。在本發(fā)明中，利用該現(xiàn)象，制備了使LAL中的酶組失活而得到的凝固蛋白原原料結(jié)合或吸附于微粒上的試劑(以下也稱為“結(jié)合凝固蛋白原的微珠”)。通過(guò)使含有內(nèi)毒素的樣品與將該結(jié)合凝固蛋白原的微珠與LAL混合得到的試劑作用，LAL中原本存在的凝固蛋白原成為凝固素，發(fā)生凝集，同時(shí)，結(jié)合或吸附于微粒上的凝固蛋白原成為凝固素，使微粒之間締合，早期生成更大的凝集塊。由此，可以大幅促進(jìn)LAL試劑與樣品的混合液中凝膠顆粒的生成。結(jié)果，可以更迅速且高靈敏度地進(jìn)行規(guī)定生理活性物質(zhì)的檢測(cè)或濃度的測(cè)定。LAL中所含的凝固蛋白原結(jié)合或吸附于微粒上時(shí)，首先，使可結(jié)合、吸附蛋白質(zhì)的官能團(tuán)存在于微粒的表面。然后，根據(jù)以往的方法，在該狀態(tài)下使LAL作用，使凝固蛋白原與微粒表面化學(xué)鍵合，或者靜電性、親水性、疏水性地吸附。此時(shí)的LAL中的反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，因此考慮在以往的方法中，微粒、所使用的試劑類、水等中微量混合存在的規(guī)定生理活性物質(zhì)與蛋白質(zhì)中的酶組反應(yīng)，凝固蛋白原被水解為凝固素，在凝固蛋白原與微粒的結(jié)合 吸附反應(yīng)中，就開(kāi)始發(fā)生了微粒的凝集。并且在這種情況下，由于酶的激活，試劑中的凝固蛋白原可能被水解、消耗。針對(duì)上述問(wèn)題，以往，在將凝固蛋白原結(jié)合或吸附于微粒表面時(shí)，必須在使LAL試劑與微粒的懸浮液混合的同時(shí)，添加抑制LAL中的酶組與規(guī)定生理活性物質(zhì)反應(yīng)的抑制劑，將凝固蛋白原結(jié)合或吸附于微粒表面的操作復(fù)雜，在成本方面不利。與此相對(duì)，在本發(fā)明中，在凝固蛋白原原料的制備過(guò)程中使LAL中的酶組失活，因此可以省略添加抑制劑的步驟。由此，可以更簡(jiǎn)便或以更低廉的成本制備將凝固蛋白原結(jié)合或吸附于微粒上的試劑。另外，本發(fā)明可以是來(lái)自生物的生理活性物質(zhì)的測(cè)定方法，其特征在于將上述凝固蛋白原原料與未加熱處理的LAL混合，由此提高上述未經(jīng)加熱處理的LAL中的凝固蛋白原濃度，將上述所得的LAL試劑與含有上述規(guī)定的生理活性物質(zhì)的樣品混合；用上述規(guī)定的生理活性物質(zhì)激活上述LAL試劑中的酶組，通過(guò)發(fā)生的酶級(jí)聯(lián)將濃度得到提高的上述凝固蛋白原水解為凝固素，利用上述過(guò)程來(lái)檢測(cè)上述規(guī)定生理活性物質(zhì)或測(cè)定上述規(guī)定生理活性物質(zhì)的濃度。根據(jù)該來(lái)自生物的生理活性物質(zhì)的測(cè)定方法，可以使用更高濃度的凝固蛋白原進(jìn)行規(guī)定生理活性物質(zhì)的測(cè)定。因此，可以使規(guī)定生理活性物質(zhì)與LAL的反應(yīng)導(dǎo)致的凝膠化更為顯著，可以更高靈敏度地測(cè)定規(guī)定生理活性物質(zhì)。另外，本發(fā)明可以是來(lái)自生物的生理活性物質(zhì)的測(cè)定方法，其特征在于將上述結(jié)合凝固蛋白原的微珠與未經(jīng)加熱處理的LAL和含有上述規(guī)定生理活性物質(zhì)的樣品混合， 由此，通過(guò)上述規(guī)定的生理活性物質(zhì)，上述未經(jīng)加熱處理的LAL中的酶組被激活，發(fā)生酶級(jí)聯(lián)，由此，結(jié)合或吸附于上述微粒表面的凝固蛋白原被水解為凝固素，上述微粒之間交聯(lián)， 利用該性質(zhì)來(lái)檢測(cè)上述規(guī)定的生理活性物質(zhì)或測(cè)定上述規(guī)定的生理活性物質(zhì)的濃度。根據(jù)該規(guī)定的生理活性物質(zhì)的測(cè)定方法，使含有內(nèi)毒素的樣品與如下制備的試劑作用將使LAL中的酶組失活得到的凝固蛋白原原料結(jié)合或吸附于微粒上，將所得到的結(jié)合凝固蛋白原的微珠和未經(jīng)加熱處理的LAL混合而成的試劑。由此，原本在LAL中存在的凝固蛋白原成為凝固素，發(fā)生凝集，同時(shí)，結(jié)合或吸附于微粒上的凝固蛋白原成為凝固素， 使微粒之間締合，早期生成更大的凝集塊。由此可以大幅促進(jìn)LAL試劑與樣品的混合液中凝膠顆粒的生成。結(jié)果，可以更迅速且高靈敏度地進(jìn)行規(guī)定生理活性物質(zhì)的檢測(cè)或濃度的測(cè)定。另外，本發(fā)明可以是來(lái)自生物的生理活性物質(zhì)的攪拌比濁測(cè)定裝置，其特征在于， 該裝置裝備有以下設(shè)備
混合液保持設(shè)備，其使上述結(jié)合凝固蛋白原的微珠、未經(jīng)加熱處理的LAL和含有上述規(guī)定的生理活性物質(zhì)的樣品的混合液保持可以入射光，并使上述混合液中的反應(yīng)進(jìn)行； 攪拌設(shè)備，其攪拌上述混合液保持設(shè)備中的上述混合液； 光入射設(shè)備，其向上述混合液保持設(shè)備中的混合液入射光； 受光設(shè)備，其接收上述入射光在上述混合液中的透射光，并將其轉(zhuǎn)換為電信號(hào)； 導(dǎo)出設(shè)備，其通過(guò)從在上述受光設(shè)備中變換的電信號(hào)獲得的上述混合液的透射率而導(dǎo)出上述樣品中上述生理活性物質(zhì)的濃度。本發(fā)明中，將使LAL中的酶組失活得到的凝固蛋白原原料結(jié)合或吸附于微粒上所得到的結(jié)合凝固蛋白原的微珠、未經(jīng)加熱處理的LAL和含有規(guī)定生理活性物質(zhì)的樣品混合，加入混合液保持設(shè)備中。然后，通過(guò)攪拌設(shè)備攪拌該混合液，由此促進(jìn)被規(guī)定生理活性物質(zhì)激活的凝固酶導(dǎo)致的凝固蛋白原的水解、以及由水解得到的凝固素所導(dǎo)致的微粒的締
I=I ο
然后，測(cè)定由光入射設(shè)備入射的光中透過(guò)上述混合液到達(dá)受光元件的光強(qiáng)度。在導(dǎo)出設(shè)備中，進(jìn)一步由上述混合液的透射率導(dǎo)出規(guī)定生理活性物質(zhì)的濃度。這里，結(jié)合或吸附于微粒上的凝固蛋白原的水解進(jìn)展、生成凝固素時(shí)，凝固素使微粒之間締合，早期生成更大的凝集塊。這里，結(jié)合凝固蛋白原的微珠、未經(jīng)加熱處理的LAL 和含有規(guī)定生理活性物質(zhì)的樣品的混合液在混合時(shí)，大量微珠的微粒分散，因此產(chǎn)生強(qiáng)烈的混濁。然后，由于生成凝固素而使微粒的締合進(jìn)展時(shí)，微粒的濃度急劇減少，因此混合液的透射率急劇升高。本發(fā)明中的攪拌比濁測(cè)定裝置與有關(guān)通常的比濁法的測(cè)定裝置不同，其測(cè)定伴隨著凝固素生成的微粒的締合導(dǎo)致的透射率急劇升高，因此，與攪拌混合液帶來(lái)的反應(yīng)促進(jìn)效果相聯(lián)合，可以大幅縮短測(cè)定時(shí)間，同時(shí)可以非常高靈敏度地進(jìn)行規(guī)定生理活性物質(zhì)的測(cè)定。對(duì)于解決上述本發(fā)明的課題的設(shè)備，其可以盡可能地組合使用。在本發(fā)明中，可以獲得保持LAL試劑、或者被來(lái)自生物的生理活性物質(zhì)污染的LAL 試劑等中的凝固蛋白原的功能，同時(shí)使凝固酶活性不可逆地失活，并且可用于試劑的凝固蛋白原原料。


圖1是表示本發(fā)明的實(shí)施例中的LAL試劑水溶液的加熱溫度與殘留凝固酶比活性的關(guān)系的圖。圖2是表示本發(fā)明的實(shí)施例中的LAL試劑冷凍干燥物的加熱時(shí)間與殘留凝固酶比活性的關(guān)系的圖。圖3是表示本發(fā)明的實(shí)施例中比濁測(cè)量裝置的概略構(gòu)成的圖。圖4是用于說(shuō)明活性凝固酶導(dǎo)致凝固蛋白原的凝膠化 凝集過(guò)程和結(jié)合凝固蛋白原的微珠的凝集過(guò)程的圖。圖5是對(duì)結(jié)合凝固蛋白原的微珠法和比濁法中的內(nèi)毒素用量反應(yīng)進(jìn)行比較的圖。圖6是用于對(duì)通過(guò)內(nèi)毒素或β -D-葡聚糖使LAL凝膠化的過(guò)程及其檢測(cè)方法進(jìn)行說(shuō)明的概略圖。
具體實(shí)施例方式
已對(duì)LAL與內(nèi)毒素反應(yīng)生成凝膠的過(guò)程進(jìn)行了詳細(xì)研究。即，如圖6所示，內(nèi)毒素與LAL 中的絲氨酸蛋白酶C因子結(jié)合時(shí)，C因子被激活，形成活性C因子，活性C因子水解LAL中的其它絲氨酸蛋白酶B因子，使其激活，形成活性B因子。該活性B因子立即水解LAL中的凝固酶前體，形成凝固酶，并且，該凝固酶水解LAL中的凝固蛋白原，生成凝固素。然后，生成的凝固素互相締合，進(jìn)一步生成不溶性的凝膠，認(rèn)為全部LAL牽涉在其中，形成凝膠化。另外同樣地，β -D-葡聚糖與LAL中的G因子結(jié)合時(shí)，G因子被激活，形成活性G因子，活性G因子水解LAL中的凝固酶前體，形成凝固酶。結(jié)果，與內(nèi)毒素同LAL的反應(yīng)同樣， 生成凝固素，生成的凝固素互相締合，進(jìn)一步生成不溶性的凝膠。該一系列反應(yīng)與在哺乳動(dòng)物中見(jiàn)到的克里斯馬斯(Christmas)因子、凝血酶等絲氨酸蛋白酶介導(dǎo)的纖維蛋白凝膠生成過(guò)程類似。這種酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)是即使是極少量的激活因子也會(huì)引起之后的級(jí)聯(lián)連鎖活化，因此具有非常強(qiáng)的擴(kuò)增作用。因此，根據(jù)使用LAL的規(guī)定生理活性物質(zhì)的測(cè)定法，可以檢測(cè)出亞皮克/mL級(jí)的極微量的規(guī)定生理活性物質(zhì)。
可以定量規(guī)定生理活性物質(zhì)的測(cè)定方法如上所述，可舉出比濁法、以及激光散射顆粒測(cè)量法。關(guān)于這些測(cè)定方法，前者是以樣品的濁度、后者是以系統(tǒng)內(nèi)生成的凝膠微粒來(lái)檢測(cè)由該LAL的酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)生成的凝固素的締合物，可進(jìn)行高靈敏度的測(cè)定。特別是在激光散射顆粒測(cè)量法中，由于直接測(cè)定在系統(tǒng)內(nèi)生成的凝膠的微粒，因此比比濁法靈敏度更高，并且由于通常是強(qiáng)制性攪拌含有LAL和分析物的樣品，因此與比濁法比較可在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)出凝膠的生成。另外，內(nèi)毒素的其它測(cè)定方法有比色法。如圖6所示，其為下述方法雖然利用LAL 的酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，但并不測(cè)定凝固素凝膠導(dǎo)致的樣品的濁度，而是利用因凝固酶而受到水解而顯色的合成底物，使含有合成底物的LAL與分析物反應(yīng)，測(cè)定其吸光度變化。在該比色法中，測(cè)定在系統(tǒng)內(nèi)生成的顯色物質(zhì)的濃度，因此與測(cè)定樣品中的凝膠生成的比濁法、激光散射顆粒測(cè)量法比較，可以在短時(shí)間內(nèi)測(cè)定低濃度的規(guī)定生理活性物質(zhì)。在制造用于按照上述各測(cè)定方法測(cè)定內(nèi)毒素、β -D-葡聚糖的LAL試劑的過(guò)程中， 如果混入了內(nèi)毒素或β -D-葡聚糖，則根據(jù)混入的物質(zhì)的量，在試劑制造中存在原料發(fā)生了凝膠化而無(wú)法作為試劑使用的情況。此時(shí)的混入量即使是微量，也如上所述，由于LAL試劑具有酶的級(jí)聯(lián)產(chǎn)生的擴(kuò)增作用，因此，在試劑的制備需要較長(zhǎng)時(shí)間的情況下，可能全體試劑發(fā)生凝膠化。關(guān)于內(nèi)毒素，已知存在多粘菌素B、聚賴氨酸等的吸附物質(zhì)，通過(guò)將所述吸附物質(zhì)應(yīng)用于LAL試劑可以除去混入的內(nèi)毒素。但是，已經(jīng)激活的C因子、B因子、以及凝固酶在酶級(jí)聯(lián)的最下游的水解凝固蛋白原的方向上持續(xù)作用，因此，只除去內(nèi)毒素?zé)o法防止LAL試劑的凝膠化。這對(duì)于β-D-葡聚糖也是同樣的。以下示出即使極微量混入內(nèi)毒素或β-D-葡聚糖，也可以抑制在制造中發(fā)生凝膠化的LAL試劑、或者以LAL試劑為材料的凝固蛋白原原料的制造方法的例子。但是，本發(fā)明的LAL試劑和凝固蛋白原原料的制造方法并不限于以下的例子。有關(guān)本發(fā)明的凝固蛋白原原料的材料可以使用鱟的血細(xì)胞提取物、使用該提取物制造的LAL試劑、以及在它們之中有極微量的內(nèi)毒素或β -D-葡聚糖混入因此無(wú)法作為試劑使用的廢棄物等。但是，本發(fā)明的目的在于制造具有功能的凝固蛋白原原料，因此，已經(jīng)有大多數(shù)凝固蛋白原成為凝固素、已經(jīng)凝膠化的物質(zhì)除外。對(duì)于這些材料，可根據(jù)需要添加吸附內(nèi)毒素的物質(zhì)、吸附β-D-葡聚糖的物質(zhì)、使內(nèi)毒素的作用失活的物質(zhì)、使β-D-葡聚糖的作用失活的物質(zhì)的至少一種以上。吸附內(nèi)毒素的物質(zhì)可例舉多粘菌素B、聚賴氨酸、聚鳥(niǎo)氨酸、聚乙烯亞胺等，或者 C因子本身或含有C因子結(jié)合內(nèi)毒素的部位的蛋白質(zhì)、多肽、結(jié)合內(nèi)毒素的抗體等。使內(nèi)毒素失活的物質(zhì)可例舉含有鐵離子、鋁離子、鉻離子、鎳離子、鈷離子、錳離子的水溶液，以及供給它們的金屬片等。同樣，與β-D-葡聚糖結(jié)合的物質(zhì)可例舉凝集素、或G因子本身或含有G因子結(jié)合β-D-葡聚糖的部位的蛋白質(zhì)、多肽、結(jié)合β-D-葡聚糖的抗體等。另外，為了使β-D-葡聚糖失活，考慮通過(guò)降低材料的氫離子濃度而使β -D-葡聚糖的溶解性降低并析出。接著，對(duì)于如此地根據(jù)需要混合了最適當(dāng)?shù)奶砑游锏牟牧线M(jìn)行加熱處理。通過(guò)以適當(dāng)?shù)募訜釡囟?、加熱時(shí)間進(jìn)行該加熱處理，使材料中規(guī)定的酶組C因子、活性C因子、B因子、活性B因子、G因子、活性G因子、凝固酶前體、凝固酶的至少一部分不可逆地失活。并且，不會(huì)通過(guò)與內(nèi)毒素、β-D-葡聚糖的反應(yīng)而生成凝固酶。這樣，即使被內(nèi)毒素、β-D-葡聚糖污染，也可以獲得不被水解形成凝固素而發(fā)生凝膠化的凝固蛋白原原料。這種情況的加熱處理可根據(jù)材料的狀態(tài)適當(dāng)調(diào)節(jié)加熱溫度和加熱時(shí)間。例如在材料為溶液的情況下，反應(yīng)的溫度優(yōu)選40°C以上且140°C以下，進(jìn)一步優(yōu)選60°C以上且100°C 以下。優(yōu)選的加熱時(shí)間根據(jù)加熱溫度而有很大不同，優(yōu)選30秒以上且72小時(shí)以下，進(jìn)一步優(yōu)選10分鐘以上且8小時(shí)以下。過(guò)于提高加熱溫度或過(guò)于延長(zhǎng)加熱時(shí)間時(shí)，LAL試劑或者LAL中的蛋白質(zhì)變性，發(fā)生白濁，可能難以在測(cè)定樣品的濁度的方法中使用，并且凝固蛋白原可能變性，喪失功能， 因此需要注意這些問(wèn)題。另一方面，在材料為已經(jīng)形成冷凍干燥物的LAL試劑的情況下，與材料為溶液的情況不同，更高的加熱溫度和更長(zhǎng)的加熱時(shí)間是必須的。加熱溫度優(yōu)選80°C以上且300°C 以下，進(jìn)一步優(yōu)選100°C以上且250°C以下。優(yōu)選的加熱時(shí)間與水溶液的情況同樣地根據(jù)加熱溫度而不同，優(yōu)選30秒以上且72小時(shí)以下，進(jìn)一步優(yōu)選10分鐘以上且8小時(shí)以下。對(duì)于這樣的加熱處理的材料，可根據(jù)需要，用各種金屬鹽或銨鹽、酸、堿、進(jìn)一步地緩沖液等調(diào)節(jié)PH，還可以根據(jù)需要添加表面活性劑、糖類等。這樣制造的凝固蛋白原原料即使與內(nèi)毒素、β-D-葡聚糖直接作用，也不會(huì)引發(fā)凝膠化或凝集反應(yīng)。但是，與激活的凝固酶作用或者與未經(jīng)加熱處理的LAL試劑混合后與內(nèi)毒素、β -D-葡聚糖作用時(shí)，其可以迅速地水解為凝固素，引發(fā)凝膠化或凝集反應(yīng)。另外，通過(guò)本發(fā)明制造的凝固蛋白原原料可在內(nèi)毒素、β-D-葡聚糖的測(cè)定靈敏度提高、測(cè)定時(shí)間縮短、測(cè)定方便性提高等方面起作用。即，通過(guò)將本發(fā)明的凝固蛋白原原料與未經(jīng)加熱處理的LAL試劑混合，可以制備凝固蛋白原的濃度比通常高的LAL試劑。通過(guò)使內(nèi)毒素、β -D-葡聚糖與該LAL試劑作用，可以更迅速地進(jìn)行高靈敏度的測(cè)定。另外，例如通過(guò)制備在將根據(jù)本發(fā)明的凝固蛋白原原料結(jié)合或吸附于聚苯乙烯膠乳的微小顆粒表面的狀態(tài)下的LAL試劑，可實(shí)現(xiàn)比以往的利用比濁法的內(nèi)毒素測(cè)定更大幅度地縮短時(shí)間的測(cè)定方法。S卩，使被內(nèi)毒素、β-D-葡聚糖激活的凝固酶與將凝固蛋白原原料結(jié)合或吸附于聚苯乙烯膠乳的微粒(以下也稱為珠)的表面所得的LAL試劑作用時(shí)，凝固蛋白原由于酶級(jí)聯(lián)而水解，成為凝固素，它們使微粒之間締合。因此，通過(guò)將由本發(fā)明獲得的凝固蛋白原原料中的凝固蛋白原結(jié)合或吸附于微粒，可以更高效率地使微粒之間締合，可以更早期地生成凝集塊。在將本發(fā)明的凝固蛋白原原料中的凝固蛋白原與珠結(jié)合時(shí)考慮以下方法通過(guò)珠所帶有的電荷進(jìn)行吸附的方法；利用珠的離子性質(zhì)的方法；在珠表面形成可與凝固蛋白原原料中的蛋白質(zhì)反應(yīng)的官能團(tuán)，利用該官能基團(tuán)和蛋白質(zhì)中的氨基或羧基進(jìn)行化學(xué)結(jié)合的方法等，并且可以采用任何方法。以往，在改變LAL的材料、這樣進(jìn)行結(jié)合或吸附于珠上的操作時(shí)，制造所需的時(shí)間需要數(shù)小時(shí)以上的較長(zhǎng)時(shí)間，因此，微量混入其它材料中的內(nèi)毒素、β-D-葡聚糖產(chǎn)生影響， 或者這些生理活性物質(zhì)在操作中微量混入，導(dǎo)致原料凝膠化，在這種情況下存在無(wú)法獲得目標(biāo)物質(zhì)的情況。為此，以往考慮了對(duì)原料添加各種酶抑制劑的對(duì)策。該酶抑制劑可例舉氟磷酸二異丙酯、芐脒、苯基甲磺酰氟、4- (2-氨基乙基)-苯磺酰氟、6-脒基-2-萘基-4-胍基苯甲酸酯二甲磺酸鹽、對(duì)脒基苯基甲磺酰氟、抑酶肽、抗蛋白酶、亮抑蛋白酶肽、大腸桿菌素、PPACK (苯丙氨酸-脯氨酸-精氨酸-氯甲酮)、α 2-巨球蛋白、胰蛋白酶抑制劑等。但是，在使用本發(fā)明的凝固蛋白原原料的情況下，只有LAL中的酶功能不可逆地失活，同時(shí)保持凝固蛋白原活性。因此，無(wú)需添加上述酶抑制劑，即可防止在結(jié)合或吸附于珠的操作中混入材料中的內(nèi)毒素、β -D-葡聚糖導(dǎo)致的原料的凝膠化。以下對(duì)于本發(fā)明的凝固蛋白原原料的制造方法進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。制造例給出制造方法的一個(gè)例子，有關(guān)本發(fā)明的制造方法并不限于以下制造例的條件。[制造例1]
在LAL試劑的冷凍干燥物A A 7 ES-II * > 7 A歹ζ卜7 ^ —，和光純藥制造，以下簡(jiǎn)稱為ES-II)中加入規(guī)定量(0. 15 mL)的注射用蒸餾水(大塚制藥制造)，用旋渦混合器混合。然后設(shè)置于預(yù)先加熱至規(guī)定溫度(后述)的鋁塊加熱器(HDB-1N，>制造， 以下如無(wú)特別說(shuō)明，使用這種機(jī)器作為鋁塊加熱器)中，進(jìn)行規(guī)定時(shí)間(后述)的加熱。加熱后立即在冰中冷卻，得到凝固蛋白原原料的水溶液。[制造例2]
將LAL試劑(ES-II)的冷凍干燥物直接設(shè)置于預(yù)先加熱至120度的鋁塊加熱器中，進(jìn)行規(guī)定時(shí)間(后述)的加熱。加熱后立即在冰中冷卻，得到凝固蛋白原原料的冷凍干燥物。[制造例3]
使用可進(jìn)行內(nèi)毒素定量的激光散射顆粒測(cè)量法，對(duì)于制造例1以及制造例2中所得的凝固蛋白原原料的酶活性不可逆失活和凝固蛋白原功能的保持進(jìn)行評(píng)價(jià)。在激光散射顆粒測(cè)量法中，使用內(nèi)部存在用于攪拌樣品的不銹鋼制攪拌子(Φ1 mm，長(zhǎng)度5 mm)的Φ7 mm、 長(zhǎng)度50 mm的專用玻璃容器。為了使該容器中不含內(nèi)毒素，用鋁箔覆蓋容器的開(kāi)口部，進(jìn)一步將各20個(gè)用鋁箔分包的容器裝入鐵制干燥熱處理罐中，在250°C下加熱處理3小時(shí)，使內(nèi)毒素?zé)岱纸?。這樣，通過(guò)干熱處理制造不含內(nèi)毒素的測(cè)定容器并用于試驗(yàn)。[制造例4]
為了研究根據(jù)本發(fā)明的凝固蛋白原原料的凝固蛋白原功能、即，研究凝固蛋白原是否被激活的凝固酶水解并凝膠化，或者是否顯示凝集反應(yīng)，如下得到凝固酶的激活物。即，使 200 μ L 1.0 EU/mL濃度的內(nèi)毒素水溶液與未經(jīng)加熱處理的LAL試劑(ES-II)作用，將LAL 試劑和內(nèi)毒素水溶液的混合物轉(zhuǎn)移至根據(jù)制造例3制造的測(cè)定容器中，在37°C下一邊保溫一邊用在容器底面方向配置了容器內(nèi)部的不銹鋼攪拌子的攪拌器使其旋轉(zhuǎn)，進(jìn)行反應(yīng)。在激光散射顆粒測(cè)量法中，已知通過(guò)內(nèi)毒素凝膠化的LAL試劑由于攪拌而作為微小的凝集塊出現(xiàn)，該凝集塊的出現(xiàn)時(shí)間與樣品中內(nèi)毒素的濃度在雙對(duì)數(shù)圖上形成直線。在該條件下，在約6分鐘檢測(cè)出凝集，檢測(cè)出凝集后繼續(xù)攪拌，自測(cè)定開(kāi)始20分鐘的時(shí)間點(diǎn)， 從裝置中取出容器，將容器內(nèi)部的凝膠凝集物全部回收，轉(zhuǎn)移至無(wú)內(nèi)毒素的一次性離心管中，以15000 rpm (轉(zhuǎn)子半徑7 cm)離心2分鐘，使凝固素聚合物為主成分的凝膠成分沉淀。 通過(guò)其它方法確認(rèn)了離心上清中不含有凝固蛋白原。通過(guò)該制造方法，可制備通過(guò)內(nèi)毒素激活的凝固酶。[制造例5]
向LAL試劑(ES-II)中加入0.2 mL規(guī)定濃度(后述)的內(nèi)毒素水溶液，用旋渦混合器混合，然后設(shè)置于預(yù)先加熱至100°C的鋁塊加熱器上，進(jìn)行20分鐘的加熱。加熱后立即在冰中冷卻，得到混入了內(nèi)毒素的凝固蛋白原原料的水溶液。[制造例6]
將0. 5mL表面被羧基化的聚苯乙烯膠乳微粒(Polybeads羧基化微球，0. 45 μ m，固形成分2. 63%，Polysciences Inc.制造，以下簡(jiǎn)稱為羧基珠)的懸浮液用無(wú)內(nèi)毒素的帶旋蓋的離心管(容量0.2 mL)、以15000 rpm離心5分鐘，除去上清，接著加入注射用蒸餾水，制成2.0 mL，使其懸浮后再次離心，除去上清。再次通過(guò)該離心操作除去上清，然后再懸浮于 1 mL注射用蒸餾水中，其后再轉(zhuǎn)移至無(wú)內(nèi)毒素的帶旋蓋離心管(容量15 mL)。進(jìn)一步加入 4 mL的注射用蒸餾水，然后實(shí)施高壓滅菌(121°C，20分鐘)，使混入珠中的內(nèi)毒素失活以及除去。將高壓滅菌后的羧基珠轉(zhuǎn)移至2 mL容量的帶旋蓋離心管中，按照上述方法將組合了離心和除去上清、進(jìn)一步在注射用蒸餾水中再懸浮的洗滌操作共進(jìn)行2次。接著用注射用蒸餾水溶解，在10 mL制備為20 mg/mL濃度的水溶性碳二亞胺(WSC，同仁化學(xué)制造) 水溶液中混合2 mL 0. 1 M乙酸緩沖液(pH 4. 98)，將其通過(guò)孔徑Φ0. 2 μ m的滅菌用濾器 ($ V 制造)，使上述羧基珠的沉淀物再懸浮于其中的0.5 mL中。另外，向LAL試劑(ES-II)的冷凍干燥物中加入0. 5 mL注射用蒸餾水(大塚制藥制造)進(jìn)行溶解，在60°C下進(jìn)行10分鐘的加熱。將0. 5 mL由該加熱處理得到的本發(fā)明的凝固蛋白原原料和0. 5 mL按照上述方法制備的羧基珠懸浮液、以及10 μ L制備為1. 0%的非離子表面活性劑TritonX-IOO水溶液(用注射用蒸餾水制備后，用孔徑Φ0. 2 μ m的滅菌用濾器過(guò)濾)混合，在室溫下反應(yīng)2小時(shí)。通過(guò)該反應(yīng)，羧基珠的羧基被碳二亞胺激活，然后與凝固蛋白原的氨基發(fā)生酰胺鍵合，在珠表面化學(xué)鍵合凝固蛋白原。反應(yīng)后，如上所述離心、除去上清、用注射用蒸餾水再懸浮2次來(lái)洗滌反應(yīng)物。接著加入100 μ L 0.25 M的氨基乙醇水溶液(用注射用蒸餾水制備后，用孔徑Φ 0.2 μ m的滅菌用濾器過(guò)濾)，在室溫下攪拌20分鐘，使羧基珠上的被激活的羧基中未反應(yīng)的部分失活。然后，同樣用注射用蒸餾水共洗滌3次，再懸浮于5 mL的注射用蒸餾水中，將上述1. 0%的TritonX-IOO水溶液與1的疊氮化鈉水溶液(用注射用蒸餾水制備，然后用孔徑Φ0.2 μ m的滅菌用濾器過(guò)濾)各加入50 μ L，得到結(jié)合凝固蛋白原的微珠。以下對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明。[實(shí)施例1]
在制造例ι中，將鋁塊加熱器的指示溫度設(shè)為4o°c、5o°c、6(rc、7(rc、8(rc、io(rc以及 120°C的任一條件，使加熱時(shí)間為10分鐘，由所制造的凝固蛋白原原料中取出100 yL，加入到制造例3中制造的測(cè)定容器中。向其中加入100 μ L 2.0 EU/mL濃度的內(nèi)毒素水溶液使其作用，用激光散射顆粒測(cè)量裝置(PA-200，興和制造，以下簡(jiǎn)稱為PA-200)進(jìn)行測(cè)定。由未經(jīng)加熱處理時(shí)的測(cè)定濃度(C=l. 0 EU/mL)和加熱的LAL試劑中的測(cè)定濃度(S)，按照下式定義和導(dǎo)出加熱后殘留的酶活性、即殘留凝固酶比活性(A)。A=S/CX100(%)(1)
圖1表示所得殘留凝固酶比活性㈧與LAL試劑水溶液的加熱溫度的關(guān)系。如圖1所示可知，在加熱時(shí)間為10分鐘的情況下，加熱溫度達(dá)到60°C以上，則酶活性完全消失。另外，雖然未圖示，但可觀察到加熱溫度越高則制造后凝固蛋白原原料的水溶液發(fā)生白濁現(xiàn)象。例如，在120°C下加熱制造凝固蛋白原原料水溶液的情況下，有很大一部分由于熱變性而變?yōu)榭梢?jiàn)的白濁和不溶物，判定其不適合實(shí)際應(yīng)用。[實(shí)施例2]
在制造例ι中，將鋁塊加熱器的指示溫度設(shè)為4o°c、5o°c、6(rc、7(rc、8(rc、io(rc和 120°C中的任一條件，使加熱時(shí)間為10分鐘，在所制造的凝固蛋白原原料(150 μ L)中加入 50 μ L制造例4中得到的激活的凝固酶水溶液并使其作用，用旋渦混合器混合5秒鐘。將該樣品轉(zhuǎn)移至制造例3中制造的測(cè)定容器中，用激光散射顆粒測(cè)量裝置(ΡΑ-200)進(jìn)行凝集開(kāi)始時(shí)間的測(cè)定。表1中示出了各加熱溫度下的凝集開(kāi)始時(shí)間，其示出在任一加熱溫度下在從添加激活的凝固酶水溶液起3分鐘左右開(kāi)始聚集，凝固蛋白原的功能幾乎未受加熱的影響。另外，在120°C的高溫下處理時(shí)，LAL試劑中的大部分蛋白質(zhì)發(fā)生熱變性而凝固，但殘留在其中的凝固蛋白原本身保持功能，自添加激活的凝固酶水溶液起4分鐘左右開(kāi)始凝集。由此顯示凝固蛋白原對(duì)于加熱的耐性非常強(qiáng)。另外，由表1可知，在80°C以下對(duì)LAL試劑進(jìn)行加熱處理使酶活性失活時(shí)，LAL試劑中幾乎未見(jiàn)到白濁。因此可知，通過(guò)在80°C以下對(duì)LAL 試劑進(jìn)行加熱處理使酶活性失活，可以獲得適合光學(xué)測(cè)定的、利用價(jià)值更高的凝固蛋白原原料。[表 1]。
權(quán)利要求
1.凝固蛋白原原料的制造方法，所述凝固蛋白原原料在下述情況下使用使含有規(guī)定的酶組和凝固蛋白原的鱟的血細(xì)胞提取物L(fēng)AL與來(lái)自生物的規(guī)定的生理活性物質(zhì)反應(yīng)，通過(guò)所述生理活性物質(zhì)激活所述酶組，發(fā)生酶級(jí)聯(lián)，通過(guò)所述酶級(jí)聯(lián)將凝固蛋白原水解為凝固素，利用這一過(guò)程檢測(cè)所述生理活性物質(zhì)或測(cè)定所述生理活性物質(zhì)的濃度；所述凝固蛋白原原料的制造方法的特征在于將LAL以規(guī)定溫度加熱處理規(guī)定時(shí)間，從而使所述LAL中的所述酶組的至少一部分失活，同時(shí)保持凝固蛋白原的活性。
2.權(quán)利要求1的凝固蛋白原原料的制造方法，其特征在于所述LAL是以溶液的形式供給的，所述規(guī)定溫度為60°C以上。
3.權(quán)利要求1或2的凝固蛋白原原料的制造方法，其特征在于所述LAL是以溶液的形式供給的，所述規(guī)定溫度為80°C以下。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的凝固蛋白原原料的制造方法，其特征在于所述LAL是以溶液的形式供給的，所述規(guī)定時(shí)間為10分鐘以上且8小時(shí)以下。
5.權(quán)利要求1的凝固蛋白原原料的制造方法，其特征在于所述LAL是以冷凍干燥物的形式供給的，所述規(guī)定溫度為100°c以上且250°C以下。
6.權(quán)利要求1或5的凝固蛋白原原料的制造方法，其特征在于所述LAL是以冷凍干燥物的形式供給的，所述規(guī)定時(shí)間為300分鐘以上。
7.凝固蛋白原原料，所述凝固蛋白原原料在下述情況下使用使含有規(guī)定的酶組和凝固蛋白原的鱟的血細(xì)胞提取物L(fēng)AL與來(lái)自生物的規(guī)定的生理活性物質(zhì)反應(yīng)，通過(guò)所述生理活性物質(zhì)激活所述酶組，發(fā)生酶級(jí)聯(lián)，通過(guò)所述酶級(jí)聯(lián)將凝固蛋白原水解為凝固素，利用這一過(guò)程檢測(cè)所述生理活性物質(zhì)或測(cè)定所述生理活性物質(zhì)的濃度；所述凝固蛋白原原料的特征在于將LAL以規(guī)定溫度加熱處理規(guī)定時(shí)間，從而使所述LAL中的所述酶組的至少一部分失活。
8.權(quán)利要求7的凝固蛋白原原料，其特征在于所述LAL是以溶液的形式供給的，所述規(guī)定溫度為60°C以上。
9.權(quán)利要求7或8的凝固蛋白原原料，其特征在于所述LAL是以溶液的形式供給的， 所述規(guī)定溫度為80°C以下。
10.權(quán)利要求7-9中任一項(xiàng)的凝固蛋白原原料，其特征在于所述LAL是以溶液的形式供給的，所述規(guī)定時(shí)間為10分鐘以上且8小時(shí)以下。
11.權(quán)利要求7的凝固蛋白原原料，其特征在于所述LAL是以冷凍干燥物的形式供給的，所述規(guī)定溫度為100°C以上且250°C以下。
12.權(quán)利要求7或11的凝固蛋白原原料，其特征在于所述LAL是以冷凍干燥物的形式供給的，所述規(guī)定時(shí)間為300分鐘以上。
13.LAL試劑，所述試劑用于生理活性物質(zhì)的檢測(cè)或者生理活性物質(zhì)的濃度測(cè)定，其特征在于通過(guò)將權(quán)利要求7-12中任一項(xiàng)的凝固蛋白原原料與未經(jīng)加熱處理的LAL混合，使所述未經(jīng)加熱處理的LAL中的凝固蛋白原濃度提高。
14.用于測(cè)定內(nèi)毒素的結(jié)合凝固蛋白原的微珠，其特征在于使權(quán)利要求7-12中任一項(xiàng)的凝固蛋白原原料中的凝固蛋白原與比所述凝固蛋白原直徑大的多個(gè)微粒表面結(jié)合或吸附來(lái)制備。
15.來(lái)自生物的生理活性物質(zhì)的測(cè)定方法，其特征在于將權(quán)利要求13的LAL試劑和含有所述規(guī)定生理活性物質(zhì)的樣品混合，由此通過(guò)所述規(guī)定的生理活性物質(zhì)將所述LAL試劑中的酶組激活，發(fā)生酶級(jí)聯(lián)，通過(guò)所述酶級(jí)聯(lián)將濃度得到提高的所述凝固蛋白原水解為凝固素，利用這一過(guò)程檢測(cè)所述規(guī)定的生理活性物質(zhì)或者測(cè)定所述規(guī)定的生理活性物質(zhì)的濃度。
16.來(lái)自生物的生理活性物質(zhì)的測(cè)定方法，其特征在于將權(quán)利要求14的結(jié)合凝固蛋白原的微珠、未經(jīng)加熱處理的LAL和含有規(guī)定生理活性物質(zhì)的樣品混合，由此，通過(guò)所述規(guī)定的生理活性物質(zhì)將所述未經(jīng)加熱處理的LAL中的酶組激活，發(fā)生酶級(jí)聯(lián)，通過(guò)所述酶級(jí)聯(lián)將結(jié)合或吸附于所述微粒表面的凝固蛋白原水解為凝固素，所述微粒之間交聯(lián)，利用這一過(guò)程檢測(cè)所述規(guī)定的生理活性物質(zhì)或測(cè)定所述規(guī)定的生理活性物質(zhì)的濃度。
17.攪拌比濁測(cè)定裝置，其特征在于，所述裝置裝備有以下設(shè)備混合液保持設(shè)備，其使權(quán)利要求14的結(jié)合凝固蛋白原的微珠、未經(jīng)加熱處理的LAL和含有規(guī)定的生理活性物質(zhì)的樣品的混合液保持可以入射光，并使所述混合液中的反應(yīng)進(jìn)行；攪拌設(shè)備，其攪拌所述混合液保持設(shè)備中的所述混合液；光入射設(shè)備，其向所述混合液保持設(shè)備中的混合液入射光；受光設(shè)備，其接收所述入射光在所述混合液中的透射光，并將其轉(zhuǎn)換為電信號(hào)；導(dǎo)出設(shè)備，其通過(guò)從在所述受光設(shè)備中變換的電信號(hào)獲得的所述混合液的透射率而導(dǎo)出所述樣品中所述生理活性物質(zhì)的濃度。
全文摘要
本發(fā)明提供獲得保持LAL試劑、或者被來(lái)自生物的生理活性物質(zhì)污染的LAL試劑等中的凝固蛋白原的功能，同時(shí)使凝固酶活性不可逆地失活，并且可用于試劑的凝固蛋白原原料的技術(shù)。通過(guò)將LAL試劑在某些規(guī)定溫度下加熱處理規(guī)定時(shí)間，只使LAL試劑中的酶活性不可逆地失活。此時(shí)，凝固蛋白原本來(lái)的活性得以保持，即，通過(guò)激活的凝固酶水解形成凝固素，引發(fā)凝膠化、凝集反應(yīng)。
文檔編號(hào)C12M1/34GK102326082SQ201080008580
公開(kāi)日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2010年2月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月19日
發(fā)明者藪崎克己 申請(qǐng)人:興和株式會(huì)社