專(zhuān)利名稱(chēng)：免疫調(diào)節(jié)治療劑的制作方法
免疫調(diào)節(jié)治療劑本發(fā)明權(quán)利本發(fā)明在美國(guó)政府的支持下，以及國(guó)立衛(wèi)生研究院過(guò)敏與傳染病國(guó)家研究所授予的國(guó)立衛(wèi)生研究院N015435號(hào)合約的支持下完成，美國(guó)政府在本發(fā)明中擁有權(quán)利。相關(guān)申請(qǐng)的引用本申請(qǐng)要求2009年3月19日提出的，名為“免疫調(diào)節(jié)劑的治療活性”的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/158，526號(hào)的優(yōu)先權(quán)，其整體納入本文納入?yún)⒖肌?br> 背景技術(shù)：
1本發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及從生物體液(血液，血清，或分泌物)中分離出的成分，從天然來(lái)源中分離這些成分的方法，使用這些成分保持和增強(qiáng)人體正常功能的方法，包括施用治療有效量的天然或合成形式的分離成分的治療疾病和病癥的方法。2背景說(shuō)明在健康的多細(xì)胞生物體中，體內(nèi)平衡是通過(guò)嚴(yán)格控制的多種細(xì)胞功能上下調(diào)控的平衡來(lái)準(zhǔn)確保持。細(xì)胞水平體內(nèi)平衡的喪失會(huì)導(dǎo)致慢性疾病。這些細(xì)胞調(diào)節(jié)活動(dòng)也會(huì)引起細(xì)胞間的相互作用和系統(tǒng)間的相互作用。這些相互作用導(dǎo)致了機(jī)體每個(gè)器官內(nèi)細(xì)胞間的復(fù)雜關(guān)系以及每個(gè)這些器官/系統(tǒng)之間的相互作用。這些相互作用以多種通信形式，如細(xì)胞因子，酶，和循環(huán)細(xì)胞來(lái)發(fā)生。任何對(duì)身體的顯著損傷會(huì)引起一系列有深度免疫調(diào)節(jié)作用的肽的釋放。這些肽可能是廣泛描述過(guò)的細(xì)胞因子類(lèi)，(非抗體蛋白質(zhì)會(huì)作為對(duì)特定刺激的反應(yīng)釋放并作為細(xì)胞間的中介體)也可能作為酶來(lái)作用。在每種情況下，其都會(huì)激活將機(jī)體緩慢導(dǎo)向有一個(gè)或多個(gè)下列特征的反應(yīng)的通路1)有持久鎮(zhèn)痛反應(yīng)的疼痛和腫脹的快速降低；2)適應(yīng)性免疫反應(yīng)的刺激；3)分纖維蛋白沉積的分解和再吸收的延遲刺激；4)免疫系統(tǒng)監(jiān)視細(xì)胞(NK細(xì)胞，T殺傷淋巴細(xì)胞)的刺激；或5)機(jī)體的基線狀態(tài)轉(zhuǎn)移到抗炎狀態(tài)。雖然許多細(xì)胞因子已經(jīng)被鑒定且其在特定反應(yīng)中的功能也已被部分描述，已知的細(xì)胞調(diào)節(jié)的這方面知識(shí)還是有限的。如許多細(xì)胞因子相矛盾的確定活性所展示的，這是一個(gè)非常活躍的研究領(lǐng)域。完全解釋通過(guò)細(xì)胞因子進(jìn)行的復(fù)雜的細(xì)胞間通信還需要更多年的研究。外皮系統(tǒng)是在所有更高級(jí)生物形式中對(duì)抗病原體的最大單一防御。當(dāng)由于外皮系統(tǒng)中斷致使機(jī)體暴露于病原體，最容易受到其損害的時(shí)候，機(jī)體使用免疫系統(tǒng)的上調(diào)來(lái)保護(hù)其免遭潛在的感染過(guò)程。在細(xì)胞因子/免疫細(xì)胞級(jí)聯(lián)中，通過(guò)這些肽中發(fā)生的修飾類(lèi)型增強(qiáng)了機(jī)體對(duì)皮膚破損時(shí)可能發(fā)生的大量病理?yè)p害識(shí)別和反應(yīng)的能力，同時(shí)強(qiáng)烈抑制這種類(lèi)型的刺激經(jīng)常引起的炎癥。這包括免疫系統(tǒng)細(xì)胞的激活和細(xì)胞因子的釋放，細(xì)胞因子作為治療用能增強(qiáng)機(jī)體對(duì)包括急性和慢性細(xì)菌感染，急性和慢性病毒感染，寄生蟲(chóng)病，甚至腫瘤過(guò)程的其他病理?yè)p害識(shí)別和反應(yīng)的能力。雖然皮膚是感染的最重要障礙，先天免疫系統(tǒng)能夠?qū)ζつw破損引起的大量攻擊做出快速反應(yīng)。先天免疫系統(tǒng)能識(shí)別和消滅病原體和有害的外來(lái)分子并在腫瘤的監(jiān)視和抑制中有作用(Aufet al. ,2001 ；Bacha et al,2004 ； Gorelik et al.，1995 ；Wu and Pruett，1999)。除了刺激先天免疫系統(tǒng)，該反應(yīng)也通過(guò)纖維蛋白的再吸收促進(jìn)傷口和組織的愈合。這些沉積物是許多慢性病中的加重因素，導(dǎo)致許多愈合機(jī)制的失活并阻斷受損細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)支持。這種效應(yīng)可見(jiàn)于慢性傷口，多發(fā)性硬化的斑，阿爾茨海默癥的神經(jīng)纖維纏結(jié)，動(dòng)脈粥樣硬化的斑，自身免疫疾病的組織變化，和作為保護(hù)腫瘤對(duì)抗免疫系統(tǒng)的防護(hù)而圍繞癌細(xì)胞的纖維蛋白沉積。該反應(yīng)也促進(jìn)傷口愈合，免疫調(diào)節(jié)可通過(guò)刺激T殺傷淋巴細(xì)胞產(chǎn)生減少不適當(dāng)?shù)目贵w表達(dá)的效果。這些細(xì)胞找出并摧毀不適當(dāng)產(chǎn)生自身抗體的B細(xì)胞。通過(guò)消除自身抗體的產(chǎn)生，機(jī)體上的攻擊被終止，這些抗體產(chǎn)生的炎癥被消除，降低了癥狀以及自身免疫疾病通常最顯著的起因。這些肽也增強(qiáng)了機(jī)體識(shí)別并摧毀在其細(xì)胞壁上表達(dá)非正常蛋白的細(xì)胞的能力。由于所有腫瘤細(xì)胞均在其細(xì)胞膜上表達(dá)非正常蛋白，這些T殺傷淋巴細(xì)胞在識(shí)別和摧毀各種癌癥中非常重要。除了增加監(jiān)視之外，這些肽還有強(qiáng)抗炎活性。通過(guò)TH-2細(xì)胞因子的刺激，這些肽抑制在急性損傷中可能出現(xiàn)的炎癥反應(yīng)。此外，其對(duì)阻斷慢性疾病炎癥可能更有幫助。這樣的抗炎作用促進(jìn)了急性和慢性損傷的愈合。在慢性疾病過(guò)程中，血管外空間中的纖維蛋白沉積是許多疾病進(jìn)展不可或缺的部分。調(diào)動(dòng)這些纖維蛋白沉積并防止其沉積現(xiàn)在已經(jīng)成為治療的靶標(biāo)，但還沒(méi)有通過(guò)此機(jī)理作用的成功的治療劑被鑒定出來(lái)。防止對(duì)急性病理過(guò)程反應(yīng)發(fā)生而的纖維蛋白沉淀防止了這些急性疾病轉(zhuǎn)化為慢性疾病。纖維蛋白原是由六條肽鏈組成的二價(jià)體蛋白質(zhì)，兩組鏈每組Aa，Ββ和Y鏈各一。這些鏈通過(guò)二硫鍵在其氨基末端附近連接在一起，而留下其羧基末端暴露給凝血酶作用。作為對(duì)血管壁損傷的反應(yīng)，凝血酶被激活并切割纖維蛋白原產(chǎn)生纖維蛋白單體以及兩組肽每組纖維蛋白肽A和B各一。這些纖維蛋白單體隨后互相連接構(gòu)成了血凝塊形成的松散支架。釋放出的纖維蛋白肽特征已被描述，有一些物種依賴(lài)活性，但其之前并未被鑒定為免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)劑。其也具有快速降低血管通透性，以及激活內(nèi)膜和血管外空間纖維蛋白再吸收的延遲刺激的療效，這樣的療效之前未被鑒定或識(shí)別過(guò)。在身體任何系統(tǒng)中，產(chǎn)生體內(nèi)平衡改變的任何活性也會(huì)刺激相反的過(guò)程以允許逆轉(zhuǎn)這種變化。因此可以預(yù)期引起血管滲漏的過(guò)程也會(huì)導(dǎo)致修正該滲漏的過(guò)程。在纖維蛋白產(chǎn)生的情況下，這通過(guò)兩種機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn) 1)產(chǎn)生血塊封閉滲漏區(qū)域，和2)釋放降低血管整體滲透性的分子以防止這些分子移動(dòng)到不需要它們的區(qū)域而有害。此外，血管外空間和內(nèi)膜下空間中纖維蛋白的存在長(zhǎng)期看是有害的，但緊急情況下是必要的。纖維蛋白肽A產(chǎn)生這些纖維蛋白沉積的延遲再吸收以防止與其長(zhǎng)期存在相關(guān)的問(wèn)題。當(dāng)再吸收失敗時(shí)，會(huì)導(dǎo)致慢性疾病。這些肽的跨物種活性已知， 但這種種間活性的機(jī)制之前還未被解釋。盡管纖維蛋白肽B在物種和物種間幾乎沒(méi)有同源性，纖維蛋白肽A末端序列在大多數(shù)哺乳動(dòng)物里有顯著的同源性，這可能能解釋大多數(shù)這種跨物種活性。此外，C3的一部分從一種哺乳動(dòng)物到另一種也表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)耐葱浴?br> 6
在冠狀動(dòng)脈疾病中血管內(nèi)膜的纖維蛋白沉積以及許多其他疾病中血管外空間的纖維蛋白沉積導(dǎo)致這些疾病的進(jìn)展。增長(zhǎng)的纖維蛋白調(diào)節(jié)數(shù)據(jù)表明這樣的纖維蛋白沉積是許多疾病過(guò)程的主要部分。這不僅是有由于纖維蛋白組成的物理屏障引起的功能受損，也是由于這些空間里纖維蛋白的促炎活性。此外，這些空間里纖維蛋白的存在抑制了愈合所必需的一些細(xì)胞的活性。這方面的一個(gè)例子是血管外纖維蛋白阻止雪旺細(xì)胞再生活性的能力。過(guò)去幾年里研究人員已經(jīng)能證實(shí)許多此類(lèi)疾病過(guò)程中去除血管外纖維蛋白的療效。這些研究證明了纖維蛋白的促炎活性以及正常細(xì)胞/器官功能的損害。這種損害是許多疾病，包括但不限于多發(fā)性硬化癥，類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，周?chē)窠?jīng)擠壓傷，阿爾茨海默氏病，黃斑變性，慢性傷口與動(dòng)脈粥樣硬化病理過(guò)程的主要要素。在這些研究中血管外纖維蛋白是新療法的重要靶標(biāo)。過(guò)去的幾年Thl和Th2細(xì)胞因子在免疫/炎癥反應(yīng)研究中也成為了突出的重點(diǎn)。 最初，Th2被視為抗炎的而Thl被視為促炎的。這種概括沒(méi)有充分說(shuō)明這些炎癥譜對(duì)應(yīng)端之間錯(cuò)綜復(fù)雜的相互作用。另外，炎癥反應(yīng)也被定性為主動(dòng)和被動(dòng)類(lèi)型，并進(jìn)一步定為先天和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中的活性部分。這些劃分都沒(méi)有真實(shí)的說(shuō)明體內(nèi)所見(jiàn)的反應(yīng)，因?yàn)橄到y(tǒng)反應(yīng)幾乎總是包含了 Thl和Th2活性，先天和適應(yīng)，以及主動(dòng)和被動(dòng)的免疫/炎癥反應(yīng)的組
口 O這樣的組合活性也發(fā)生在機(jī)體對(duì)這些肽的反應(yīng)中。這些肽引起可以被視為刺激性或抑制性的細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)中的一系列活動(dòng)，但最終的結(jié)果是免疫系統(tǒng)刺激，從血管外空間里去除纖維蛋白的刺激，以及對(duì)炎癥的抑制。許多在血流中循環(huán)的蛋白和肽被確認(rèn)在人以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中對(duì)局部炎癥過(guò)程有影響。這些蛋白和肽包括多種細(xì)胞因子和趨化因子。這些物質(zhì)產(chǎn)生調(diào)節(jié)局部炎癥反應(yīng)程度的反饋回路。在多數(shù)慢性疾病中這種對(duì)炎癥反應(yīng)的控制是不夠的，使得局部炎癥導(dǎo)致健康組織的破壞。纖維蛋白肽A在多種疾病模型中有抗炎作用，因而減少了局部組織破壞并改善了疾病狀態(tài)。本發(fā)明描述了這些模型，證實(shí)了纖維蛋白肽A的抗炎效果。這種抗炎反應(yīng)作用的機(jī)理是被證實(shí)的纖維蛋白肽A的特定能力，通過(guò)特定抗炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生在細(xì)胞因子板上產(chǎn)生從主要是Thl反應(yīng)到主要是Th2反應(yīng)的轉(zhuǎn)變。除了這種細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)變之外， 纖維蛋白肽A有降低血管通透性的能力。這種血管通透性的降低有將血漿蛋白(如纖維蛋白)保持在血管內(nèi)，防止其在血管外空間促炎活性的效果。盡管纖維蛋白特別的被認(rèn)為是血管外空間的促炎分子，纖維蛋白肽A有能力大大減少纖維蛋白從血流中到血管外空間的遷移，并加速纖維蛋白從這些空間里的去除。這種抗炎活性(至少是防止促炎活性)在慢性炎癥疾病治療中有深遠(yuǎn)的意義。在1978年，Ruhenstroth-Bauer等證明了纖維蛋白肽A和B的抗炎活性。在他們的研究中，Ruhenstroth-Bauer和同事尋求理解對(duì)病理刺激反應(yīng)的炎癥的特定起因。他們首先證實(shí)了病理?yè)p傷后釋放的急性期蛋白的改變。他們隨后分離了這種改變產(chǎn)生的蛋白抗炎活性。美國(guó)專(zhuān)利4215109號(hào)描述了進(jìn)一步分離這種抗炎活性的過(guò)程，首先到纖維蛋白原，隨后進(jìn)一步測(cè)定確定的纖維蛋白肽A和B是這種生物抗炎反應(yīng)的來(lái)源，該反應(yīng)在幾乎所有病理過(guò)程中有有益效果。他們證實(shí)了角叉菜膠致大鼠足腫脹模型中的這種療效，證明了增加的腹腔內(nèi)注入的纖維蛋白原的療效，隨后將這種有益活性分離至纖維蛋白肽A和B。然而， 他們的研究沒(méi)有描述這種抗炎活性作用的機(jī)理或?qū)⑦@種活性分離到具體肽。他們也沒(méi)有使用他們的研究產(chǎn)生療法。這個(gè)相同的小組(Scherer等，1981)隨后證實(shí)了其他疾病模型中的這種抗炎效應(yīng)。證實(shí)了通過(guò)每日腹腔注射人纖維蛋白肽A和B，豚鼠和鼠中實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性腦脊髓炎 (EAE)過(guò)程的改善(一種多發(fā)性硬化癥(MS)的疾病模型)。相比對(duì)照組，這些注射在治療的動(dòng)物中產(chǎn)生了疾病狀態(tài)的顯著改善。疾病臨床神經(jīng)系統(tǒng)體征改善明顯，治療動(dòng)物中數(shù)量， 嚴(yán)重性和麻痹持續(xù)時(shí)間均減少。此外，與血漿蛋白外滲和神經(jīng)軟組織水腫相關(guān)的血管滲透性炎癥改變?cè)诶w維蛋白肽治療的動(dòng)物中顯著減少。最后，在這些動(dòng)物血清中觀察到循環(huán)免疫復(fù)合物顯著較高的滴度，證實(shí)了使用纖維蛋白肽A和B的治療沒(méi)有改變對(duì)抗原刺激的特定免疫反應(yīng)。他們因此得出結(jié)論，這種抗炎反應(yīng)不是以免疫抑制為代價(jià)的。沒(méi)有觀察到抗堿性蛋白和抗腦抗體產(chǎn)生的不同。在纖維蛋白肽治療動(dòng)物和生理鹽水治療對(duì)照間沒(méi)有顯示出EAE特征性的細(xì)胞浸潤(rùn)顯著的質(zhì)量或數(shù)量差異(Scherer等，1979)，但通常與這些發(fā)現(xiàn)共同出現(xiàn)的炎癥明顯減少。這些研究完成不久之后，Marusic等以各類(lèi)腹膜炎誘導(dǎo)證實(shí)了相同的發(fā)現(xiàn)。由于這些肽是輕度酸性的，Scherer等的研究可能被視為假陽(yáng)性，而且似乎沒(méi)有任何這個(gè)途徑進(jìn)一步的研究發(fā)表。纖維蛋白沉積在MS斑的發(fā)展中是一個(gè)重要的促進(jìn)因素(Adams等2004)， 而且這些沉積是作為滲漏血管的結(jié)果而形成。如上所述，Scherer等證明了通過(guò)纖維蛋白肽A和B的治療可以減輕血管滲漏。降低的血管通透性也略微降低了免疫復(fù)合物的遷移，并減緩了血管外空間纖維蛋白的沉積。此外，纖維蛋白有通過(guò)將雪旺細(xì)胞保持在非成髓鞘狀態(tài)來(lái)調(diào)節(jié)雪旺細(xì)胞分化的能力。纖維蛋白誘導(dǎo)ERK1/2磷酸化和雪旺細(xì)胞中維持其在非成髓鞘狀態(tài)的低親和力受體 P75NGF的產(chǎn)生，抑制纖維連接蛋白的產(chǎn)生，并阻止髓鞘蛋白的合成(Akassoglou等2002)。 在許多慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病中這樣的血管外空間纖維蛋白的持續(xù)存在關(guān)系到疾病過(guò)程的持續(xù)和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的進(jìn)展。這包括多發(fā)性硬化的斑，阿爾茨海默癥的神經(jīng)纖維纏結(jié)，帕金森氏病的基底神經(jīng)節(jié)病變，慢性炎性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病的周?chē)窠?jīng)病變，和許多其他疾病中的纖維蛋白存在。這些纖維蛋白沉積也是神經(jīng)系統(tǒng)以外的病理過(guò)程的重要部分。這由動(dòng)脈粥樣硬化心臟疾病，慢性傷口，高血壓，癌癥(產(chǎn)生癌細(xì)胞周?chē)恼系K)，黃斑變性，自身免疫性疾病，和許多其他疾病進(jìn)展中纖維蛋白的重要作用證實(shí)。也已觀察到抗變應(yīng)反應(yīng)/抗過(guò)敏反應(yīng)活性。Masuda等(2001)證實(shí)纖維蛋白肽A 片段(與本發(fā)明的目的相同的片段)將鼠抗體IgE脫糖基化。該脫糖基化的IgE不再有刺激從肥大細(xì)胞釋放組胺的能力，因此防止了過(guò)敏性/變應(yīng)反應(yīng)。然而該脫糖基化過(guò)程沒(méi)有影響IgE與抗原相互作用，與肥大細(xì)胞以及其他免疫細(xì)胞連接，或改變這些細(xì)胞執(zhí)行由IgE 抗原/抗體復(fù)合物結(jié)合到其膜受體上引起的所有其他正常活動(dòng)的能力的性能。他們進(jìn)一步證實(shí)了合成形式的肽序列也以相同的方式脫糖基化IgE。一旦這種脫糖基化發(fā)生，他們不再能誘導(dǎo)鼠全身過(guò)敏反應(yīng)(Masuda等2001)。然而，Masuda和同事沒(méi)能解釋脫糖基化機(jī)制。 他們也沒(méi)有評(píng)估脫糖基化的IgE在免疫系統(tǒng)反應(yīng)中可能具有的更多效應(yīng)。已確認(rèn)通過(guò)糖基化和脫糖基化的細(xì)胞因子系統(tǒng)性效應(yīng)修飾。這種IgE的脫糖基化可能是纖維蛋白肽A對(duì) IgE的直接效果，或者也可能是免疫調(diào)節(jié)的額外效果。這樣的脫糖基化以及隨后的組胺反應(yīng)缺乏可以部分解釋施用纖維蛋白肽A后觀察到的血管通透性降低。組胺反應(yīng)的缺乏可能導(dǎo)致?lián)p害時(shí)纖維蛋白沉積的減少。由于這種脫糖基化看起來(lái)不以其他方式抑制免疫系統(tǒng)，也不改變IgE結(jié)合抗原的能力，該有益影響并沒(méi)有帶來(lái)對(duì)機(jī)體免疫反應(yīng)的有害影響。相反，這種脫糖基化僅控制了引起過(guò)敏反應(yīng)的有害的獲得性亢進(jìn)。纖維蛋白肽A降低燒傷模型中損傷嚴(yán)重性的能力已經(jīng)被證實(shí)(WormsenUri.專(zhuān)利 10/790888)。在該專(zhuān)利中發(fā)現(xiàn)結(jié)合組蛋白肽的纖維蛋白肽A能防止熱或化學(xué)燒傷的傷害并加速已經(jīng)發(fā)生的燒傷的愈合。他們推測(cè)這種愈合的發(fā)生主要是由于抗炎作用。為證明這一點(diǎn)，他們預(yù)處理同種其他動(dòng)物的燒傷滲出液，隨后分離有這種療效的滲出液組分。他們發(fā)現(xiàn)僅含有纖維蛋白肽A的組分有在降低燒傷嚴(yán)重性中有極大的保護(hù)作用。他們沒(méi)有推測(cè)這種保護(hù)效果的作用機(jī)制。該工作暗示這種效果的機(jī)制是通過(guò)降低血管滲透性，降低的血管滲透性可防止血漿蛋白外滲引起的損害，包括溶酶體酶的釋放和超氧陰離子的產(chǎn)生。纖維蛋白肽B促進(jìn)成纖維細(xì)胞，單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞遷移到損傷區(qū)，而不刺激中性粒細(xì)胞中溶酶體酶的釋放和超氧陰離子產(chǎn)生的能力也證實(shí)了纖維蛋白肽B(也可能是 A)幫助傷口愈合的能力(Senior等，1986)。作為對(duì)纖維蛋白對(duì)中性粒細(xì)胞的化學(xué)誘導(dǎo)活性的反應(yīng)，這些物質(zhì)的釋放推測(cè)會(huì)導(dǎo)致多發(fā)性硬化癥中所見(jiàn)的脫髓鞘。此外，Gray等(1990) 證實(shí)了纖維蛋白原α和β鏈刺激成纖維細(xì)胞復(fù)制的能力，向含有纖維蛋白原的溶液中加入凝血酶顯著增強(qiáng)這種活性，這有力表明了這種活性與該切割相關(guān)。如發(fā)現(xiàn)這些肽幾十年后此領(lǐng)域后續(xù)信息和研究的缺乏所示，這些發(fā)現(xiàn)還不能被認(rèn)為足夠發(fā)展包含它們的治療方法。缺少正在進(jìn)行的研究部分是由于所有這些研究人員沒(méi)能認(rèn)識(shí)到這些肽的免疫調(diào)節(jié)和抗炎能力，能增強(qiáng)免疫系統(tǒng)并同時(shí)減少炎癥反應(yīng)。這種預(yù)防慢性感染中免疫調(diào)節(jié)，促成更加健康的Th2環(huán)境，刺激傷口愈合中國(guó)必需細(xì)胞的遷移，并同時(shí)防止減緩愈合和導(dǎo)致慢性傷口的損傷機(jī)制。新血管的生長(zhǎng)是一個(gè)包括多種不同類(lèi)型細(xì)胞的復(fù)雜多因素過(guò)程。當(dāng)血管損傷中斷血流時(shí)，愈合過(guò)程需要血流恢復(fù)到正在愈合的細(xì)胞。該過(guò)程以受損細(xì)胞的以及與成纖維細(xì)胞遷移相結(jié)合填補(bǔ)損傷缺陷的血栓的降解和吸收開(kāi)始。隨后血管細(xì)胞分化形成能最終成熟成血管的小管。血管生成是傷口愈合必不可少的正常生理過(guò)程。纖維蛋白在實(shí)體瘤中圍繞滲漏血管積累(Brown等，1998)。纖維蛋白也被證明在宿主-腫瘤交界處聚合形成纖維蛋白網(wǎng)，其可以通過(guò)支持內(nèi)皮細(xì)胞的粘連，遷移，增殖和分化來(lái)促進(jìn)腫瘤血管生成(Bootle-Wilbraham等，2001)。隨著纖維蛋白網(wǎng)增厚，對(duì)血管生成的促進(jìn)消失，纖維蛋白網(wǎng)成為這些內(nèi)皮細(xì)胞粘連，遷移，增殖和分化的障礙。這種障礙也防止了免疫細(xì)胞識(shí)別和消滅腫瘤細(xì)胞。通過(guò)僅使用活化的纖維蛋白肽A和B片段，產(chǎn)生的細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)有這些有益的血管生成活性，而沒(méi)有“保護(hù)”腫瘤細(xì)胞免受免疫系統(tǒng)攻擊。這種效果可部分通過(guò)白介素IB的現(xiàn)有數(shù)據(jù)外推以及其對(duì)炎癥和免疫細(xì)胞的效果來(lái)解釋。傷口床上細(xì)胞的遷移和分化受到細(xì)胞因子和特定其他免疫細(xì)胞(巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)存在的很大影響。IL-IB促進(jìn)這些細(xì)胞遷入傷口床，從而產(chǎn)生更有助于血管生成的環(huán)境。此外，作為對(duì)激活的纖維蛋白肽A片段和纖維蛋白肽A在炎癥級(jí)聯(lián)中的其他直接效應(yīng)的反應(yīng)，IL-10 的升高提供了更強(qiáng)的淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，和單核細(xì)胞遷入這些區(qū)域的能力，其中不釋放溶酶體酶但仍然有攻擊細(xì)胞和其他外來(lái)物的能力。纖維蛋白在血管壁中的沉積在許多血管系統(tǒng)疾病中發(fā)生。纖維蛋白肽A調(diào)動(dòng)這些纖維蛋白沉積以及防止進(jìn)一步沉積的能力在各種血管疾病中有著深遠(yuǎn)的意義。這些包括， 但不限于，冠狀動(dòng)脈疾病，黃斑變性，跛行，與動(dòng)脈粥樣硬化的改善。在許多其他疾病中該過(guò)
9程促進(jìn)了血流，在多數(shù)慢性疾病中改善了結(jié)果。當(dāng)對(duì)任何組織的傷害發(fā)生時(shí)，這些纖維蛋白沉積的吸收創(chuàng)造了更有助于血管生成過(guò)程的環(huán)境。這在糖尿病足潰瘍得到最好的證明，其中在大脈管和微脈管中的慢性纖維蛋白沉積極大的阻礙血液流動(dòng)，而且由于患處缺乏血液流通阻礙了組織愈合。之前的研究沒(méi)有記載纖維蛋白肽A刺激血管生成以及由此生成健康血管環(huán)境的能力。事實(shí)上，Staton等(美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布號(hào)20040039157)證實(shí)了纖溶酶切割產(chǎn)生的一個(gè)纖維蛋白肽A片段竟然有相當(dāng)突出的抗血管生成活性。Thompson等(1992)也將纖維蛋白原血管生成活性分離到片段E，其是纖溶酶釋放的中央結(jié)處的纖維蛋白原部分，但沒(méi)能確認(rèn)纖維蛋白肽A的潛在治療效果，由于凝血酶最初被用于溶液中以分解纖維蛋白原，其應(yīng)該是已經(jīng)存在于被證明有治療活性的溶液中的副產(chǎn)品。之前發(fā)表的研究沒(méi)有確認(rèn)纖維蛋白肽A和/或B為抗病毒素或抗生素。觀察到使用纖維蛋白肽A治療后再給予Ponto Toro病毒的小鼠存活率增加。使用了兩種不同形式的纖維蛋白肽A :1)過(guò)濾的山羊血清血清組分，計(jì)算含有約3mg纖維蛋白肽A(也包含山羊纖維蛋白肽B以及補(bǔ)體C3片段)，和2)合成的纖維蛋白肽A。然而這些物質(zhì)沒(méi)有直接抗病毒作用(預(yù)期的結(jié)果)，但結(jié)果確實(shí)證明與安慰劑組相比，治療過(guò)的動(dòng)物存活改善(見(jiàn)圖1)。 在該研究中分析了幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。這包括肝，脾，和血清病毒滴度；血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的測(cè)定；在感染后第3天對(duì)肝和肺肝性黃疸評(píng)分；每日體重測(cè)量；至死亡的平均天數(shù)；和總生存率。使用包含纖維蛋白肽A的測(cè)試物治療的兩組表現(xiàn)相同。在這些治療組中60%的鼠生存，而在安慰劑組中僅有25%存活。這樣的改善對(duì)每個(gè)獨(dú)立纖維蛋白肽A組在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著(P值=0. 03)，當(dāng)這些組合并起來(lái)計(jì)算使用纖維蛋白肽A的總改善時(shí)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性也改善了(P值=0.015)。盡管評(píng)價(jià)的任何其他疾病標(biāo)準(zhǔn)沒(méi)有可觀察到的不同，存活率仍然增加，表明了病毒引起疾病的能力沒(méi)有改變，而機(jī)體在一劑纖維蛋白肽A后對(duì)抗威脅生命感染的能力增強(qiáng)。在該研究中沒(méi)有進(jìn)行炎癥或纖維蛋白沉積測(cè)定。纖維蛋白肽A和利巴韋林對(duì)照間存在差異，該差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不顯著(P值=0.08)。這些結(jié)果表明了纖維蛋白肽A在傳染病領(lǐng)域潛在的治療價(jià)值，其有增強(qiáng)愈合并減少癥狀持續(xù)時(shí)間的能力。由于身體對(duì)傳染病的常規(guī)反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致非常促炎的狀態(tài)，甚至在感染治愈后這種狀態(tài)經(jīng)常引起持續(xù)的癥狀。纖維蛋白肽A有減輕這些癥狀并由此縮短疾病癥狀期的能力，而且不阻礙身體對(duì)抗感染的能力。這種效果也可能是由于纖維蛋白肽A將蛋白調(diào)動(dòng)出血管外空間的能力?？紤]到細(xì)胞因子板的轉(zhuǎn)變延遲，并基于這種可驗(yàn)證的轉(zhuǎn)變的預(yù)期效果，纖維蛋白肽A產(chǎn)生的增強(qiáng)免疫效果對(duì)在獲得性免疫反應(yīng)上有比對(duì)先天免疫反應(yīng)強(qiáng)的多。這種差異解釋了在疾病所有其他指標(biāo)都缺少改善的情況下，生存率仍然有很大提高。進(jìn)行第二項(xiàng)研究以測(cè)試這些物質(zhì)對(duì)抗甲型流感Hmi。在該研究中對(duì)照是低劑量的利巴韋林。每組中所有鼠均死亡，表明感染比預(yù)期更嚴(yán)重。這再次證明了缺乏時(shí)間以發(fā)展出將被纖維蛋白肽A的存在所增強(qiáng)的真正適應(yīng)性反應(yīng)。本發(fā)明肽在治療腫瘤疾病中的抗腫瘤活性是由于三種不同的作用機(jī)制1)增強(qiáng)免疫系統(tǒng)監(jiān)控以消除腫瘤細(xì)胞，2)防止或消除癌細(xì)胞周?chē)睦w維蛋白沉積，3)減輕腫瘤細(xì)胞團(tuán)周?chē)哪[脹和這些腫脹引起的癥狀。首先通過(guò)IL-IB的活性，免疫系統(tǒng)T-殺傷淋巴細(xì)胞，NK淋巴細(xì)胞，和B細(xì)胞的產(chǎn)生增加。這樣的分化使得機(jī)體能基于癌細(xì)胞細(xì)胞膜上異常蛋白質(zhì)顯現(xiàn)發(fā)現(xiàn)并摧毀癌細(xì)胞。 這些肽因此具有治療甚至對(duì)化療反應(yīng)差得的癌癥的能力。而這種作用機(jī)制需要時(shí)間攻擊并除去已經(jīng)擴(kuò)散的癌癥，這種類(lèi)型的刺激也可以防止癌癥不斷發(fā)展。增加的血漿纖維蛋白原水平或惡性腫瘤細(xì)胞纖維蛋白原分泌引起纖維蛋白原或纖維蛋白沉積進(jìn)惡性腫瘤組織細(xì)胞外基質(zhì)，這些因素作為細(xì)胞外基質(zhì)的一部分有促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的增殖，侵襲和轉(zhuǎn)移的效果(Rybarczyk等，2000年)。因而這些肽防止纖維蛋白遷入圍繞腫瘤細(xì)胞的基質(zhì)的能力有消除癌細(xì)胞對(duì)宿主免疫系統(tǒng)防護(hù)的效果，并幫助宿主識(shí)別和消除癌細(xì)胞。除此效果之外，這些肽對(duì)宿主免疫系統(tǒng)的刺激增強(qiáng)了免疫系統(tǒng)摧毀這些細(xì)胞的能力。因?yàn)樵S多這些癥狀是由于轉(zhuǎn)移引起的炎癥，上述抗炎活性降低了轉(zhuǎn)移癌的癥狀。 此外，化療引起的癥狀通常部分是由于這些藥物以及這些藥物引起的細(xì)胞損毀的炎癥效應(yīng)。從上面的描述可見(jiàn)，這些肽有治療自身免疫疾病的能力，通過(guò)1)降低對(duì)自身免疫抗體攻擊的炎癥反應(yīng)，2)降低導(dǎo)致自身免疫疾病病理進(jìn)展的纖維蛋白沉積，幻通過(guò)產(chǎn)生能尋找并摧毀產(chǎn)生自身抗體細(xì)胞的T-殺傷淋巴細(xì)胞來(lái)摧毀產(chǎn)生自身抗體的B細(xì)胞。執(zhí)行監(jiān)視功能的能力缺失對(duì)自身免疫疾病的進(jìn)展負(fù)有最終責(zé)任。這些肽有能力恢復(fù)這種功能。當(dāng) IL-I β與某些疾病的破壞過(guò)程進(jìn)展有關(guān)時(shí)，這種低水平刺激似乎沒(méi)有這些效果或IL-10 刺激的存在調(diào)停/防止了這些效果。Buckheit (W0/2006/116381)證明了使用癌細(xì)胞裂解物處理過(guò)得山羊血清組分對(duì)特定癌癥有抗腫瘤活性。這最初被認(rèn)為對(duì)山羊抗體的形成是次要的，他們隨后證實(shí)了沒(méi)有大蛋白(包括免疫球蛋白)的這些動(dòng)物的血清組分仍然有抗腫瘤活性。他們也證明了用一種類(lèi)型癌細(xì)胞裂解物預(yù)處理的山羊血清組分有能力治療其他類(lèi)型的癌癥。他們推測(cè)這種效應(yīng)與抗體片段相關(guān)。免疫或接種包括將患者暴露于滅活的致病抗原以刺激對(duì)特定病原體的免疫反應(yīng)。 這種主動(dòng)免疫類(lèi)型通常提供對(duì)特定疾病長(zhǎng)時(shí)間的防護(hù)。建立對(duì)幾種常見(jiàn)病毒的主動(dòng)免疫的進(jìn)一步嘗試已被證明是徒勞的，這引起了對(duì)使用被動(dòng)免疫治療這些疾病的研究。這類(lèi)治療使用一個(gè)或多個(gè)患者或動(dòng)物產(chǎn)生的中和抗體來(lái)治療其他患者或動(dòng)物的感染。從歷史上看， 已經(jīng)使用被動(dòng)免疫治療多種疾病。幾十年來(lái)，免疫受損的病人被給予混合的IgG以增強(qiáng)其免疫力。隨著在我國(guó)人口中出生血液感染的幾率和單克隆抗體生產(chǎn)能力的增加，這種療法在一般輕度免疫系統(tǒng)功能障礙的治療中已經(jīng)不再流行?；旌峡贵w制備物現(xiàn)在只能被偶爾用于在暴露增加時(shí)刺激免疫系統(tǒng)，以及阻止自身免疫疾病的攻擊。盡管存在這些因素，被動(dòng)免疫作為一種可能的對(duì)特定病毒或細(xì)菌感染的療法還是受到關(guān)注。然而，來(lái)自個(gè)體或動(dòng)物的帶有確定的免疫力的血清也可能包含病毒或細(xì)菌，因此，轉(zhuǎn)輸血清也可能導(dǎo)致感染。在努力開(kāi)發(fā)對(duì)特定疾病的新抗病毒和抗生素藥物中，評(píng)估了這種超免疫血清對(duì)受這些疾病折磨的人的治療潛力。這些方法有超敏性反應(yīng)的發(fā)生和額外感染潛在風(fēng)險(xiǎn)的明顯困難，但其有可證明的效力。這種類(lèi)型的治療最簡(jiǎn)單的形式是簡(jiǎn)單的將宿主動(dòng)物暴露給特定病原體隨后從動(dòng)物中提取血液并將含有抗體的血清組分注射給病人。Karpas (美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，863，730)使用含有高滴度的獲自HIV陽(yáng)性患者血漿的異源人中和抗體來(lái)治療艾滋病。盡管該方法被證明能有效降低病毒血癥并延遲AIDS發(fā)病，臨床應(yīng)用和大規(guī)模生產(chǎn)異常困難。Davis (W097/02839, W001/60156,02/07760, US2002/006022)使用一種方法治療 HIV感染的患者，包括以病毒裂解液(HIV)或細(xì)菌裂解液(金黃色葡萄球菌，鏈球菌，大腸桿菌)接種山羊和注射獲自這些超免疫山羊的血清。他的方法以及使用這種方法治療HIV以及其他感染的成功已經(jīng)被廣泛宣傳(Washington Post, April 9,2000 ；Dateline Houston television broadcast, Sept 18，1998 ；等)。在他的方法中，他使用包括硫酸銨沉淀以及隨后的使血液最初凝固后的過(guò)濾過(guò)程(透析或凝膠過(guò)濾)的標(biāo)準(zhǔn)提取和純化方法。Gelder 和同事(美國(guó)專(zhuān)利 #6043347，6258599，63；35017，和 6670181)也開(kāi)發(fā)了一種方法，使用超免疫山羊生產(chǎn)假設(shè)能識(shí)別特定病毒表位的中和抗體。他們使用不能在人中激發(fā)中和抗體產(chǎn)生但山羊可做適當(dāng)反應(yīng)的的抗原。Gelder將Davis描述的過(guò)程復(fù)雜化，將 HIV-mN和HIV-2NZ中純化的蛋白注入山羊，隨后使用已知包含高度保守的HIV表位區(qū)域的合成肽增強(qiáng)免疫力。這種方法形成了目前HIV治療臨床試驗(yàn)中的藥物(HRG214)的生產(chǎn)。 制造商還聲稱(chēng)從暴露于一種病毒的動(dòng)物通過(guò)其過(guò)程制備的其血清制品對(duì)治療其他類(lèi)型病毒疾病有益(見(jiàn)Vironyx網(wǎng)站)。此外，去除血清中的大蛋白(包括去除所有完整抗體)沒(méi)有消除療效但確實(shí)增強(qiáng)了制品的安全性。據(jù)推測(cè)，這種療效源于剩余的血清組分中抗體片段的存在(特別是Fab片段)。伴隨該研究的信息中，說(shuō)明了最好去除所有大小大于30kD的蛋白，基本上消除所有來(lái)自山羊治療的抗體和片段。Dalgleish(W003/004049, W003/064472)認(rèn)識(shí)到一部分這些配方中的活性不能完全由中和抗體的活性解釋。因此他推測(cè)這些制品的抗炎活性可能依賴(lài)于抗-HLA和/或抗-FAS抗體。他證實(shí)了這些抗體有抗炎效果，防止類(lèi)似正常人HLA的病毒表位對(duì)免疫系統(tǒng)的過(guò)度刺激。Dalglish和同事證明了用抗-HLA和/或抗-FAS抗體富集的血清組分在有不適當(dāng)?shù)母逪LA水平的，如慢性感染(病毒和細(xì)菌的)，局部癌癥(指定肺，胰，肝，腸，淋巴結(jié)和皮膚癌)，廣泛的多種疾病治療中，以及有高HLA水平的其他疾病如糖尿病和多發(fā)性硬化癥的治療中很有用。在他的研究中，Dalglish和同事沒(méi)有使用超免疫山羊(在血液移出前沒(méi)有用抗原處理山羊)。Tolett (W0 04/033665)，也描述了異種血清混合物治療HIV的療效，使用經(jīng)過(guò)濾而在未經(jīng)別的純化的HIV-暴露動(dòng)物的血清或血漿。血清或血漿混合物是來(lái)自多種動(dòng)物的，未經(jīng)過(guò)任何純化過(guò)程的簡(jiǎn)單的未處理的血清混合物。Ansley (美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，219，578)使用同樣的制備過(guò)程來(lái)制備IgG血清組分，盡管在該專(zhuān)利中，事先沒(méi)有進(jìn)行對(duì)山羊免疫系統(tǒng)的刺激。這些未經(jīng)病原體處理的山羊的血清被移出并處理，隨后使用來(lái)預(yù)防和治療多種獸類(lèi)疾病。這些疾病包括多種機(jī)會(huì)性生物體引起的馬下呼吸道疾病(ELRD)，不同B血清型結(jié)節(jié)根霉引起的綿羊和羔羊羊腳腐病，和牛呼吸系統(tǒng)疾病。Ansley證明了未經(jīng)免疫的綿羊的血清在被治療的動(dòng)物中誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)非特定性激活，引起顯著的療效。Hamm等證明了山羊血清組分治療馬下呼吸道感染的能力。Thacker (美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7358044)證明了包含低分子量肽的血清組分可以被用于刺激免疫系統(tǒng)，極大的改善使用多種病原體致死性激發(fā)的動(dòng)物的存活率。在該研究中，未經(jīng)病原體處理的動(dòng)物的血清被用于藥物制備。該專(zhuān)利也引用了研究，其中山羊血清的一個(gè)組分，
12基本上不含免疫球蛋白，當(dāng)細(xì)菌激發(fā)前M小時(shí)施用該山羊血清組分時(shí)能給予使用致死劑量多殺性巴氏桿菌激發(fā)的雞顯著的保護(hù)。類(lèi)似的結(jié)果可以在給予鼠傷寒沙門(mén)氏菌致死激發(fā)的鼠中獲得。Bucldieit (美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)2006/(^9216 證明了來(lái)自接種病毒，細(xì)菌或癌細(xì)胞裂解液的動(dòng)物的血清或血漿具有治療裂解液制備來(lái)源的疾病的能力。這種療效在基本不含所有抗體和大蛋白的血清組分中最大。除了這些證明血清組分療效的研究之外，探索中和單克隆抗體用途的多個(gè)研究已經(jīng)完成。這些研究的結(jié)果已證明令人失望(見(jiàn)例如Burton D R et al. Science (1994) 266 1024-1027 ；Trkola A. et al. J. Virol. (1996)70 :1100-1108 ；Conley A J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1994) 91 :3348-3352 ；)。盡管這些抗體在體外似乎有顯著的療效，而在體內(nèi)沒(méi)能證實(shí)有清楚的療效Miehm 1995)。大體上，異源抗體混合物(從天然血清中生產(chǎn)，因而含有本發(fā)明的活性肽)似乎比單克隆抗體明顯更有效，再次表明了對(duì)單獨(dú)抗體的替代作用機(jī)制。這些混合物在疾病預(yù)防中比在疾病的治療中也感覺(jué)更有效(Montefiori， 2001)。發(fā)明簡(jiǎn)述如本發(fā)明實(shí)施和廣泛描述的，本發(fā)明涉及藥物組合物，這些組合物的膳食補(bǔ)充劑， 以及制備在多種環(huán)境中調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)并增強(qiáng)免疫反應(yīng)的，來(lái)自動(dòng)物血液的哺乳動(dòng)物血清生物活性組分和從此分離和制造肽的方法。此外，本發(fā)明包括這些肽的合成形式，而且本發(fā)明包括增強(qiáng)這些治療和預(yù)防效果的這些肽的衍生物和修飾物。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式涉及包含肽的制劑，肽含有在SEQ ID Nos. 1-5,7-9, 11-13，15，16，和20-22中識(shí)別出的序列，纖維蛋白肽A的序列，在產(chǎn)生纖維蛋白肽A的哺乳動(dòng)物種類(lèi)間基本同源的纖維蛋白肽A區(qū)域的序列，補(bǔ)體C3的序列，以及任何也含有一個(gè)或多個(gè)保守的氨基酸取代的前述序列，其中制劑基本上沒(méi)有包含可檢測(cè)的纖維蛋白肽B。優(yōu)選的，制劑進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的載體如，例如水，油，食用油，脂肪酸，脂類(lèi)，多糖類(lèi)，纖維素，甘油，乙二醇，及其組合。優(yōu)選的食用油包括，例如檸檬油，薄荷油，或葡萄籽油。優(yōu)選的制劑被制成口服，經(jīng)粘膜，非腸道，淋巴，或靜脈施用以使生物活性形式的制劑以生理有效濃度被釋放到患者系統(tǒng)中。也優(yōu)選是膳食補(bǔ)充劑的制劑和從生物來(lái)源純化或合成制造的制劑。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式涉及含有纖維蛋白肽A或其片段，以及藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物，其中纖維蛋白肽A或其片段為治療有效量，優(yōu)選的，治療有效量是從 0. Img至500mg。也優(yōu)選組合物其中治療有效濃度防止沉積并刺激患者血管外空間，如與冠狀動(dòng)脈疾病相關(guān)的，和血管內(nèi)膜下空間內(nèi)纖維蛋白的再吸收。優(yōu)選組合物在治療有效濃度是無(wú)毒的并基本不含可檢測(cè)的纖維蛋白肽B。組合物可以包含源自人或非人，但優(yōu)選哺乳動(dòng)物纖維蛋白肽A序列的纖維蛋白肽A或其片段。表達(dá)非人纖維蛋白肽A序列的哺乳動(dòng)物包括馬，貓，犬，牛，山羊，綿羊，和鼠。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式涉及治療或預(yù)防患者疾病的方法，包括提供包含纖維蛋白肽A或其片段，以及藥學(xué)上可接受的載體，而不含纖維蛋白肽B的組合物，其中纖維蛋白肽A或其片段來(lái)自非人的哺乳動(dòng)物；以及對(duì)患者施用一定劑量組合物，其中施用是經(jīng)粘膜的以使纖維蛋白肽A或其片段施用5分鐘內(nèi)在患者淋巴系統(tǒng)中達(dá)到治療有效水平。優(yōu)選患者是人，也優(yōu)選疾病是血管炎癥或冠狀動(dòng)脈疾病。優(yōu)選單劑組合物含有從0. Img至IOmg 的活性成分，和優(yōu)選的施用包括初始施用以及隨后的，口服和經(jīng)粘膜的，持續(xù)施用，而持續(xù)的施用至少7天不重復(fù)。優(yōu)選纖維蛋白肽A或其片段刺激患者細(xì)胞釋放細(xì)胞因子ILl β， IL-10，而非IL-1，IL-4或TNFa。另一個(gè)優(yōu)選的方面是患者纖維蛋白肽B的活性被抑制， 如，例如，通過(guò)施用纖維蛋白肽B結(jié)合劑。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式涉及防止纖維蛋白沉積并吸收患者血管內(nèi)沉積的纖維蛋白的方法，包括提供包括纖維蛋白肽A或其片段和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物；以及對(duì)患者施用組合物以使纖維蛋白肽A或其片段在患者淋巴系統(tǒng)中達(dá)到治療有效水平。優(yōu)選患者是人以及纖維蛋白肽A或其片段來(lái)自非人的哺乳動(dòng)物纖維蛋白肽A序列。組合物的使用優(yōu)選通過(guò)經(jīng)粘膜施用直接進(jìn)入淋巴系統(tǒng)，以及包括初始施用以及隨后持續(xù)的施用，而持續(xù)的施用不超過(guò)一周一次。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式涉及哺乳動(dòng)物血清組分，其中組分包含多種成分，澄清無(wú)顆粒，基本所有成分分子量在約1200道爾頓至約1700道爾頓范圍內(nèi)。優(yōu)選哺乳動(dòng)物是馬， 貓，犬，牛，山羊，綿羊，和鼠。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式涉及包含肽的制劑，肽含有選自由SEQ ID Nos. 6，10，14， 和17-19，纖維蛋白肽B的序列，在產(chǎn)生纖維蛋白肽B的哺乳動(dòng)物種類(lèi)間基本同源的纖維蛋白肽B區(qū)域的序列組成的組，其中制劑基本上沒(méi)有包含可檢測(cè)的纖維蛋白肽A。優(yōu)選制劑進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的載體如，例如水，油，食用油，脂肪酸，脂類(lèi)，多糖類(lèi)，纖維素，甘油， 乙二醇，及其組合。優(yōu)選的食用油包括，例如檸檬油，薄荷油，或葡萄籽油。優(yōu)選的制劑被制成口服，經(jīng)粘膜，非腸道，淋巴，或靜脈施用以致生物活性形式的制劑以生理有效濃度被釋放到患者系統(tǒng)中。也優(yōu)選是膳食補(bǔ)充劑的制劑和從生物來(lái)源純化或合成制造的制劑。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式涉及治療或預(yù)防患者疾病的方法，包括提供包含纖維蛋白肽B或其片段，以及藥學(xué)上可接受的載體的組合物，其中組合物基本不含能檢測(cè)的纖維蛋白肽A，其中纖維蛋白肽B或其片段來(lái)自非人的哺乳動(dòng)物；以及對(duì)患者施用一定劑量組合物，其中施用是經(jīng)粘膜的以使纖維蛋白肽B或其片段施用5分鐘內(nèi)在患者淋巴系統(tǒng)中達(dá)到治療有效水平。優(yōu)選患者是人，疾病是自身免疫性疾病，如，例如，關(guān)節(jié)炎，克羅恩病，乳糜瀉，I型糖尿病，格雷夫癥，特發(fā)性血小板減少性紫癜，銀屑病，硬皮病，系統(tǒng)性紅斑狼瘡， 或潰瘍性結(jié)腸炎，或疾病是免疫調(diào)節(jié)疾病如，例如，過(guò)于活躍的免疫系統(tǒng)。優(yōu)選單劑含有從 0. Img至IOmg的活性成分。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式涉及哺乳動(dòng)物血清組分，其中組分包含多種成分，澄清無(wú)顆粒，基本所有成分分子量在約800道爾頓至約2300道爾頓范圍內(nèi)。優(yōu)選的，哺乳動(dòng)物選自馬，貓，犬，牛，山羊，綿羊，和鼠組成的組。本發(fā)明的其他實(shí)施方式和優(yōu)勢(shì)部分在隨后的詳述中展示，部分可在詳述中顯而易見(jiàn)，或可從本發(fā)明的實(shí)施中學(xué)得。


圖1天然或合成形式的纖維蛋白肽對(duì)受到Ponto Toro病毒感染的鼠存活的影響。 有活性的血清組分包含山羊纖維蛋白肽A和B以及補(bǔ)體C3片段。圖2聚乙二醇化和非聚乙二醇化的合成纖維蛋白肽A在急性實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性腦脊髓煙鼠模型中的效果。圖3本發(fā)明牛血清組分實(shí)施方案的HPLC解讀。21. 73和22. 84處的峰被鑒定為 SERIM A ；22. 59 和 23. 28 處的峰為 SERIM B ；20. 13 處的小峰為 SERIM C。圖4本發(fā)明馬血清組分實(shí)施方案的HPLC解讀。21. 32和18. 30處的峰被鑒定為 SERIM A ；14. 56 和 23. 53 處的峰為 SERIM B ； 11. 62 和 11. 84 處的峰為 SERIM C。圖5本發(fā)明山羊血清組分實(shí)施方案的HPLC解讀。馬血清組分包含最高相對(duì)量的馬SERIM A(峰在17. 86)。在這個(gè)樣品中沒(méi)有鑒定出其他肽，但檢索蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)顯示沒(méi)有另外兩種馬數(shù)據(jù)庫(kù)中的SERIMs的序列信息。圖6本發(fā)明人血清組分實(shí)施方案的HPLC解讀?？梢钥闯?，人樣品包含比動(dòng)物樣品更多的肽。然而，樣品仍然與多數(shù)肽質(zhì)量有關(guān)系。29. 46和20. 96處的峰都對(duì)應(yīng)肽A。25. 27 和30. 41處的峰對(duì)應(yīng)肽B，19. 16處的峰對(duì)應(yīng)肽C。發(fā)明詳述人體在嚴(yán)重外傷后有驚人的愈合能力?？紤]受?chē)?yán)重外傷的人和受輕傷害的人對(duì)傷害反應(yīng)的不同，有三點(diǎn)差異突出1)受?chē)?yán)重外傷的人免疫系統(tǒng)反應(yīng)顯著增強(qiáng)；2)經(jīng)歷嚴(yán)重外傷的人在傷害的早期有相對(duì)最小化的腫脹；3)與受更輕傷害的人相比，嚴(yán)重外傷產(chǎn)生麻木效應(yīng)，減輕嚴(yán)重外傷患者感受的疼痛。醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)和當(dāng)今的醫(yī)療模式將這些發(fā)現(xiàn)歸因于“應(yīng)激反應(yīng)”，內(nèi)源性?xún)?nèi)啡肽的釋放是這種反應(yīng)的一部分。已經(jīng)驚人的發(fā)現(xiàn)在這些類(lèi)型的傷害中釋放的一組肽是許多應(yīng)激反應(yīng)益處的原因。當(dāng)在慢性疾病中使用這些肽時(shí)該反應(yīng)對(duì)患者有很大的益處。本發(fā)明確定了多種肽的細(xì)胞因子活力，其中一些分子之前被確認(rèn)但還沒(méi)有說(shuō)明細(xì)胞因子活性。此外，本發(fā)明描述的特定分子之前沒(méi)有被確認(rèn)為生物活性物質(zhì)。盡管特定肽的序列可能被確認(rèn)，這些肽的切割和生物活性肽的釋放之前沒(méi)有被描述過(guò)。這些肽歸為兩類(lèi) 1)作為凝血級(jí)聯(lián)的一部分釋放的肽，和2)作為補(bǔ)體系統(tǒng)的一部分釋放的肽。許多作為凝血級(jí)聯(lián)的一部分釋放的肽已經(jīng)被確定，細(xì)胞因子作用機(jī)制之前沒(méi)有被描述或識(shí)別。補(bǔ)體系統(tǒng)的肽之前沒(méi)有被描述為母蛋白裂解物，而且他們的細(xì)胞因子活性之前也沒(méi)有被描述過(guò)。本發(fā)明詳述公開(kāi)了這些肽作為對(duì)外皮破損的反應(yīng)釋放。多數(shù)嚴(yán)重到足以引起血管壁損傷的病理?yè)p害會(huì)產(chǎn)生類(lèi)似的多肽釋放。在凝血級(jí)聯(lián)的初始段，激活的蛋白質(zhì)中許多小肽被釋放形成血凝塊的框架。這些降解產(chǎn)物總是被認(rèn)為是相對(duì)不活躍的肽，盡管凝血級(jí)聯(lián)外的一些次要活性歸因于它們。這些肽存在于血流中剛足夠長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)一步再循環(huán)，半衰期僅幾分鐘。然而，考慮到其他生理過(guò)程不同系統(tǒng)間的復(fù)雜相互作用，由于血凝的需要通常與對(duì)病原體暴露一致，來(lái)自血凝級(jí)聯(lián)的降解產(chǎn)物有上調(diào)免疫系統(tǒng)的能力。此外細(xì)胞因子活動(dòng)通常在非常低的劑量發(fā)生。這些小體積肽，盡管其在體內(nèi)半衰期非常短，有深遠(yuǎn)影響的的能力驚人。雖然意外，這可能是由于當(dāng)血管壁或外皮有破損時(shí)免疫系統(tǒng)上調(diào)的需要。本發(fā)明的肽有這種阻止纖維蛋白和相關(guān)物質(zhì)沉積的能力。這是免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞級(jí)聯(lián)刺激的直接效應(yīng)或部分結(jié)果，但纖維蛋白肽A直接或間接導(dǎo)致纖維蛋白沉積調(diào)節(jié)的事實(shí)顯示為急性和慢性疾病治療的重大突破。此外，補(bǔ)體系統(tǒng)作為對(duì)相同類(lèi)型損害以及隨后感染源暴露的反應(yīng)激活。從補(bǔ)體級(jí)聯(lián)C3蛋白中釋放了一種之前沒(méi)被識(shí)別的肽，其對(duì)這種免疫調(diào)節(jié)活性有貢獻(xiàn)。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式涉及包含肽的制劑，肽含有在SEQ ID Nos. 1-5,7-9, 11-13，15，16，和20-22中識(shí)別出的序列。也包括含有纖維蛋白肽A或補(bǔ)體C3的序列，以及分別在產(chǎn)生纖維蛋白肽A或補(bǔ)體C3的哺乳動(dòng)物種類(lèi)間基本同源的纖維蛋白肽A或補(bǔ)體C3 區(qū)域的序列的肽。序列可以來(lái)自人或非人的來(lái)源。本發(fā)明也涉及含有一個(gè)或多個(gè)任何前述序列保守的氨基酸取代的序列。優(yōu)選的，制劑基本不含可檢測(cè)的纖維蛋白B。優(yōu)選制劑進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的載體如，例如水，油，食用油，脂肪酸，脂類(lèi)，多糖類(lèi)，纖維素，甘油，乙二醇，及其組合，以及任意的如J. Arch和N. Bowring的名為“藥物組合物”的W0/010757 (整體納入作為參考)中公開(kāi)的多種常規(guī)使用的載體。優(yōu)選的食用油包括，例如檸檬油，薄荷油，或葡萄籽油，以及其他天然油和來(lái)自植物的脂肪酸。優(yōu)選的制劑被制成口服，經(jīng)粘膜，非腸道，淋巴，或靜脈施用以使生物活性形式的制劑以生理有效濃度被釋放到患者系統(tǒng)中。還優(yōu)選從生物來(lái)源純化或合成制造的制劑，包括肽序列本身。本發(fā)明還包括編碼這些肽的核酸序列。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是上面和此處描述的制劑，其是膳食補(bǔ)充劑。本發(fā)明的制劑對(duì)人和動(dòng)物攝入安全，在所有有效劑量都是無(wú)毒的，并不含有內(nèi)源毒素或其他有害物質(zhì)或污染物。作為膳食補(bǔ)充劑施用可以以純的制劑形式，優(yōu)選經(jīng)粘膜并更優(yōu)選懸浮在脂肪酸， 糖或多糖，油，或其他載體物質(zhì)中(如作為液體，凝膠，膏，粉，片劑，或丸)以讓口腔粘膜，如舌下粘膜直接吸收。作為膳食補(bǔ)充劑，制劑可以被施用給患者或與其他成分結(jié)合如在飲料或食物產(chǎn)品中。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式涉及含有纖維蛋白肽A或其片段，以及藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物，其中纖維蛋白肽A或其片段為治療有效量，優(yōu)選的，治療有效量是從 0. Img至500mg。也優(yōu)選組合物其中治療有效濃度防止沉積并刺激患者血管外空間，如與冠狀動(dòng)脈疾病相關(guān)的，和血管內(nèi)膜下空間內(nèi)纖維蛋白的再吸收。優(yōu)選組合物在治療有效濃度是無(wú)毒的并基本不含可檢測(cè)的纖維蛋白肽B。組合物可以包含源自人或非人，但優(yōu)選哺乳動(dòng)物纖維蛋白肽A序列的纖維蛋白肽A或其片段。表達(dá)非人纖維蛋白肽A序列的哺乳動(dòng)物包括馬，貓，犬，牛，山羊，綿羊，和鼠。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式涉及治療或預(yù)防患者疾病的方法，包括提供包含纖維蛋白肽A或補(bǔ)體C3，或其片段，以及藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。優(yōu)選組合物不含可檢測(cè)量的纖維蛋白肽B，其中纖維蛋白肽A或補(bǔ)體C3，或其片段來(lái)自非人的哺乳動(dòng)物；以及對(duì)患者施用一定劑量組合物，其中施用是經(jīng)粘膜的以使纖維蛋白肽A或補(bǔ)體C3，或其片段施用5分鐘內(nèi)在患者淋巴系統(tǒng)中達(dá)到治療有效水平。優(yōu)選患者是人，也優(yōu)選疾病是血管炎癥或冠狀動(dòng)脈疾病。優(yōu)選單劑組合物含有從0. Img至IOmg的活性成分，更優(yōu)選從0. 1到5mg， 更優(yōu)選少于lmg。施用可以是定期的，優(yōu)選的施用包括一連幾天的單一有效劑量的初始施用，以及隨后的隔日一次的施用劑量施用，更優(yōu)選每幾天一次，更優(yōu)選一周一次或甚至更低頻率。所有藥劑的施用優(yōu)選口服和經(jīng)粘膜的，如經(jīng)舌下粘膜。優(yōu)選纖維蛋白肽A或其片段刺激患者細(xì)胞釋放細(xì)胞因子11^10，11^-10，而非11^-1，11^-4或1順(1。另一個(gè)優(yōu)選的方面是患者纖維蛋白肽B的活性被抑制，如，例如，通過(guò)施用纖維蛋白肽B結(jié)合劑。結(jié)合劑包括對(duì)纖維蛋白肽B特定的配體，抗體，或抗體片段，和，優(yōu)選是無(wú)毒的并含有能使纖維蛋白肽B相對(duì)纖維蛋白肽A活性不活躍的一種或多種物質(zhì)(如液體或化學(xué)品)。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式涉及防止纖維蛋白沉積并吸收患者血管和身體其他區(qū)域內(nèi)沉積的纖維蛋白的方法。這些方法包括提供包括纖維蛋白肽A或補(bǔ)體C3，或其片段和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物；以及對(duì)患者施用組合物以使纖維蛋白肽A或補(bǔ)體C3，或其片段在患者淋巴系統(tǒng)中達(dá)到治療有效水平。優(yōu)選患者是人以及纖維蛋白肽A或補(bǔ)體C3， 或其片段來(lái)自非人的相同分子哺乳動(dòng)物序列。組合物的使用優(yōu)選通過(guò)經(jīng)粘膜施用直接進(jìn)入淋巴系統(tǒng)，以及包括初始施用以及隨后持續(xù)的施用，而持續(xù)的施用不超過(guò)幾天一次如一周一次或甚至一月一次。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式涉及哺乳動(dòng)物血清組分，其中組分包含多種成分，澄清無(wú)顆粒，基本所有成分分子量在確定的范圍內(nèi)。通過(guò)分子量分級(jí)血清的方法是公知的，包括使用分子量截留膜透析，離心和鹽分級(jí)。分子量范圍優(yōu)選小于3000道爾頓，更優(yōu)選從約5800 道爾頓到約2500道爾頓，更優(yōu)選從約1000道爾頓到約2000道爾頓，更優(yōu)選從約1200道爾頓到約1800道爾頓，更優(yōu)選從約1400道爾頓到約1800道爾頓。優(yōu)選哺乳動(dòng)物是馬(馬)， 犬(狗)，貓(貓)，牛(如母牛，?；蚬?，山羊(山羊)，綿羊(綿羊或羊羔)，或鼠(鼠)， 或可以是任何產(chǎn)纖維蛋白A或補(bǔ)體C3的適合的哺乳動(dòng)物。發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式涉及包含肽的制劑，肽含有SEQ ID Nos. 6，10，14，和17-19 序列，纖維蛋白肽B的序列，在產(chǎn)生纖維蛋白肽B的哺乳動(dòng)物種類(lèi)間基本同源的纖維蛋白肽 B區(qū)域的序列。優(yōu)選制劑基本上沒(méi)有包含可檢測(cè)量的纖維蛋白肽A。優(yōu)選制劑進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的載體如，例如水，油，食用油，脂肪酸，脂類(lèi)，多糖類(lèi)，纖維素，甘油，乙二醇， 及其組合，或如J. Arch和N. Bowring的名為“藥物組合物”的W0/010757 (整體納入作為參考)中公開(kāi)的其他常規(guī)載體。優(yōu)選的食用油包括，例如檸檬油，薄荷油，或葡萄籽油，以及任何其他菜油或果油或脂肪酸，或植物油，多糖，或脂肪酸。優(yōu)選的制劑被制成口服，經(jīng)粘膜， 非腸道，淋巴，或靜脈施用以使生物活性形式的制劑以生理有效濃度被釋放到患者系統(tǒng)中。 優(yōu)選制劑是舌下口服的。還優(yōu)選從生物來(lái)源純化或合成制造的制劑。本發(fā)明還包括編碼這些肽的核酸序列。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是上面和此處描述的制劑，其是膳食補(bǔ)充劑。本發(fā)明的制劑對(duì)人和動(dòng)物攝入安全，在所有有效劑量都是無(wú)毒的，并不含有內(nèi)源毒素或其他有害物質(zhì)或污染物。作為膳食補(bǔ)充劑施用可以以純的制劑形式，優(yōu)選經(jīng)粘膜并更優(yōu)選懸浮在脂肪酸， 糖或多糖，油，或其他載體物質(zhì)中(如作為液體，凝膠，膏，粉，片劑，或丸)以讓口腔粘膜，如舌下粘膜直接吸收。作為膳食補(bǔ)充劑，制劑可以被施用給患者或與其他成分結(jié)合如在飲料或食物產(chǎn)品中。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式涉及治療或預(yù)防患者疾病的方法，包括提供包含纖維蛋白肽B或其片段，以及藥學(xué)上可接受的載體的組合物，其中組合物基本不含能檢測(cè)的纖維蛋白肽A，其中纖維蛋白肽B或其片段來(lái)自非人的哺乳動(dòng)物；以及對(duì)患者施用一定劑量組合物，其中施用是經(jīng)粘膜的以使纖維蛋白肽B或其片段施用5分鐘內(nèi)在患者淋巴系統(tǒng)中達(dá)到治療有效水平。優(yōu)選患者是人，疾病是自身免疫性疾病，如，例如，關(guān)節(jié)炎，克羅恩病，乳糜瀉，I型糖尿病，格雷夫癥，特發(fā)性血小板減少性紫癜，銀屑病，硬皮病，系統(tǒng)性紅斑狼瘡， 或潰瘍性結(jié)腸炎，或疾病是免疫調(diào)節(jié)疾病如，例如，過(guò)于活躍的免疫系統(tǒng)。優(yōu)選單劑含有從 0. Img至IOmg的活性成分，或更優(yōu)選從0. Img到5mg，或更優(yōu)選從0. Img到lmg。
本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式涉及哺乳動(dòng)物血清組分，其中組分包含多種成分，以常規(guī)方法澄清無(wú)顆粒，基本所有成分分子量在從約800道爾頓到約2700道爾頓的范圍內(nèi)。優(yōu)選成分的分子量范圍從約1000道爾頓到約2500道爾頓，更優(yōu)選從約1200道爾頓到約1800 道爾頓，更優(yōu)選從約1200道爾頓到約1800道爾頓，更優(yōu)選從約1400道爾頓到約1800道爾頓。優(yōu)選哺乳動(dòng)物選自馬，貓，犬，牛，山羊，綿羊，和鼠，或可以是任何產(chǎn)纖維蛋白B的適合的哺乳動(dòng)物組成的組。天然或合成的纖維蛋白肽A調(diào)節(jié)血管外空間的纖維蛋白沉積(該空間的纖維蛋白沉積和該空間纖維蛋白沉積的調(diào)動(dòng))，由此控制疾病進(jìn)展和改善沉積導(dǎo)致的癥狀。因此，本發(fā)明也涉及天然或合成的纖維蛋白肽A調(diào)節(jié)血管內(nèi)膜下空間纖維蛋白沉積(該空間的纖維蛋白沉積和該空間纖維蛋白沉積的調(diào)動(dòng))由此控制疾病進(jìn)展和改善沉積導(dǎo)致的癥狀。在治療研究中還使用了纖維蛋白肽A和B的組合。但這些研究沒(méi)能區(qū)分出一種肽與另一種的活性。此外，多數(shù)現(xiàn)有的公布的研究使用了物種特定的纖維蛋白肽，因此不能證實(shí)跨物種的效果。本發(fā)明顯示了纖維蛋白肽A作為免疫調(diào)節(jié)劑的活性。本發(fā)明還顯示了在肽的C末端的高度種間同源區(qū)域。纖維蛋白肽A和B通過(guò)顯著的直接抗炎反應(yīng)降低血管通透性改變的嚴(yán)重程度，主要作用于EAE進(jìn)展的免疫非特定性時(shí)期。這種反應(yīng)改善了疾病過(guò)程中的急性炎癥反應(yīng)。因此不能預(yù)期這種類(lèi)型的反應(yīng)會(huì)大幅降低自身免疫攻擊的初始癥狀，但隨著時(shí)間其能終止攻擊和促進(jìn)從攻擊中愈合。纖維蛋白肽A調(diào)節(jié)纖維蛋白以及血管外纖維蛋白的沉積和再吸收。描述的通過(guò)上面任意方法獲得血清的過(guò)程產(chǎn)生了富含本發(fā)明肽的血清?？紤]到大多數(shù)這些制品中沒(méi)有使用凝血抑制劑，凝血在從供體動(dòng)物或患者移出血液后立即自然發(fā)生，釋放部分或全部本專(zhuān)利目的肽。一旦釋放，這些肽經(jīng)歷進(jìn)一步的自然過(guò)程以產(chǎn)生活性肽片段。由于這些專(zhuān)利中描述的過(guò)濾方法不能從血清中去除這些小肽，以及給出的確定的纖維蛋白肽A和B的效力， 這些多肽是使用這些制品所見(jiàn)治療效果部分或全部的原因。許多慢性疾病顯示纖維蛋白沉積的存在是疾病進(jìn)展的重要病理部分。防止這些沉積和消除已經(jīng)存在的沉積是這些疾病治療中的重要靶標(biāo)。如這里評(píng)價(jià)的，作為對(duì)外傷反應(yīng)釋放的這些相同多肽的療效的顯著數(shù)據(jù)證明了這些多肽防止或減緩纖維蛋白沉積和刺激纖維蛋白再吸收的能力。這些肽在纖維蛋白的激活中以交錯(cuò)的方式釋放。切割激活纖維蛋白肽A，其能阻止纖維蛋白沉積，隨后是纖維蛋白肽B，其能促進(jìn)纖維蛋白沉積。然而該組合引起傷口修復(fù)。使用質(zhì)譜，在過(guò)濾樣品以?xún)H保存那些大小優(yōu)選小于3kD的物質(zhì)后從血清中分離出一組小肽。絕大多數(shù)這些本發(fā)明肽是凝血級(jí)聯(lián)的副產(chǎn)品，盡管其之前沒(méi)有被用作治療劑。這些肽的治療活性分為兩類(lèi)1)調(diào)節(jié)纖維蛋白沉積和已存在的纖維蛋白沉積的再吸收；2)將免疫系統(tǒng)從慢性疾病中所見(jiàn)的被動(dòng)模式調(diào)節(jié)到主動(dòng)監(jiān)視模式；和幻抗炎活性。血管外空間纖維蛋白沉積的調(diào)節(jié)被認(rèn)為是治療多種疾病的重要潛在靶標(biāo)，包括紅斑性狼瘡，多發(fā)性硬化癥，動(dòng)脈粥樣硬化，類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，阿爾茨海默癥。在這些疾病中(以及許多其他疾病中)血管外空間纖維蛋白沉積是疾病進(jìn)展中的重要事件。盡管纖維蛋白沉積可能不是特定疾病的起因，始于這種纖維蛋白沉積時(shí)間的過(guò)程是疾病進(jìn)展和這些疾病引起的組織破壞的重要病理因素。這種沉積也阻斷身體經(jīng)常使用的愈合受傷組織的機(jī)制。這些肽阻斷這種纖維蛋白沉積的能力從沒(méi)有被認(rèn)作潛在的治療方法。此外，已確認(rèn)由于纖維蛋白存在在這些組織中引起的級(jí)聯(lián)效應(yīng)，慢性纖維蛋白沉積阻止正常的組織愈合。本發(fā)明的肽也激發(fā)這些纖維蛋白沉積的再吸收，使得慢性疾病中的自然愈合過(guò)程恢復(fù)。由注射本發(fā)明的肽激發(fā)的免疫級(jí)聯(lián)證明了這種Thl/Th2組合反應(yīng)類(lèi)型，如證明了白介素IB和10持續(xù)的升高和白介素13，5，6，和8，和TNF-α不持續(xù)的升高的數(shù)據(jù)所示。這些白介素源于免疫細(xì)胞(巨噬細(xì)胞，單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)。肽，纖維蛋白肽A和B，的抗炎反應(yīng)最先見(jiàn)于1978年的公布(Ruhenstroth-bauer 等美國(guó)專(zhuān)利4，215，109號(hào))。然而，嚴(yán)重缺乏研究這種活性的任何后續(xù)公布，特別是缺乏在實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性(自身免疫)腦脊髓炎模型中的其他發(fā)表的研究。此外，作者沒(méi)有確定抗炎反應(yīng)的機(jī)制，也沒(méi)有確定這些肽的免疫刺激能力。如本發(fā)明所示，這種抗炎反應(yīng)部分是由于本發(fā)明肽刺激Th2細(xì)胞因子IL-10釋放的能力。盡管這種反應(yīng)在急性疾病中有意義，設(shè)計(jì)的急性疾病模型不能顯示這種反應(yīng)在慢性疾病中更顯著的效果。只使用纖維蛋白肽A，使用不同劑量的聚乙二醇化的纖維蛋白肽A進(jìn)行三組研究。發(fā)現(xiàn)這種修飾降低了任何可測(cè)量的纖維蛋白肽A活性，證明了纖維蛋白肽A的降解在這種多肽激活中的重要性。除了纖維蛋白肽A和B的這種抗炎性能之外，由這些肽引起的級(jí)聯(lián)反應(yīng)增加了促炎細(xì)胞因子IL-IB的生產(chǎn)。IL-IB是炎癥反應(yīng)重要的中介物，包括于多種細(xì)胞活動(dòng)中，包括細(xì)胞增殖，分化和凋亡(受刺激的細(xì)胞死亡)。盡管我們的研究中沒(méi)有證明IL-2的升高， IL-I可能通過(guò)誘導(dǎo)IL-2的釋放來(lái)刺激胸腺細(xì)胞增殖和分化。IL-I也刺激B細(xì)胞成熟和增殖，激發(fā)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和膠原酶(其他T和B淋巴細(xì)胞的刺激物)從滑膜細(xì)胞釋放。 由于其有刺激前列腺素的釋放的能力，IL-I被認(rèn)為是內(nèi)源性致熱源。盡管所見(jiàn)的源自這些肽的IL-IB增加似乎不足以誘導(dǎo)發(fā)熱反應(yīng)，對(duì)免疫系統(tǒng)的整體效果相當(dāng)深遠(yuǎn)。缺乏致熱性也可能是部分由于同時(shí)刺激出的IL-10的抗炎活性。由于外皮是對(duì)抗感染的第一防御線，免疫調(diào)節(jié)級(jí)聯(lián)作為對(duì)任何外皮破損的反應(yīng)發(fā)生。作為對(duì)這種類(lèi)型破損反應(yīng)的這些肽的釋放至少包括免疫調(diào)節(jié)活性的顯著部分。在確定這種免疫調(diào)節(jié)活性的活性成分過(guò)程，這些肽的生物活性形式實(shí)際是之前描述的肽的片段， 這些片段遠(yuǎn)比完整的肽更有活性。為激活纖維蛋白，纖維蛋白肽A和B被從纖維蛋白原亞單位Aa和Ββ的羧基端切割下來(lái)。纖維蛋白原A和B隨后經(jīng)歷進(jìn)一步的生理激活步驟以變成有力的免疫調(diào)節(jié)物。盡管觀察到這些肽許多次要效果，其中沒(méi)有顯著的或能視為本發(fā)明公開(kāi)的可行的治療選擇的。除了作為對(duì)外皮損傷或感染損害反應(yīng)的上面的凝血因子的釋放之外，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)找出并摧毀異常細(xì)胞的能力的免疫級(jí)聯(lián)反應(yīng)開(kāi)始。這種免疫系統(tǒng)刺激可以被分為兩個(gè)方面，先天和適應(yīng)性反應(yīng)。通過(guò)向身體引入異常細(xì)胞，先天免疫系統(tǒng)快速響應(yīng)抵擋損害。這種反應(yīng)的一部分是能激活攻擊和摧毀感染生物的系統(tǒng)的補(bǔ)體級(jí)聯(lián)激活。結(jié)合這一點(diǎn)，一個(gè)之前沒(méi)有確認(rèn)的補(bǔ)體C3片段一直存在于所有測(cè)試的哺乳動(dòng)物血清組分中，提示這種分子參與這些血清組分的免疫調(diào)節(jié)活性。這種蛋白引起了免疫系統(tǒng)先天和適應(yīng)性部分的全面刺激。釋放這種肽的切割位點(diǎn)的指示之前沒(méi)有被確定過(guò)，也沒(méi)有文獻(xiàn)承認(rèn)該片段有生物學(xué)活性。該片段從C3a_g被去除后保存的C3蛋白部分的氨基端取下。保存的片段被稱(chēng)為補(bǔ)體C3a鏈片段2。該片段組成了補(bǔ)體C3蛋白的1321-1663氨基酸，C3f后其余的蛋白
19被切割，并參與補(bǔ)體級(jí)聯(lián)。本發(fā)明證明了隨著C3f的切割(氨基酸1304-1320)，產(chǎn)生了額外的酶活性。該肽的切割是物種依賴(lài)的，氨基端有明顯的同源序列，但羧基端有不同。相比其他哺乳動(dòng)物，羧基端的取代改變了人中的切割位點(diǎn)，但這個(gè)改變沒(méi)有影響分子的活性。 在人血清中，這個(gè)肽組成了 C3蛋白的1321-1336序列，帶一個(gè)SEETKENEGFTVTAEGK序列 (SEQ ID NO. 16)。在其他確定的物種中，這個(gè)蛋白包括在13 處以精氨酸取代甘氨酸，還有1333處導(dǎo)致切割位點(diǎn)變化的其他取代。因此這些取代導(dǎo)致了多數(shù)其他哺乳動(dòng)物中帶序列SEETKENERFTV(SEQ ID NO. 7)的截短的肽的切割。種間同源性輕微變化，由此序列編號(hào)在種間也有變化。這改變了該肽位置的氨基酸編號(hào)。然而，在每個(gè)物種中這種肽被作為補(bǔ)體C3f的切割之后的下個(gè)片段釋放(C3g位置比C3f序列更向氨基端)。少數(shù)如上文所述的例外中，后面的序列在所有確認(rèn)了補(bǔ)體C3全序列的物種中有強(qiáng)同源性。在每種情況下，這種額外切割分離出包含顯著免疫系統(tǒng)刺激的片段。這種刺激增強(qiáng)了先天和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)活性，使活性大大增強(qiáng)。雖然不受限制，如許多其他免疫系統(tǒng)刺激物所證明的，免疫系統(tǒng)的慢性刺激有長(zhǎng)期副作用的顯著風(fēng)險(xiǎn)，當(dāng)這種分子與激活的纖維蛋白肽A片段的抗炎活性聯(lián)用時(shí)，這種組合很大的增強(qiáng)了免疫系統(tǒng)，而且纖維蛋白肽A的抗炎活性基本完全控制了預(yù)期的副作用。 除這些發(fā)現(xiàn)外，由組成imf-C3氨基端和af-FA羧基端的序列組成的合成肽有這種雙重作用。已知的在1320氨基酸處以谷氨酰胺取代精氨酸導(dǎo)致C3補(bǔ)體減少癥(C3同種異形C3’F02’ MWatanabe等。1993)，這一事實(shí)增強(qiáng)了支持該片段功用的數(shù)據(jù)的強(qiáng)度。預(yù)期可以改變切割位點(diǎn)的該取代引起免疫功能的顯著變化，導(dǎo)致了對(duì)病理刺激的低反應(yīng)，并證明了該分子的存在對(duì)正常免疫反應(yīng)是必要的。這個(gè)數(shù)據(jù)也也可以推斷證明該分子刺激先天免疫系統(tǒng)的能力。每一個(gè)補(bǔ)體C3的另一個(gè)蛋白片段都包含在補(bǔ)體級(jí)聯(lián)中而該肽顯然沒(méi)有。作為治療血清組分的一部分，本發(fā)明顯示該分子通過(guò)免疫系統(tǒng)刺激在多種病理過(guò)程中有極大的療效。使用補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)的傳統(tǒng)命名法，該蛋白應(yīng)為補(bǔ)體C3h。由于其不參與補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)， 該蛋白被稱(chēng)為C3調(diào)節(jié)片段(imf-C3)，澄清了該肽在補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)之外的活性類(lèi)型。本發(fā)明包括獲得血清治療成分或通過(guò)從頭合成過(guò)程或發(fā)酵來(lái)合成血清中的活性肽，以及利用這些肽治療宿主感染，炎癥，腫瘤和自身免疫疾病。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式涉及使用來(lái)自凝血級(jí)聯(lián)的有生物活性的降解產(chǎn)物以激活免疫系統(tǒng)反應(yīng)的治療方法。除了描述的特定肽之外，來(lái)自本專(zhuān)利沒(méi)有特別描述的其他動(dòng)物血清的類(lèi)似的衍生或合成肽也被包括，這是由于這些肽包含的足夠同源性和相似特征顯示了其他動(dòng)物的同源肽也會(huì)有相同的治療活性。如本發(fā)明實(shí)施和廣泛描述的，本發(fā)明涉及藥物組合物和來(lái)自動(dòng)物血液的哺乳動(dòng)物血清生物活性組分的制備方法，該組分能調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫反應(yīng)，抑制炎癥反應(yīng)，以及減少任何其他哺乳動(dòng)物多種疾病中的血管外纖維蛋白慢性沉淀。按照本發(fā)明方法制備的生物活性組分分離了提供廣泛新療法的肽。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式是提供肽的方法，例如， 通過(guò)生產(chǎn)血液血清生物活性組分，包括步驟(i)從動(dòng)物中抽取血液；(ii)從所述血液中分離血清；和(iii)分離包含這些肽的組分。進(jìn)一步優(yōu)選動(dòng)物是哺乳動(dòng)物，盡管在其他動(dòng)物如家禽的血清中也發(fā)現(xiàn)了相同的特征。生產(chǎn)含有這些肽的血清組分的優(yōu)選方法包括但不限于超濾，HPLC分離，其他形式的色譜，切向流過(guò)濾，透析，離心，電泳，以及其他。盡管天然血清有治療效果，優(yōu)選血清經(jīng)過(guò)過(guò)濾以限制提供給接收動(dòng)物的其他分子。理想的這樣可以消除任何大于6kD的分子，優(yōu)選大于3kD的分子。在優(yōu)選的本發(fā)明方法的實(shí)施方案中血液是動(dòng)脈和/或靜脈血。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，方法進(jìn)一步包括溫育所述血液和凝血酶的步驟，生理的或通過(guò)在體外加入凝血酶。方法優(yōu)選包括凍干所述血清的步驟，血清組分被冷凍并保存在_80°C下直至接近使用時(shí)間。可選擇的，凍干的血清組分可以被懸浮在適合的溶液中并作為膳食補(bǔ)充劑口服施用以改善免疫系統(tǒng)正常功能。治療1)本發(fā)明一個(gè)方面是有生物活性的血清組分，其可以按照本發(fā)明的方法生產(chǎn)，或按能包括進(jìn)本發(fā)明血清組分的任何方法制備。2)本發(fā)明進(jìn)一步的方面是這種血清組分的應(yīng)用，作為包含這種本發(fā)明生物活性血清組分以及與之聯(lián)合的多種能促進(jìn)吸收藥物的動(dòng)物利用的其他藥用級(jí)添加劑中任意添加劑的藥物制品。這些添加劑可以包括填料，載體，粘結(jié)劑，吸附劑，防腐劑，稀釋劑等。在本發(fā)明藥物制品優(yōu)選的實(shí)施方式中，制品被制成皮下或靜脈注射的溶液。其他實(shí)施方式包括本發(fā)明作為局部用制劑如凝膠，乳液或補(bǔ)片，舌下含化溶液或制劑，栓劑，錠劑，膠囊或片劑， 等的使用。3)本發(fā)明另一個(gè)方面是本發(fā)明的生物活性血清組分或本發(fā)明的藥物制品生產(chǎn)治療急性細(xì)菌感染的人和獸用藥物的用途。4)本發(fā)明另一個(gè)方面是本發(fā)明的生物活性血清組分或本發(fā)明的藥物制品生產(chǎn)治療慢性細(xì)菌感染的人和獸用藥物的用途。5)本發(fā)明另一個(gè)方面是本發(fā)明的生物活性血清組分或本發(fā)明的藥物制品生產(chǎn)預(yù)防細(xì)菌感染的人和獸用藥物的用途。6)本發(fā)明另一個(gè)方面是本發(fā)明的生物活性血清組分或本發(fā)明的藥物制品生產(chǎn)治療急性病毒感染的人和獸用藥物的用途。7)本發(fā)明另一個(gè)方面是本發(fā)明的生物活性血清組分或本發(fā)明的藥物制品生產(chǎn)治療慢性病毒感染，如HIV，HCV, HBV, HSV, HPV的人和獸用藥物的用途。8)本發(fā)明另一個(gè)方面是本發(fā)明的生物活性血清組分或本發(fā)明的藥物制品生產(chǎn)預(yù)防病毒感染，如上面列出的人和獸用藥物的用途。9)本發(fā)明另一個(gè)方面是本發(fā)明的生物活性血清組分或本發(fā)明的藥物制品生產(chǎn)治療寄生蟲(chóng)病藥物的用途。10)本發(fā)明另一個(gè)方面是本發(fā)明的生物活性血清組分或本發(fā)明的藥物制品生產(chǎn)預(yù)防寄生蟲(chóng)病的人和獸用藥物的用途。11)本發(fā)明另一個(gè)方面是本發(fā)明的生物活性血清組分或本發(fā)明的藥物制品生產(chǎn)治療自身免疫疾病的人和獸用藥物的用途，自身免疫疾病包括風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡， 硬皮病，混合性結(jié)締組織病，肖格倫病，牛皮癬，強(qiáng)直性脊柱炎和反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎，白塞氏綜合征，血管炎，結(jié)節(jié)，多漿膜炎，淀粉樣變性，克羅恩病，潰瘍性結(jié)腸炎等。12)本發(fā)明另一個(gè)方面是本發(fā)明的生物活性血清組分或本發(fā)明的藥物制品生產(chǎn)治療神經(jīng)疾病的人和獸用藥物的用途，神經(jīng)疾病包括脫髓鞘疾病(多發(fā)性硬化癥等)，退行性疾病(阿爾茨海默氏癥，帕金森氏病等)，神經(jīng)病變(糖尿病的，特發(fā)性的，毒性的等)和其他慢性神經(jīng)性疼痛(RSD等)。13)本發(fā)明另一個(gè)方面是本發(fā)明的生物活性血清組分或本發(fā)明的藥物制品生產(chǎn)治療腫瘤性疾病的人和獸用藥物的用途，腫瘤性疾病包括癌，肉瘤，白血病和淋巴瘤。14)本發(fā)明另一個(gè)方面是本發(fā)明的生物活性血清組分或本發(fā)明的藥物制品生產(chǎn)治療肌肉骨骼系統(tǒng)炎癥疾病的人和獸用藥物的用途。15)本發(fā)明另一個(gè)方面是本發(fā)明的生物活性血清組分或本發(fā)明的藥物制品生產(chǎn)治療超免疫疾病，例如緩解過(guò)敏過(guò)程和減少季節(jié)性過(guò)敏的人和獸用藥物的用途。16)本發(fā)明另一個(gè)方面是本發(fā)明的生物活性血清組分或本發(fā)明的藥物制品生產(chǎn)治療慢性傷口的人和獸用藥物的用途，慢性傷口包括慢性褥瘡，糖尿病足潰瘍等。17)本發(fā)明另一個(gè)方面是本發(fā)明的生物活性血清組分或本發(fā)明的藥物制品生產(chǎn)治療其他形式的慢性疼痛的人和獸用藥物的用途18)本發(fā)明進(jìn)一步的方面是使用這種血清組分作為包含這種本發(fā)明生物活性血清組分以及與之聯(lián)合的多種能促進(jìn)吸收藥物的動(dòng)物利用的其他食品級(jí)添加劑中任意添加劑的膳食補(bǔ)充制品。這些添加劑可以包括填料，載體，粘結(jié)劑，吸附劑，防腐劑，稀釋劑等。在本發(fā)明用途進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，藥物通過(guò)這些肽的合成合成生產(chǎn)。這些合成的肽與過(guò)濾的哺乳動(dòng)物血清組分有相同的生物學(xué)功能，在這個(gè)實(shí)施方式中本發(fā)明涉及包含序列SEQ ID N01-21和其保守取代和修飾的肽的分離和制造。在本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方式中這些合成的肽被用于上面1-18描述的治療。在本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方式中，藥物是有激活片段下列特征的任何肽1)N-末端包含8到20個(gè)氨基酸，2)這部分通常包含大于平均數(shù)目的酸性氨基酸，3) C-末端含有序列 FLAEGGGV(SEQ ID NO 22)，同源序列，或含有GGV (SEQ ID NO 21)的C末端的一部分，以及 4)與纖維蛋白肽A在編的肽相比C末端有預(yù)期的精氨酸丟失。該末端序列在哺乳動(dòng)物中高度保守，被認(rèn)為是肽的活性部分。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是有這些特征的或具備與本發(fā)明相同的生物活性的三個(gè)肽同源結(jié)構(gòu)的肽，獲自自然或合成來(lái)源。優(yōu)選的，這些肽顯示纖維蛋白肽A或含有其保守序列的片段的一個(gè)或多個(gè)保守的氨基酸取代。保守取代定義為保持蛋白結(jié)構(gòu)和功能特征的氨
基酸替代。在這個(gè)實(shí)施方式中，包括了從與人類(lèi)序列數(shù)據(jù)中纖維蛋白肽A氨基酸序列同源的任意動(dòng)物纖維蛋白原α鏈獲得的肽。在本發(fā)明進(jìn)一步實(shí)施方式中擁有這些特征的肽被用于上面1-18描述的治療。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是從患者中取血，進(jìn)行各種純化/過(guò)濾過(guò)程以分離有上述特征的肽，并隨后自體注射施用肽以產(chǎn)生本發(fā)明的生物活性的過(guò)程。在這個(gè)實(shí)施方式中，短時(shí)間內(nèi)處理血清并立即回輸血清，或者可以大量取血清，隨后在延長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)按一定間隔給予小部分含有產(chǎn)品的處理過(guò)的肽。在這個(gè)實(shí)施方式中可以用包括超濾，HPLC分離，其他形式的色譜，切向流過(guò)濾，透析，離心，電泳，和許多其他方式在內(nèi)的多種方法中任意的方法為自體注射做處理。在這個(gè)實(shí)施方式中抽取的血液立即置于離心機(jī)中，血清被分離隨后處理或冷凍保存直至開(kāi)始處理。劑量等份被冷凍儲(chǔ)存直至馬上要注射之前。在本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方式中，為自體注射處理過(guò)的肽被用于上面1-18描述的治療。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式是對(duì)本發(fā)明的肽特定起反應(yīng)的抗體或抗體片段的生產(chǎn)。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式涉及編碼本發(fā)明肽的核酸序列，和能與之雜交的序列。下面實(shí)施例展示了本發(fā)明的實(shí)施方式，但不應(yīng)被視為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。
實(shí)施例本發(fā)明是審閱現(xiàn)有文獻(xiàn)，超濾的人，牛，貓，馬，和山羊血清質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析，以及隨后確定組分和合成肽擁有所述的免疫調(diào)節(jié)能力的產(chǎn)物。除非使用凝血抑制劑，在從動(dòng)物或人中取血的過(guò)程中會(huì)發(fā)生凝血過(guò)程。在這種超濾的產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的肽主要是凝血級(jí)聯(lián)的副產(chǎn)品。令人驚訝的發(fā)現(xiàn)這些之前確定的肽中C末端精氨酸已被去除。這種活性是由于羧肽酶B的存在。血流中這種酶的存在生理激活了許多肽。由于這種酶存在于血清中并始終對(duì)含有羧基末端精氨酸的分子行使這種精氨酸切除，這種酶從纖維蛋白肽A和B以及imf-C3 羧基端去除精氨酸是自然發(fā)生的。這種去除激活這些肽稱(chēng)為強(qiáng)有力的免疫調(diào)節(jié)劑。仍然連接有精氨酸的肽的量在動(dòng)物樣品中很少，以至于在任何動(dòng)物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)中幾乎找不到完整的肽(見(jiàn)圖1，2，3和4)。從所有四種哺乳動(dòng)物樣品中分離出的僅有的肽是SEQ ID No 12， 但這種肽在牛和馬樣品中的存在極少，這可能與交叉污染有關(guān)。在人樣品(相同的方法處理)中，仍然連接有末端精氨酸的肽的量大得多，表明在人血清中通過(guò)羧肽酶B去除該精氨酸的過(guò)程的效率遠(yuǎn)低于在動(dòng)物中發(fā)生的。在上面描述的激活的纖維蛋白原片段之外，除馬樣品外的每個(gè)樣品包含上面描述的之前未被確認(rèn)的C3補(bǔ)體片段。該片段位于C3c補(bǔ)體α鏈片段2的N末端，依物種包含 12-17個(gè)氨基酸。在三個(gè)不同數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，該C3補(bǔ)體沒(méi)有出現(xiàn)在馬序列中，這可能解釋了那個(gè)樣品中沒(méi)有識(shí)別出這種肽。在分析的其他物種中，該片段有相當(dāng)?shù)耐葱?，特別是氨基端。人C3補(bǔ)體片段中的同源片段也沒(méi)有被識(shí)別為從C3c α鏈片段2上切割下的。該C3 α 鏈片段在N末端有強(qiáng)同源序列，在前12個(gè)氨基酸中僅有一個(gè)肽的取代。數(shù)據(jù)表明在山羊和牛血清組分分析中該肽量更高，這可能解釋了多數(shù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)中山羊血清的優(yōu)先使用。由于山羊和牛中該肽的存在似乎顯著高于其他物種中所發(fā)現(xiàn)的，該分子的活力可以解釋使用山羊作為現(xiàn)在用于治療的血清組分的主要?jiǎng)游镅鍋?lái)源。與質(zhì)譜結(jié)果聯(lián)合的MASCOT檢索數(shù)據(jù)庫(kù)將牛和山羊中的這種肽識(shí)別為序列命中，但在其他樣品中僅將其識(shí)別為可能的序列命中。也發(fā)現(xiàn)較短的山羊和牛肽比較長(zhǎng)的人的自然發(fā)生的肽有更大的活性。盡管不同動(dòng)物樣品中所見(jiàn)的纖維蛋白肽B片段沒(méi)有任何顯著的同源性(纖維蛋白肽A和描述的C3補(bǔ)體片段的特征)，纖維蛋白肽B仍然可能是某些治療效果的重要部分。 這種顯著同源性的缺乏表明治療效果最可能是物種特定的，限制了使用動(dòng)物模型證明人肽療效的能力。事實(shí)上，檢查不同哺乳動(dòng)物序列信息顯示了即使是在關(guān)系密切的物種之間，纖維蛋白原b鏈區(qū)域幾乎沒(méi)有同源性(猩猩與人的纖維蛋白肽B序列明顯不同)。一旦這些肽被識(shí)別，進(jìn)行比較分析以評(píng)估血清組分的相似性。在肽A的羧基端和肽C中發(fā)現(xiàn)很大的同源性，但是在肽B中物種間沒(méi)有顯著的同源性。多數(shù)物種間活性可能在肽A和C。由于血清組分中抗感染活性數(shù)據(jù)似乎最強(qiáng)，使用Ponto Toro和甲型流感Hmi的動(dòng)物模型以三種不同的樣品試驗(yàn)這兩種病毒1)合成的人激活的纖維蛋白肽Ad)合成的動(dòng)物肽imf_C3 ；和幻過(guò)濾凍干的，測(cè)試發(fā)現(xiàn)含有全部三種肽的山羊血清組分。盡管這些物質(zhì)不能像直接抗病毒劑一樣作用，結(jié)果確實(shí)證明了與安慰劑組相比治療的動(dòng)物存活率改
口 ο在該研究中分析了幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。這包括肝，脾，和血清病毒滴度；血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (ALT)的測(cè)定；在感染后第3天對(duì)肝和肺肝性黃疸評(píng)分；每日體重測(cè)量；至死亡的平均天數(shù)；和總生存率。使用包含纖維蛋白肽A的測(cè)試物治療的兩組表現(xiàn)相同。在這些治療組中 60%的鼠生存，而在安慰劑組中僅有25%存活。這樣的改善對(duì)每個(gè)獨(dú)立纖維蛋白肽A治療組在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著(P值=0. 03)，當(dāng)這些組合并起來(lái)計(jì)算使用纖維蛋白肽A的總改善時(shí)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性也改善了(P值=0. 015)。盡管評(píng)價(jià)的任何其他疾病標(biāo)準(zhǔn)沒(méi)有可觀察到的不同， 存活率仍然增加，表明了病毒引起疾病的能力沒(méi)有改變，而機(jī)體在一劑肽A后對(duì)抗威脅生命感染的能力增強(qiáng)。在該研究中沒(méi)有進(jìn)行炎癥或纖維蛋白沉積測(cè)定。盡管纖維蛋白肽A和利巴韋林對(duì)照間存在差異，該差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不顯著(P值=0.08)。這些結(jié)果表明了這些肽(特別是纖維蛋白肽A)在傳染病領(lǐng)域的治療價(jià)值，其有增強(qiáng)愈合并減少癥狀持續(xù)時(shí)間的能力。由于身體對(duì)傳染病的常規(guī)反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致非常促炎的狀態(tài)，甚至在感染消除后這種狀態(tài)經(jīng)常引起持續(xù)的癥狀。纖維蛋白肽A有減輕這些癥狀并由此縮短疾病癥狀期的能力，而不阻礙身體對(duì)抗感染的能力。這種效果也可能是部分由于纖維蛋白肽A將蛋白(特別是纖維蛋白)調(diào)動(dòng)出血管外空間的能力。除了該P(yáng)onto Toro研究之外，進(jìn)行了測(cè)試這些物質(zhì)對(duì)抗甲型流感Hmi的研究。在該研究中對(duì)照是低劑量的利巴韋林。每組中的所有鼠都死亡，表明感染比預(yù)期的更嚴(yán)重。對(duì)施用這些物質(zhì)后的健康志愿者做細(xì)胞因子板評(píng)價(jià)以更充分描述作用機(jī)制和治療活性。為證明這些肽的效果，將含有本發(fā)明制型肽的過(guò)濾的血清樣品(見(jiàn)山羊過(guò)濾組分 HPLC圖，圖5)施用給一健康志愿者，最初使用山羊制品。即將施用之前，以及按時(shí)間間隔在施用后(施用后15分，1小時(shí)，和3小時(shí)，見(jiàn)表1)獲得12細(xì)胞因子板測(cè)試結(jié)果?；诎l(fā)表的研究，預(yù)計(jì)這些間隔中細(xì)胞因子板有變化，但觀察到的效果遠(yuǎn)小于預(yù)期。5周后將另一個(gè)高得多的劑量的自體制品施用給同樣的健康志愿者。注意表1最后一列白介素10，13， 和1β初始水平的顯著差異。此外，白介素2受體水平有輕微升高。考慮到第一組數(shù)據(jù)中的微小變化，細(xì)胞因子板中最初所見(jiàn)的微小變化在更長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)繼續(xù)升高。表1 施用本發(fā)明的山羊肽后12細(xì)胞因子板測(cè)試。
權(quán)利要求
1.包含肽的制劑，肽含有選自由SEQID Nos. 1-5，7-9，11-13，15，16，和20-22，纖維蛋白肽A的序列，在產(chǎn)生纖維蛋白肽A的哺乳動(dòng)物種類(lèi)間基本同源的纖維蛋白肽A區(qū)域的序列，補(bǔ)體C3的序列，以及含有一個(gè)或多個(gè)保守的氨基酸取代的前述序列所組成組的序列， 其中制劑基本上沒(méi)有包含可檢測(cè)的纖維蛋白肽B。
2.權(quán)利要求1的制劑，進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的載體。
3.權(quán)利要求2的制劑，其中藥學(xué)上可接受的載體選自由水，油，食用油，脂肪酸，脂類(lèi)， 多糖類(lèi)，纖維素，甘油，乙二醇，及其組合。
4.權(quán)利要求3的制劑，其中食用油是檸檬油，薄荷油，或葡萄籽油。
5.權(quán)利要求1的制劑，其被制成口服，經(jīng)粘膜，非腸道，淋巴，或靜脈施用。
6.權(quán)利要求1的制劑，其中生物活性形式的制劑以生理有效濃度被釋放到患者系統(tǒng)中。
7.權(quán)利要求1的制劑，其是一種膳食補(bǔ)充劑。
8.權(quán)利要求1的制劑，其從生物來(lái)源純化或合成制造。
9.藥物組合物，含有纖維蛋白肽A或其片段，以及藥學(xué)上可接受的載體，其中纖維蛋白肽A或其片段為治療有效量，治療有效量是從0. Img至500mg。
10.權(quán)利要求9的組合物，其中治療有效濃度防止沉積并刺激患者血管外和血管內(nèi)膜下空間內(nèi)纖維蛋白的再吸收。
11.權(quán)利要求9的組合物，其中治療有效濃度防止沉積并刺激與冠狀動(dòng)脈疾病相關(guān)的纖維蛋白沉積的再吸收。
12.權(quán)利要求9的組合物，其在治療有效濃度是無(wú)毒的并基本不含可檢測(cè)的纖維蛋白肽B。
13.權(quán)利要求9的組合物，其中纖維蛋白肽A或其片段來(lái)自人的纖維蛋白肽A序列。
14.權(quán)利要求9的組合物，其中纖維蛋白肽A或其片段來(lái)自非人的纖維蛋白肽A序列。
15.權(quán)利要求14的組合物，其中非人的序列來(lái)自哺乳動(dòng)物物。
16.權(quán)利要求15的組合物，其中哺乳動(dòng)物選自由馬，貓，犬，牛，山羊，綿羊，和鼠組成的組。
17.治療或預(yù)防患者疾病的方法，包括提供包含纖維蛋白肽A或其片段，以及藥學(xué)上可接受的載體，而不含纖維蛋白肽B的組合物，其中纖維蛋白肽A或其片段來(lái)自非人的哺乳動(dòng)物；以及對(duì)患者施用一定劑量組合物，其中施用是經(jīng)粘膜的以使纖維蛋白肽A或其片段施用5 分鐘內(nèi)在患者淋巴系統(tǒng)中達(dá)到治療有效水平。
18.權(quán)利要求17的方法，其中患者是人。
19.權(quán)利要求17的方法，其中疾病是血管炎癥。
20.權(quán)利要求17的方法，其中疾病是冠狀動(dòng)脈疾病。
21.權(quán)利要求17的方法，其中單劑含有從0.Img至IOmg的活性成分。
22.權(quán)利要求17的方法，其中對(duì)患者施用一定劑量組合物包括初始施用以及隨后持續(xù)的施用，而持續(xù)的施用至少7天不重復(fù)。
23.權(quán)利要求17的方法，其中經(jīng)粘膜施用是口服。
24.權(quán)利要求17的方法，其中纖維蛋白肽A或其片段刺激細(xì)胞因子ILlβ，IL-10，而非11^-1，比-4或1咿0的釋放。
25.權(quán)利要求17的方法，其中患者纖維蛋白肽B的活性被抑制。
26.權(quán)利要求25的方法，其中通過(guò)施用纖維蛋白肽B結(jié)合劑來(lái)抑制纖維蛋白肽B的活性。
27.防止纖維蛋白沉積并吸收患者血管內(nèi)沉積的纖維蛋白的方法，包括 提供包括纖維蛋白肽A或其片段和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物；以及對(duì)患者施用組合物以使纖維蛋白肽A或其片段在患者淋巴系統(tǒng)中達(dá)到治療有效水平。
28.權(quán)利要求27的方法，其中患者是人。
29.權(quán)利要求27的方法，其中纖維蛋白肽A或其片段來(lái)自非人的哺乳動(dòng)物纖維蛋白肽 A序列。
30.權(quán)利要求27的方法，其中組合物通過(guò)經(jīng)粘膜施用直接施用入淋巴系統(tǒng)。
31.權(quán)利要求27的方法，其中對(duì)患者施用包括初始施用以及隨后持續(xù)的施用，而持續(xù)的施用不超過(guò)一周一次。
32.哺乳動(dòng)物血清組分，其中組分包含多種成分，澄清無(wú)顆粒，基本所有成分分子量在約1200道爾頓至約1700道爾頓范圍內(nèi)。
33.權(quán)利要求32的組分，其中哺乳動(dòng)物選自馬，貓，犬，牛，山羊，綿羊，和鼠組成的組。
34.包含肽的制劑，肽含有選自由SEQID Nos. 6，10，14，和17-19，纖維蛋白肽B的序列，在產(chǎn)生纖維蛋白肽B的哺乳動(dòng)物種類(lèi)間基本同源的纖維蛋白肽B區(qū)域的序列組成的組， 其中制劑基本上沒(méi)有包含可檢測(cè)的纖維蛋白肽A。
35.權(quán)利要求34的制劑，進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的載體。
36.權(quán)利要求35的制劑，其中藥學(xué)上可接受的載體選自由水，油，食用油，脂肪酸，脂類(lèi)，多糖類(lèi)，纖維素，甘油，乙二醇，及其組合。
37.權(quán)利要求36的制劑，其中食用油是檸檬油，薄荷油，或葡萄籽油。
38.權(quán)利要求34的制劑，其被制成口服，經(jīng)粘膜，非腸道，淋巴，或靜脈施用。
39.權(quán)利要求34的制劑，其中生物活性形式的制劑以生理有效濃度被釋放到患者系統(tǒng)中。
40.權(quán)利要求34的制劑，其是一種膳食補(bǔ)充劑。
41.權(quán)利要求34的制劑，其從生物來(lái)源純化或合成制造。
42.治療或預(yù)防患者疾病的方法，包括提供包含纖維蛋白肽B或其片段，以及藥學(xué)上可接受的載體的組合物， 其中組合物基本不含能檢測(cè)的纖維蛋白肽A，其中纖維蛋白肽B或其片段來(lái)自非人的哺乳動(dòng)物；以及對(duì)患者施用一定劑量組合物，其中施用是經(jīng)粘膜的以使纖維蛋白肽B或其片段施用5 分鐘內(nèi)在患者淋巴系統(tǒng)中達(dá)到治療有效水平。
43.權(quán)利要求42的方法，其中患者是人。
44.權(quán)利要求42的方法，其中疾病是自身免疫性疾病。
45.權(quán)利要求44的方法，其中自身免疫性疾病選自由關(guān)節(jié)炎，克羅恩病，乳糜瀉，I型糖尿病，格雷夫癥，特發(fā)性血小板減少性紫癜，銀屑病，硬皮病，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，和潰瘍性結(jié)腸炎組成的組。
46.權(quán)利要求42的方法，其中疾病是免疫調(diào)節(jié)疾病。
47.權(quán)利要求46的方法，其中免疫調(diào)節(jié)疾病是過(guò)于活躍的免疫系統(tǒng)。
48.權(quán)利要求42的方法，其中單劑含有從0.Img至IOmg的活性成分。
49.哺乳動(dòng)物血清組分，其中組分包含多種成分，澄清無(wú)顆粒，基本所有成分分子量在約800道爾頓至約2300道爾頓范圍內(nèi)。
50.權(quán)利要求49的組分，其中哺乳動(dòng)物選自馬，貓，犬，牛，山羊，綿羊，和鼠組成的組。
全文摘要
從飼養(yǎng)動(dòng)物的血清中分離了一組肽并使用質(zhì)譜進(jìn)行鑒定。這些肽是纖維蛋白原激活和補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)副產(chǎn)品。有最大活性的肽是纖維蛋白肽A和纖維蛋白肽B的活性形式(通過(guò)去除末端精氨酸激活)，以及補(bǔ)體成分3的免疫調(diào)節(jié)片段。這些形式的纖維蛋白肽的A和B有顯著的免疫調(diào)節(jié)能力，能增強(qiáng)對(duì)包括各類(lèi)感染因子在內(nèi)的外來(lái)物質(zhì)的識(shí)別，降低炎癥反應(yīng)，防止血管外纖維蛋白沉積，刺激已經(jīng)沉積的纖維蛋白再吸收，增強(qiáng)身體識(shí)別和消滅腫瘤細(xì)胞的能力，降低包括過(guò)敏性鼻炎和休克在內(nèi)的過(guò)敏反應(yīng)癥狀，而且其能減少自身抗體復(fù)合物的形成和積累，改善慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的癥狀，并降低慢性疼痛綜合癥的癥狀。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102439175SQ201080020360
公開(kāi)日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2010年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月9日
發(fā)明者威德·M·梅林, 米歇爾·J·梅林 申請(qǐng)人:威德·M·梅林, 米歇爾·J·梅林