用于增強(qiáng)纖維素材料降解或轉(zhuǎn)化的方法

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專利名稱：：用于增強(qiáng)纖維素材料降解或轉(zhuǎn)化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用酶組合物增強(qiáng)纖維素材料降解或轉(zhuǎn)化的方法。相關(guān)領(lǐng)域描述纖維素是單糖葡萄糖通過(guò)β-1，4_鍵連接的聚合物。許多微生物產(chǎn)生水解β-連接的葡聚糖的酶。這些酶包括內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。內(nèi)切葡聚糖酶在隨機(jī)位置消化纖維素聚合物，將其打開(kāi)(openingit)以受到纖維二糖水解酶攻擊(attack)。纖維二糖水解酶繼而從纖維素聚合物的末端釋放纖維二糖的分子。纖維二糖是水溶性的β-1，4-連接的葡萄糖二聚體。葡糖苷酶將纖維二糖水解成葡萄糖。將含木素纖維素原料(lignocellulosicfeedstock)轉(zhuǎn)化為乙醇具有以下優(yōu)勢(shì)大量原料現(xiàn)成可用，避免燃燒或填埋材料的合意性和乙醇燃料的清潔性。木材、農(nóng)業(yè)殘余物、草本作物和城市固體廢物被認(rèn)為是用于乙醇生產(chǎn)的原料。這些材料主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成。一旦將纖維素轉(zhuǎn)化成葡萄糖，葡萄糖容易地由酵母發(fā)酵成乙醇。在本領(lǐng)域中，改善轉(zhuǎn)化纖維素原料的能力會(huì)是有利的。Nierman等，2005，Nature438:1151-1156公開(kāi)了煙曲霉(Aspergillusfumigatus)的基因組序列。本發(fā)明涉及用于降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的改善的酶組合物。發(fā)明概述本發(fā)明涉及降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法，包括在具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的存在下用酶組合物處理纖維素材料，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽選自下組(a)多肽，其包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少75%序列同一性的氨基酸序列；(b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在中-高嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)⑴或()的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(c)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少75%序列同一性的核苷酸序列；和(d)SEQIDNO2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的變體。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括(A)在具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的存在下用酶組合物糖化纖維素材料，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽選自下組(a)多肽，其包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少75%序列同一性的氨基酸序列；(b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在中-高嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)⑴或()的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(c)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少75%序列同一性的核苷酸序列；和(d)SEQIDNO2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的變體；(B)用一種或多種(幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵糖化的纖維素材料；(C)從發(fā)酵回收發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明還涉及發(fā)酵纖維素材料的方法，包括用一種或多種(幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵纖維素材料，其中所述纖維素材料是在具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的存在下用酶組合物糖化的，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽選自下組(a)多肽，其包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少75%序列同一性的氨基酸序列；(b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在中-高嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)⑴或()的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(c)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少75%序列同一性的核苷酸序列；和(d)SEQIDNO2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的變體。本發(fā)明還涉及酶組合物，其包含具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽和一種或多種(幾種)纖維素分解酶，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽選自下組(a)多肽，其包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少75%序列同一性的氨基酸序列；(b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在中-高嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)⑴或()的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(c)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少75%序列同一性的核苷酸序列；和(d)SEQIDNO2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的變體。附圖簡(jiǎn)述圖1顯示編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61B多肽的煙曲霉基因的基因組序列DNA序列和推定的氨基酸序列(分別為SEQIDNO=I和2)。圖2顯示pAG43的限制圖譜。圖3顯示在經(jīng)洗滌經(jīng)預(yù)處理的玉米秸稈(PCS)的水解中水解對(duì)添加至里氏木霉(Trichodermareesei)纖維素酶組合物的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的煙曲霉GH61B多肽濃度?？招娜?日程度的水解；實(shí)心圈-J日程度的水解。數(shù)據(jù)未就PCS液中存在的糖進(jìn)行校正。數(shù)據(jù)是用修飾的非合作的飽和結(jié)合模型(non-cooperativesaturation-bindingmodel)擬合的。定義纖維素分解增強(qiáng)活性術(shù)語(yǔ)“纖維素分解增強(qiáng)活性”意指增強(qiáng)具有纖維素分解活性的酶水解纖維素材料的由GH61催化的生物學(xué)活性。就本發(fā)明而言，通過(guò)測(cè)量由纖維素分解酶在下述條件下水解纖維素材料所導(dǎo)致的還原糖增加或纖維二糖與葡萄糖的總量增加來(lái)確定纖維素分解增強(qiáng)活性l_50mg總蛋白/gPCS中的纖維素，其中總蛋白包含50-99.5%w/w的纖維素分解酶蛋白，及0.5-50%w/w的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61多肽的蛋白質(zhì)，在50°C歷時(shí)1-7天，與用相等的總蛋白加載量而無(wú)纖維素分解增強(qiáng)活性(l-50mg纖維素分解蛋白/gPCS中的纖維素)所進(jìn)行的對(duì)照水解相比。在一個(gè)優(yōu)選的方面，使用在總蛋白重量的2-3%的米曲霉β-葡糖苷酶(根據(jù)WO02/095014在米曲霉中重組產(chǎn)生)或者總蛋白重量的2-3%的煙曲霉β-葡糖苷酶(如WO2002/095014所述在米曲霉中重組產(chǎn)生)的纖維素酶蛋白加載量存在下的CELLUCLAST1.5L(N0V0ZymeSA/S,Bagsvaerd,Denmark)的混合物作為纖維素分解活性的來(lái)源。具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61多肽通過(guò)降低達(dá)到相同水解水平所需的纖維素分解酶的量而增強(qiáng)由具有纖維素分解活性的酶催化的纖維素材料的水解，優(yōu)選降低至少1.01倍，更優(yōu)選至少1.05倍，更優(yōu)選至少1.10倍，更優(yōu)選至少1.25倍，更優(yōu)選至少1.5倍，更優(yōu)選至少2倍，更優(yōu)選至少3倍，更優(yōu)選至少4倍，更優(yōu)選至少5倍，甚至更優(yōu)選至少10倍，并且最優(yōu)選至少20倍。具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽具有至少20%，優(yōu)選至少40%，更優(yōu)選至少50%，更優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，且甚至最優(yōu)選至少100%的SEQIDNO:2的成熟多肽的多肽的纖維素分解增強(qiáng)活性。家族61糖苷水解酶術(shù)語(yǔ)“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”或“GH61”意指根據(jù)HenrissatB.,1991,Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities，Biochem.J.280:309_316，及HenrissatB.JfIBairochA.,1996,Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases,Biochem.J.316:695-696屬于糖苷水解酶家族61的多肽。纖維素分解酶或纖維素酶術(shù)語(yǔ)“纖維素分解酶”或“纖維素酶”意指一種或多種水解纖維素材料的酶。此類酶包括內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、β-葡糖苷酶或其組合。測(cè)量纖維素分解活性的兩種基本方法包括(1)測(cè)量總纖維素分解活性，和(測(cè)量單獨(dú)的纖維素分解活性(內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶)，如^iang等，Outlookforcellulaseimprovement:Screeningandselectionstrategies，2006，BiotechnologyAdvancesM:452-481所綜述的?？偫w維素分解活性通常是使用不溶性底物來(lái)測(cè)定的，所述底物包括WhatmanNo.1濾紙、微晶纖維素、細(xì)菌纖維素、藻類纖維素、棉花、經(jīng)預(yù)處理的木素纖維素等。最常見(jiàn)的總纖維素分解活性測(cè)定法是使用WhatmanNo.1濾紙作為底物的濾紙測(cè)定法。該測(cè)定法是由hternationalUnionofPureandAppliedChemistry(IUPAC)(Ghose,1987,Measurementofcellulaseactivities,PureAppl.Chem.59:257-68)石角立的。就本發(fā)明而言，纖維素分解酶活性通過(guò)測(cè)量在下述條件下由纖維素分解酶進(jìn)行的纖維素材料水解的增加來(lái)確定l_20mg的纖維素分解酶蛋白/g的PCS中纖維素在50°C進(jìn)行3-7日，與未添加纖維素分解酶蛋白的對(duì)照水解相比較。通常條件為1ml反應(yīng)液，經(jīng)洗滌或未洗滌的PCS，5%不溶性固形物，50mM乙酸鈉pH5,ImMMnSO4,50_65°C，72小時(shí)，通過(guò)AMINEXHPX-87H柱(Bio-RadLaboratories,Inc.，Hercules,CA,USA)進(jìn)行糖分析。內(nèi)切葡聚糖酶術(shù)語(yǔ)“內(nèi)切葡聚糖酶”意指內(nèi)切-1，4-(1，3;1，4)-3-0-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(endo-l，4-0-D-glucan4-glucanohydrolase)(Ε.C.3.2.1.4)，其催化纖維素、纖維素衍生物(例如羧甲基纖維素和羥乙基纖維素)、地衣淀粉(Iichenin)中的l，4-i3-D-糖苷鍵、混合的β_1，3葡聚糖例如谷類β-D-葡聚糖或木葡聚糖和含有纖維素組分的其它植物材料中的β_1，4鍵的內(nèi)水解(endohydrolysis)。內(nèi)切葡聚糖酶活性可通過(guò)測(cè)量底物粘度的減少或由還原糖測(cè)定法Oiang等，2006，BiotechnologyAdvances24452-481)確定的還原端增加來(lái)確定。就本發(fā)明而言，根據(jù)(ihose，1987，PureandAppl.Chem.59:257-268的方法，在pH5，40°C，使用羧甲基纖維素(CMC)作為底物來(lái)確定內(nèi)切葡聚糖酶活性。纖維二糖水解酶術(shù)語(yǔ)“纖維二糖水解酶”意指1，4-β-D-葡聚糖纖維二糖水解酶(1,4-beta-D-glucancellobiohydrolase)(Ε.C.3.2.1.91)，其催化纖維素、纖維素寡糖，或任何包含β-1，4-連接的葡萄糖的聚合物中的l，4-i3-D-糖苷鍵的水解，從鏈的還原或非還原末端釋放纖維二糖(Teeri，1997，Crystallinecellulosedegradation:Newinsightintothefunctionofce1lobiohydrolases,TrendsinBiotechnology15160-167;Teeri等，1998,Trichodermareeseicellobiohydrolases:whysoefficientoncrystallinecellulose？,Biochem.Soc.Trans.26:173-178)。就本發(fā)明而言，根據(jù)Lever等，1972,Anal.Biochem.47:273-279；vanTilbeurgh等，1982,FEBSLetters,149152-156；vanTilbeurgh禾口Claeyssens，1985，F(xiàn)EBSLetters，187:283-288；以及Tomme等，1988，Eur.J.Biochem.170:575-581描述的方法測(cè)定纖維二糖水解酶活性。在本發(fā)明中，可采用Lever等的方法來(lái)評(píng)價(jià)玉米秸稈中的纖維素分解，而vanTilbeurgh等和Tomme等的方法可用于確定對(duì)熒光二糖衍生物4-甲基傘形基-β-D-乳糖苷G-methylumbelIiferyl-β-D-lactoside)的纖維二糖水解酶活性。β-葡糖苷酶術(shù)語(yǔ)“β-葡糖苷酶”意指β-D-葡糖苷葡糖水解酶(beta-D-glucosideglucohydrolase)(Ε.C.No.3.2.1.21)，其催化末端非還原β-D-葡萄糖殘基的水解，并釋放β-D-葡萄糖。就本發(fā)明而言，根據(jù)Venturi等，2002，Extracellularbeta-D-glucosidasefromChaetomiumthermophilumvar.coprophilum!production,purificationandsomebiochemicalproperties,J.BasicMicrobiol.42:55-66^基本方法確定葡糖苷酶活性。一個(gè)單位的葡糖苷酶活性定義為在25°C，pH4.8，在含有0.01%TWEEN20的50mM檸檬酸鈉中從作為底物的ImM對(duì)硝基苯基-β-D-葡糖吡喃糖苷每分鐘產(chǎn)生1.0微摩爾對(duì)硝基苯酚陰離子。半纖維素分解酶或半纖維素酶術(shù)語(yǔ)“半纖維素分解酶”或“半纖維素酶”意指一種或多種(幾種)分解半纖維素材料的酶。參見(jiàn)，例如Siallom，D.和Sioham，Y.Microbialhemicellulases.CurrentOpinionInMicrobiology,2003,6(3):219-228)。半纖維素酶是植物生物質(zhì)降解中的關(guān)鍵成分。半纖維素酶的實(shí)例包括但不限于乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。這些酶的底物，半纖維素，是支化和直鏈多糖的混雜基團(tuán)，這些多糖通過(guò)氫鍵鍵合于植物細(xì)胞壁中的纖維素微纖維，將它們交聯(lián)為魯棒(robust)的網(wǎng)絡(luò)。半纖維素酶亦共價(jià)地附接于木質(zhì)素，與纖維素一同形成高度復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。半纖維素的可變的結(jié)構(gòu)和組織形式需要許多酶的協(xié)同作用使其完全降解。半纖維素酶的催化模塊為水解糖苷鍵的糖苷水解酶(GH)，或水解乙酸或阿魏酸側(cè)基酯鍵的糖酯酶(CE)。這些催化模塊，基于其一級(jí)結(jié)構(gòu)的同源性，可分類為以數(shù)字標(biāo)記的GH和CE家族。一些家族，具有總體上類似的折疊，可進(jìn)一步歸類為宗族(clan)，以字母標(biāo)記(例如，GH-A)。最具信息性和更新的這些和其他糖活性酶的分類可在Carbohydrate-ActiveEnzymes(CAZy)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得。半纖維素分解酶活性可根據(jù)(ihose和Bisaria,1987，Pure&AppI.Chem.59:1739-1752測(cè)量。木聚糖降解活性或木聚糖分解活性術(shù)語(yǔ)“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”意指水解含木聚糖材料的生物學(xué)活性。兩種測(cè)定木聚糖分解活性的基礎(chǔ)方法包括(1)測(cè)量總木聚糖分解活性，和(測(cè)量單獨(dú)的木聚糖分解活性(例如內(nèi)切木聚糖酶、木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶和α-葡糖醛酸酯酶(α-glucuronylesterase)).最近在木聚糖分解酶測(cè)定法的進(jìn)展總結(jié)于幾個(gè)公開(kāi)文獻(xiàn)中，包括Biely禾口Puchard，Recentprogressintheassaysofxylanolyticenzymes,2006,JournaloftheScienceofFoodandAgriculture86(11):1636-1647；Spanikova禾口Biely，2006，Glucuronoylesterase-NovelcarbohydrateesteraseproducedbySchizophyllumcommune，F(xiàn)EBSLetters580(19):4597-4601；Herrmann，Vrsanska，Jurickova，Hirsch，Biely禾口Kubicek，1997，Thebeta-D-xylosidaseofTrichodermareeseiisamultifunctionalbeta-D-xylanxylohydrolase,BiochemicalJournal321375-381?？偰揪厶墙到饣钚钥赏ㄟ^(guò)確定從多種類型的木聚糖形成的還原糖來(lái)測(cè)量，所述木聚糖包括例如燕麥小麥(oatspelt)、山毛櫸木(beechwood)和落葉松木(Iarchwood)木聚糖，或者可通過(guò)光度法確定從多種共價(jià)染色的木聚糖釋放出的染色的木聚糖片段來(lái)測(cè)量。最常見(jiàn)的總木聚糖分解活性測(cè)定法基于從多聚的4-0-甲基葡糖醛酸木聚糖產(chǎn)生還原糖,如Bailey,Biely,Poutanen,1992,Interlaboratorytestingofmethodsforassayofxylanaseactivity,JournalofBiotechnology23(3):257-270中所述。木聚糖酶活性亦可用0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖作為底物在0.01%TritonX-100和200mM磷酸鈉緩沖液PH6中在37°C確定。一個(gè)單位的木聚糖酶活性定義為在37°C，pH6在200mM磷酸鈉PH6緩沖液中從作為底物的0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖每分鐘產(chǎn)生1.O微摩爾的天青精(azurine)。就本發(fā)明而言，木聚糖降解活性是通過(guò)測(cè)量由木聚糖降解酶在下述通常條件下造成的樺木木聚糖(SigmaChemicalCo.，Inc.，St.Louis,MO,USA)水解的增加來(lái)確定的Iml反應(yīng)液，5mg/ml底物(總固形物)，5mg木聚糖分解蛋白質(zhì)/g底物，50mM乙酸鈉，pH5,50°C,24小時(shí)，如Lever,1972,Anewreactionforcolorimetricdeterminationofcarbohydrates,Anal.Biochem47:273-279所述使用對(duì)羥基苯甲酸酰胼(PHBAH)測(cè)定法進(jìn)行糖分析。木聚糖酶術(shù)語(yǔ)“木聚糖酶”意指催化木聚糖中1，4_β-D-木糖苷鍵的內(nèi)水解的1，4-β-D-木聚糖-木糖水解酶(Ε.C.3.2.1.8)。就本發(fā)明而言，木聚糖酶活性是使用0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖作為底物在0.01%TritonX-100和200mM磷酸鈉緩沖液pH6中在37°C進(jìn)行確定的。一個(gè)單位的木聚糖酶活性定義為在37°C，pH6在200mM磷酸鈉pH6緩沖液中從作為底物的0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖每分鐘產(chǎn)生1.0微摩爾的天青精(azurine)。β-木糖苷酶術(shù)語(yǔ)“β-木糖苷酶”意指β-D木糖苷木糖水解酶(β-D-xylosidexylohydrolase)(Ε.C.3.2.1.37)，其催化短β(1—4)木寡糖(xylooligosaccharide)的外水解以從非還原端去除連續(xù)的D-木糖殘基。就本發(fā)明而言，一個(gè)單位的木糖苷酶定義為在40°C，pH5從ImM對(duì)硝基苯基-β-D-木糖苷作為底物在含有0.01%TWEEN20的IOOmM檸檬酸鈉中每分鐘產(chǎn)生1.0微摩爾對(duì)硝基苯酚陰離子。乙酰木聚糖酯酶術(shù)語(yǔ)“乙酰木聚糖酯酶”意指羧基酯酶(EC3.1.1.72)，其催化乙酰基從聚合木聚糖、乙?；咎?、乙?；咸烟?、乙酸α-萘酯(alpha-napthylacetate)和乙酸對(duì)硝基苯酯(p-nitrophenylacetate)的水解。就本發(fā)明而言，乙酰木聚糖酯酶活性是使用0.5mM乙酸對(duì)硝基苯酯作為底物，在含有0.01%TWEEN20的50mM乙酸鈉pH5.0中確定的。一個(gè)單位的乙酰木聚糖酯酶定義為能夠在pH5，25°C每分鐘釋放1微摩爾對(duì)硝基苯酚陰離子(p-nitrophenolateanion)的酶量。阿魏酸酯酶術(shù)語(yǔ)“阿魏酸酯酶(feruloylesterase)，，意指4_羥基_3_甲氧基肉桂酰-糖水解酶(EC3.1.1.73)，其催化4-羥基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基團(tuán)從酯化的糖(其在“天然”底物中通常為阿拉伯糖)的水解，以產(chǎn)生阿魏酸(4-羥基-3-甲氧基肉桂酸)。阿魏酸酯酶也稱作阿魏酸酯酶(ferulicacidesterase)、羥基肉桂酰酯酶、FAE-III、肉桂酸酯水解酶、FAEA,cirmAE、FAE-I或FAE-II。就本發(fā)明而言，阿魏酸酯酶是使用50mM乙酸鈉pH5.0中的0.5mM阿魏酸對(duì)硝基苯酯作為底物確定的。一個(gè)單位的阿魏酸酯酶等于能夠在PH5，25°C每分鐘釋放1微摩爾對(duì)硝基苯酚陰離子的酶量。α-葡糖醛酸糖苷酶術(shù)語(yǔ)“α-葡糖醛酸糖苷酶”意指α_D_葡糖苷酸葡糖醛酸水角軍_(alpha-D-glucosiduronateglucuronohydrolaseactivity)(EC3.2.1.139)，其催化α-D-葡糖醛酸糖苷水解為D-葡糖醛酸和醇。就本發(fā)明而言，α-葡糖醛酸糖苷酶活性是根據(jù)deVries,1998,J.Bacteriol.180:243-249確定的。一個(gè)單位的α-葡糖醛酸糖苷酶等于能夠在PH5，40°C每分鐘釋放出1微摩爾葡糖醛酸或4-0-甲基葡糖醛酸的酶量。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶術(shù)語(yǔ)“α_L_阿拉伯呋喃糖苷酶活性”意指α_L_阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃糖水解酶(EC3.2.1.55)，其催化對(duì)α-L-阿拉伯糖苷中的末端非還原性α-L-阿拉伯呋喃糖苷殘基的水解。該酶對(duì)α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1，3)_和/或(1，5)_鍵的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖起作用。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶也稱為阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶或α-L-阿拉伯聚糖酶。就本發(fā)明而言，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性是使用總體積200μ1中的每ml的IOOmM乙酸鈉pH5中5mg的中等粘性小麥阿拉伯木聚糖(MegazymeInternationalIreland,Ltd.，Bray,Co.Wicklow，Ireland)在40°C進(jìn)行30分鐘，接著通過(guò)AMINEXHPX-87H柱層析(Bio-fcidLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)的阿拉伯糖分析來(lái)確定的。纖維素材料纖維素材料可以是包含纖維素的任何材料。生物質(zhì)的初生細(xì)胞壁(primarycellwall)中的主要多糖是纖維素，其次最豐富的是半纖維素，而第三是果膠。次生細(xì)胞壁(secondarycellwall)在細(xì)胞停止生長(zhǎng)后產(chǎn)生，其同樣含有多糖并通過(guò)共價(jià)交聯(lián)至半纖維素的聚合木質(zhì)素而加強(qiáng)。纖維素是脫水纖維二糖的均聚物，并且因此是直鏈β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纖維素包括多種化合物，例如木聚糖、木葡聚糖(xyloglucan)、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，具有系列取代基的復(fù)雜分支結(jié)構(gòu)。盡管通常是多形的，存在于植物組織中的纖維素主要是平行葡聚糖鏈的不溶晶體基質(zhì)。半纖維素通常與纖維素以及其它半纖維素以氫鍵相連，其幫助穩(wěn)定細(xì)胞壁基質(zhì)。纖維素通常見(jiàn)于例如植物的莖、葉、殼、皮和穗軸，或樹的葉、枝和木材。纖維素材料可以是，但不限于，草本材料、農(nóng)業(yè)殘余物、林業(yè)殘余物、城市固體廢物、廢紙和紙漿與造紙廠殘余物(參見(jiàn)，例如，Wiselogel等，1995，于HandbookonBioethanol(CharlesΕ·Wyman編)，PP.105-118,Taylor&Francis,WashingtonD.C.；ffyman,1994,BioresourceTechnology50:3-16；Lynd,1990,AppliedBiochemistryandBiotechnology24/25695-719;Mosier等，，1999,RecentProgressinBioconversionofLignocellulosics,于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,T.Scheper主編，Volume65,pp.23-40，Springer-Verlag，NewYork)。在本文中應(yīng)理解的是，纖維素可以是木素纖維素的形式，在混合基質(zhì)中包含木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的植物細(xì)胞壁材料。在一個(gè)優(yōu)選的方面，纖維素材料是木素纖維素，其包含纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。在一個(gè)方面，纖維素材料是草本材料。在另一個(gè)方面，纖維素材料是農(nóng)業(yè)殘余物。在另一個(gè)方面，纖維素材料是林業(yè)殘余物。在另一個(gè)方面，纖維素材料是城市固體廢物。在另一個(gè)方面，纖維素材料是廢紙。在另一個(gè)方面，纖維素材料是紙漿和造紙廠殘余物。在另一個(gè)方面，纖維素材料是玉米秸稈。在另一個(gè)方面，纖維素材料是玉米纖維。在另一個(gè)方面，纖維素材料是玉米穗軸。在另一個(gè)方面，纖維素材料是橙皮。在另一個(gè)方面，纖維素材料是稻桿。在另一個(gè)方面，纖維素材料是麥桿。在另一個(gè)方面，纖維素材料是柳枝稷(switchgrass)。在另一個(gè)方面，纖維素材料是芒草屬。在另一個(gè)方面，纖維素材料是甘蔗渣。在另一個(gè)方面，纖維素材料是微晶纖維素。在另一個(gè)方面，纖維素材料是細(xì)菌纖維素。在另一個(gè)方面，纖維素材料是藻類纖維素。在另一個(gè)方面，纖維素材料是棉線頭(cottonlinter)。在另一個(gè)方面，纖維素材料是無(wú)定形的磷酸處理的纖維素。在另一個(gè)方面，纖維素材料是濾紙。纖維素材料可以直接使用或進(jìn)行預(yù)處理，使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法，如本文所述。在一個(gè)優(yōu)選的方面，預(yù)處理纖維素材料。預(yù)處理的玉米秸稈術(shù)語(yǔ)“PCS”或“預(yù)處理的玉米秸稈”意指通過(guò)用熱和稀硫酸處理的源自玉米秸稈的纖維素材料。分離的或純化的術(shù)語(yǔ)“分離的”和“純化的”意指從與其天然結(jié)合的至少一種組分移出的多肽或多核苷酸。例如，多肽如通過(guò)SDS-PAGE測(cè)定的，可為至少純，例如至少5%純，至少10%純，至少20%純，至少40%純，至少60%純，至少80%純，或至少90%純，或至少95%純，而多核苷酸如通過(guò)瓊脂糖電泳測(cè)定的，可為至少純，例如至少5%純，至少10%純，至少20%純，至少40%純，至少60%純，至少80%純，至少90%純，或至少95%純。成熟多肽術(shù)語(yǔ)“成熟多肽”意指以其在翻譯和任何翻譯后修飾之后的最終形式存在的多肽，所述修飾如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在本領(lǐng)域中已知宿主細(xì)胞可產(chǎn)生由相同多核苷酸表達(dá)的兩種或更多種不同成熟多肽的混合物(即，具有不同的C-端和/或N-端氨基酸)。在一個(gè)方面，根據(jù)預(yù)測(cè)SEQIDNO2的氨基酸1至21是信號(hào)肽的SignalP軟件(Nielsen等，1997，ProteinEngineering101-6)，成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸22至250。成熟多肽編碼序列術(shù)語(yǔ)“成熟多肽編碼序列”在本文中定義為編碼具有生物活性的成熟多肽的核苷酸序列。在一個(gè)方面，根據(jù)預(yù)測(cè)SEQIDNO:1的核苷酸1至63編碼信號(hào)肽的SignalP軟件(Nielsen等，1997，見(jiàn)上)，成熟多肽編碼序列是SEQIDNO=I的核苷酸64至859。在另一個(gè)方面，所述成熟多肽編碼序列是包含于SEQIDNO:1的核苷酸64至859中的cDNA序列。序列同一性參數(shù)“序列同一性”描述兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核苷酸序列之間的相關(guān)性。就本發(fā)明而言，兩個(gè)氨基酸序列之間的序列同一性程度使用如EMBOSS軟件包(EMBOSSTheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000，TrendsGenet.16:276-277)，優(yōu)選3.0.0版或更高版本的Needle程序中所執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48:443-453)來(lái)測(cè)定。使用的可選參數(shù)為缺口罰分(gappenalty)10，缺口延伸罰分(gapextensionpenalty)0.5和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版)取代矩陣。使用Needle標(biāo)記為“最長(zhǎng)同一性(longestidentity)”的輸出結(jié)果(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)作為同一性百分比，并計(jì)算如下(同樣的殘基X100)/(比對(duì)長(zhǎng)度-比對(duì)中缺口的總數(shù))就本發(fā)明而言，兩個(gè)核苷酸序列之間的序列同一性程度使用如EMBOSS軟件包(EMBOSSTheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000，見(jiàn)上文)，優(yōu)選3.0.0版或更高版本的Needle程序中所執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和mmsch，1970，見(jiàn)上文)來(lái)測(cè)定。使用的可選參數(shù)為缺口罰分10，缺口延伸罰分0.5和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版)取代矩陣。使用Needle標(biāo)記為“最長(zhǎng)同一性”的輸出結(jié)果(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)作為同一性百分比，并計(jì)算如下(同樣的脫氧核糖核苷酸X100)/(比對(duì)長(zhǎng)度-比對(duì)中缺口的總數(shù))多肽片段術(shù)語(yǔ)“多肽片段”意指從成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的多肽；其中所述片段具有生物活性。在一個(gè)方面，片段含有SEQIDNO2的成熟多肽的至少200個(gè)氨基酸殘基，例如至少210個(gè)氨基酸殘基或至少220個(gè)氨基酸殘基。亞序列術(shù)語(yǔ)“亞序列(subsequence)，，意指從成熟多肽編碼序列的5’和/或3’端缺失一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))核苷酸的多核苷酸；其中所述亞序列編碼具有生物活性的片段。在一個(gè)方面，亞序列含有SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的至少600個(gè)核苷酸，例如至少630個(gè)核苷酸或至少660個(gè)核苷酸。等位變體(allelicvariant)術(shù)語(yǔ)“等位變體”在本文中表示占據(jù)相同染色體基因座的基因的任何兩種或更多種(幾種)可選形式。等位變異通過(guò)突變天然地發(fā)生，并且可導(dǎo)致種群內(nèi)的多態(tài)性。基因突變可以是沉默的(在編碼的多肽中無(wú)變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。編碼序列術(shù)語(yǔ)“編碼序列”意指直接指定多肽氨基酸序列的多核苷酸。編碼序列的邊界通常由開(kāi)讀框確定，所述開(kāi)讀框通常以ATG起始密碼子或可替換的起始密碼子例如GTG和TTG開(kāi)始，并且以終止密碼子例如TAA、TAG和TGA結(jié)束。編碼序列可以是DNA、cDNA、合成的或重組的多核苷酸。cDNA術(shù)語(yǔ)“cDNA”意指能夠通過(guò)反轉(zhuǎn)錄從得自真核細(xì)胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制備的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相應(yīng)基因組DNA中的內(nèi)含子序列。起始的(initial)、初級(jí)的RNA轉(zhuǎn)錄物是mRNA的前體，其通過(guò)一系列的包括剪接的步驟加工然后作為成熟的已剪接的mRNA出現(xiàn)。核酸構(gòu)建體術(shù)語(yǔ)“核酸構(gòu)建體”意指單鏈或雙鏈的核酸分子，其分離自天然存在的基因，或受修飾以本來(lái)不存在于(nototherwiseexist)自然界中的方式含有核酸的區(qū)段，或其為合成的。當(dāng)所述核酸構(gòu)建體含有表達(dá)本發(fā)明的編碼序列所需的調(diào)控序列時(shí)，術(shù)語(yǔ)核酸構(gòu)建體與術(shù)語(yǔ)“表達(dá)盒”同義。調(diào)控序列(controlsequence)術(shù)語(yǔ)“調(diào)控序列”意指對(duì)編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的表達(dá)是必需的所有組分。各個(gè)調(diào)控序列對(duì)于編碼所述多肽的多核苷酸可以是天然的或外源的，或各個(gè)調(diào)控序列對(duì)于彼此可以是天然的或外源的。這些調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動(dòng)子、信號(hào)肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最少的情況，調(diào)控序列包括啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號(hào)。調(diào)控序列可以和用于引入特異性限制位點(diǎn)的接頭一起提供，所述特異性限制位點(diǎn)促進(jìn)調(diào)控序列與編碼多肽的多核苷酸編碼區(qū)的連接。可操作地連接術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”意指這樣的構(gòu)型，其中將調(diào)控序列置于相對(duì)于多核苷酸的編碼序列的適當(dāng)位置，使得調(diào)控序列指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)。表達(dá)術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟，其包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。表達(dá)載體術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”意指線性的或環(huán)狀的DNA分子，其包含編碼多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸與提供用于其表達(dá)的額外核苷酸可操作地連接。宿主細(xì)胞“宿主細(xì)胞”意指任何細(xì)胞類型，所述細(xì)胞類型對(duì)于使用包含本發(fā)明多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等是易感的(susceptible)。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”涵蓋親本細(xì)胞的任何后代，所述后代由于在復(fù)制中發(fā)生的突變與親本細(xì)胞不完全相同。變體術(shù)語(yǔ)“變體”意指具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽，其包含改變，即在一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))位置的取代、插入和/或缺失一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸殘基。取代意指用不同的氨基酸取代占據(jù)位置的氨基酸；缺失意指去除占據(jù)位置的氨基酸；而插入意指鄰接于占據(jù)位置的氨基酸添加一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸，例如1-5個(gè)氨基酸。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法，包括在具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的存在下用酶組合物處理纖維素材料，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽選自下組(a)多肽，其包含與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少75%序列同一性的氨基酸序列；(b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在中-高嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(c)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少75%序列同一性的核苷酸序列；和(d)SEQIDNO:2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的變體。在一個(gè)方面，上述方法進(jìn)一步包括回收經(jīng)降解或轉(zhuǎn)化的纖維素材料?？墒褂帽绢I(lǐng)域公知技術(shù)例如離心、過(guò)濾和重力沉降來(lái)將纖維素材料降解或轉(zhuǎn)化的可溶產(chǎn)物與不可溶的纖維素材料分離。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括(A)在具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的存在下用酶組合物糖化纖維素材料，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽選自下組(a)多肽，其包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少75%序列同一性的氨基酸序列；(b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在中-高嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(c)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少75%序列同一性的核苷酸序列；和(d)SEQIDNO:2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的變體；(B)用一種或多種(幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵糖化的纖維素材料；和(C)從發(fā)酵回收發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明還涉及發(fā)酵纖維素材料的方法，包括用一種或多種(幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵纖維素材料，其中所述纖維素材料是在具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的存在下用酶組合物糖化的，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽選自下組(a)多肽，其包含與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少75%序列同一性的氨基酸序列；(b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在中-高嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(c)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少75%序列同一性的核苷酸序列；和(d)SEQIDNO:2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的變體。在一個(gè)優(yōu)選的方面，纖維素材料的發(fā)酵產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述方法還包括從發(fā)酵回收發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明還涉及酶組合物，其包含具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽和一種或多種(幾種)纖維素分解酶，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽選自下組(a)多肽，其包含與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少75%序列同一性的氨基酸序列；(b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在中-高嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(c)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少75%序列同-性的核苷酸序列；和(d)SEQIDNO2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的變體。酶組合物在本發(fā)明的方法中，酶組合物可包含任何可用于降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的蛋白。在一個(gè)方面，酶組合物包含一種或多種(幾種)纖維素分解酶。在另一個(gè)方面，酶組合物包含或進(jìn)一步包含一種或多種(幾種)半纖維素分解酶。在另一個(gè)方面，酶組合物包含一種或多種(幾種)纖維素分解酶和/或一種或多種(幾種)半纖維素分解酶。在另一個(gè)方面，酶組合物包含選自纖維素分解酶和半纖維素分解酶的組的一種或多種(幾種)酶。在另一個(gè)方面，酶組合物包含一種或多種(幾種)選自下組的纖維素分解酶內(nèi)切葡聚糖酶，纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。在另一個(gè)方面，酶組合物包含或進(jìn)一步包含一種或多種(幾種)選自下組的蛋白半纖維素酶，棒曲霉素(expansin)，酯酶，木質(zhì)素分解酶(ligninolyticenzyme)，果膠酶，過(guò)氧化物酶，蛋白酶和膨脹素(swollenin)。半纖維素酶優(yōu)選為一種或多種(幾種)選自下組的酶乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。在另一個(gè)方面，酶組合物包含內(nèi)切葡聚糖酶。在另一個(gè)方面，酶組合物包含纖維二糖水解酶。在另一個(gè)方面，酶組合物包含β-葡糖苷酶。在另一個(gè)方面，酶組合物包含乙酰甘露聚糖酯酶。在另一個(gè)方面，酶組合物包含乙酰木聚糖酯酶。在另一個(gè)方面酶組合物包含阿拉伯聚糖酶(例如α-L-阿拉伯聚糖酶)。在另一個(gè)方面，酶組合物包含阿拉伯呋喃糖苷酶(例如α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶)。在另一個(gè)方面，酶組合物包含香豆酸酯酶。在另一個(gè)方面，酶組合物包含阿魏酸酯酶。在另一個(gè)方面，酶組合物包含半乳糖苷酶(例如，α-半乳糖苷酶和/或β-半乳糖苷酶)。在另一個(gè)方面，酶組合物包含葡糖醛酸糖苷酶(例如，α-D-葡糖醛酸糖苷酶)。在另一個(gè)方面，酶組合物包含葡糖醛酸酯酶。在另一個(gè)方面，酶組合物包含甘露聚糖酶。在另一個(gè)方面，酶組合物包含甘露糖苷酶(例如甘露糖苷酶)。在另一個(gè)方面，酶組合物包含木聚糖酶。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述木聚糖酶為家族10木聚糖酶。在另一個(gè)方面，酶組合物包含木糖苷酶。在另一個(gè)方面，酶組合物包含棒曲霉素。在另一個(gè)方面，酶組合物包含酯酶。在另一個(gè)方面，酶組合物包含木質(zhì)素分解酶。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述木質(zhì)素分解酶為漆酶。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述木質(zhì)素分解酶是錳過(guò)氧化物酶。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述木質(zhì)素分解酶是木質(zhì)素過(guò)氧化物酶。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述木質(zhì)素分解酶是H2O2產(chǎn)生酶。在另一個(gè)方面，酶組合物包含果膠酶。在另一個(gè)方面，酶組合物包含過(guò)氧化物酶。在另一個(gè)方面，酶組合物包含蛋白酶。在另一個(gè)方面，酶組合物包含膨脹素(swollenin)。在本發(fā)明的方法中，酶可在發(fā)酵之前或過(guò)程中添加，例如在糖化過(guò)程中或在發(fā)酵微生物繁殖過(guò)程中或之后添加。所述酶組合物的一種或多種(幾種)組分可為野生型蛋白、重組蛋白或野生型蛋白和重組蛋白的組合。例如，一種或多種(幾種)組分可為細(xì)胞的天然蛋白，其用作宿主細(xì)胞以重組表達(dá)酶組合物的一種或多種(幾種)其他組分。酶組合物的一種或多種(幾種)組分可作為單組分產(chǎn)生，然后將其組合以形成酶組合物。所述酶組合物可為多組分和單組分蛋白制備物的組合。用于本發(fā)明方法中的酶可為任何適于使用的形式，例如去除或未去除細(xì)胞的粗發(fā)酵液，具有或不具有細(xì)胞碎片的細(xì)胞裂解液，半純化或純化的酶制備物，或宿主細(xì)胞，作為酶的來(lái)源。所述酶組合物可為干粉或顆粒，無(wú)粉塵的顆粒，液體，穩(wěn)定化液體或穩(wěn)定化受保護(hù)的酶。液體酶制備物可根據(jù)確立的工藝，例如通過(guò)添加穩(wěn)定劑如糖、糖醇或其他多元醇，和/或乳酸或其他有機(jī)酸來(lái)穩(wěn)定化。酶可源自或獲得自任何合適的來(lái)源，包括細(xì)菌、真菌、酵母、植物或哺乳動(dòng)物來(lái)源。術(shù)語(yǔ)“獲得”在本文中意指該酶可從天然產(chǎn)生該酶作為天然酶的生物分離。術(shù)語(yǔ)“獲得”在本文中還意指該酶可在宿主生物中使用本文中所述的方法重組產(chǎn)生，其中經(jīng)重組產(chǎn)生的酶對(duì)于宿主生物是天然的或異源的，或具有修飾的氨基酸序列，例如，具有一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))缺失、插入和/或取代的氨基酸，即重組產(chǎn)生的酶，其為天然氨基酸序列的片段和/或突變體或通過(guò)本領(lǐng)域已知的氨基酸改組方法產(chǎn)生的酶。天然酶的含義中涵蓋的是天然變體，而外來(lái)酶的含義中涵蓋的是重組(如通過(guò)定位誘變或重排)獲得的變體具有酶活性的多肽可以是細(xì)菌多肽。例如，所述多肽可以是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌多肽如芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈球菌屬(Str印tococcus)、鏈霉菌屬(Str印tomyces)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)>IflifM(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、梭菌屬(Clostridium)、地芽孢桿菌屬(Geobacillus)或海洋芽孢桿菌屬(Oceanobacillus)多肽，所述多肽具有酶活性；或革蘭氏陰性細(xì)菌多肽，如大腸桿菌、假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙門氏菌屬(Salmonella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)^Uf菌屬(Helicobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)>iMlfliiM(IlycAacter)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)或脲原體屬⑴reaplasma)多肽，所述多肽具有酶活性。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是具有酶活性的嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)、!牟lif(Bacillusamyloliquefaciens)lif(Bacillusbrews)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillusclausii)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillusfirmus)、燦爛芽孢桿菌(Bacilluslautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、嗜熱月旨肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)或蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)多肽。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是具有酶活性的似馬鏈球菌(Streptococcusequisimilis)、酉良月農(nóng)鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、乳房鏈球菌(Streptococcusuberis)或馬鏈球菌獸癌亞禾中(Streptococcusequisubsp.Zooepidemicus)多月太。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是具有酶活性的不產(chǎn)色鏈霉菌(Str印tomycesachromogenes)、除蟲鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)、天藍(lán)鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)、灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)或淺青紫鏈霉菌(Streptomyceslividans)多月太。具有酶活性的多肽也可以是真菌多肽，并且更優(yōu)選酵母多肽如假絲酵16母屬(Candida)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉屬(Yarrowia)多肽，其具有酶活性；或更優(yōu)選絲狀真菌多肽如枝頂孢霉屬(Acremonium)、傘菌屬(Agaricus)、鏈格孢屬(Alternaria)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、Botryospaeria、擬錯(cuò)菌屬(Ceriporiopsis)、毛_殼屬(Chaetomidium)、金抱子菌屬(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼傘屬(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊殼屬(Corynascus)、隱叢赤殼菌屬(Cryphonectria)、隱球菌屬(Cryptococcus)、色二孢屬(Diplodia)、黑耳屬(Exidia)、Filibasidium.鐮孢屬(Fusarium)、赤霉屬(Gibberella)、全鞭毛蟲屬(Holomastigotoides)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、耙齒菌屬(Irpex)λMSM(Lentinula)、Leptospaeria、梨抱菌屬(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌屬(Meripilus)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、新考瑪脂霉屬(Neocallimastix)、脈抱菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、平革菌屬(Phanerochaete)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、Poitrasia、假漂盤菌屬(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉屬(Rhizomucor)、裂褶菌屬(Schizophyllum)、柱頂孢屬(Scytalidium)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(fThielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、木霉屬CTrichoderma)、長(zhǎng)毛盤菌屬(Trichophaea)、輪枝孢屬(Verticillium)、包腳菇屬(Volvariella)或炭角菌屬(Xylaria)多肽，其具有酶活性。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是具有酶活性的卡爾酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、克魯弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、諾地酵母(Saccharomycesnorbensis)或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)多月太。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是具有酶活性的解纖維枝頂孢霉(Acremoniumcellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、曰本曲霉(Aspergillusjaponicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)、漂曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、嗜角質(zhì)金抱子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、金抱子菌(Chrysosporiumpannicola)、Chrysosporiumqueenslandicum、Chrysosporiumzonatum、桿孢狀鐮孢(Fusariumbactridioides)、禾谷鐮孢(Fusariumcerealis)、庫(kù)威鐮孢(Fusariumcrookwellense)、大刀德抱(Fusariumculmorum)、禾本禾斗德抱(Fusariumgraminearum)、禾赤德抱(Fusariumgraminum)、異抱德抱(Fusariumheterosporum)、合歡木德抱(Fusariumnegundi)、尖德抱(Fusariumoxysporum)、多枝德抱(Fusariumreticulatum)、粉紅德抱(Fusariumroseum)、接骨木德抱(Fusariumsambucinum)、膚色德抱(Fusariumsarcochroum)、擬分枝抱德抱(Fusariumsporotrichioides)、硫色,廉抱(Fusariumsulphureum)、圓德抱(Fusariumtorulosum)、擬絲抱,廉抱(Fusariumtrichothecioides)、壤片德抱(Fusariumvenenatum)、灰腐質(zhì)霉(Humicolagrisea)、特異腐質(zhì)毒(Humicolainsolens)、疏棉狀腐質(zhì)毒(Humicolalanuginosa)、白奉巴齒菌(Irpexlacteus)、^■€#(Mucormiehei)、口f%gig_(Myceliophthorathermophila)、粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)、繩狀青霉(Penicilliumfuniculosum)、產(chǎn)紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黃包平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、無(wú)色梭包殼(Thielaviaachromatica)、Thielaviaalbomyces、Thielaviaalbopilosa、澳洲梭抱殼(Thielaviaaustraleinsis)、Thielaviafimeti、小抱梭抱殼(Thielaviamicrospora)、卵抱梭抱殼(Thielaviaovispora)、Thielaviaperuviana、瘤抱梭抱殼(Thielaviaspededonium))^(Thielaviasetosa)、Thielaviasubthermophila、zhtMJfe_(Thielaviaterrestris)λ3^^7^(Trichodermaharzianum)(Trichodermakoningii)、長(zhǎng)枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichodermareesei)(Trichodermaviride)Trichophaeasaccat已·月太。還可以使用具有酶活性的多肽經(jīng)化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程改造的突變體。所述酶組合物的一種或多種(幾種)組分可以是重組組分，亦即，通過(guò)克隆編碼所述單組分的DNA序列并隨后用該DNA序列轉(zhuǎn)化細(xì)胞并在宿主中表達(dá)(參見(jiàn)，例如，W091/17243和W091/17244)而產(chǎn)生。所述宿主優(yōu)選是異源宿主(酶對(duì)宿主是異源的)，但該宿主在一定條件下也可以是同源宿主(酶對(duì)宿主是天然的)。單組分纖維素分解酶還可以通過(guò)從發(fā)酵液中純化這樣的蛋白質(zhì)來(lái)制備。在一個(gè)方面，所述一種或多種(幾種)纖維素分解酶包含商業(yè)的纖維素分解酶制備物。適用于本發(fā)明的商業(yè)的纖維素分解酶制備物的實(shí)例包括，例如，CELLICCtec(NovozymesA/S),CELLUCLAST(NovozymesA/S)、N0V0ZYM188(NovozymesA/S)、CELLUZYME(NovozymesA/S)、CEREFLO(NovozymesA/S)禾口ULTRAFLO(NovozymesA/S)，ACCELERASE(GenencorInt.)、LAMINEX(GenencorInt.)、SPEZYMECP(GenencorInt.)，ROHAMENT7069ff(RohmGmbH)，F(xiàn)IBREZYMELDI(DyadicInternational,Inc.),FIBREZYMELBR(DyadicInternational,Inc.)或VISCOSTAR150L(DyadicInternational,Inc.)。纖維素酶以固體的約0.001到約5.Owt.%，更優(yōu)選固體的0.025到約4.Owt.%，且最優(yōu)選固體的約0.005到約2.Owt.%的有效量添加。纖維素酶以固體的約0.001至約5.，更優(yōu)選固體的約0.025至約4.Owt%，且最優(yōu)選固體的約0.005至約2.Owt%的有效量添加?？梢杂糜诒景l(fā)明的方法的細(xì)菌內(nèi)切葡聚糖酶的實(shí)例包括但不僅限于，解纖維熱酸菌(Acidothermuscellulolyticus)內(nèi)切葡聚糖酶(WO91/05039;W093/15186；美國(guó)專利5，275，944；WO96/02551；美國(guó)專利5，536，655，W000/70031,WO05/093050)；Thermobifidafusca內(nèi)切葡聚糖酶III(W005/093050)；和Thermobifidafusca內(nèi)切葡聚糖酶V(W005/093050)。可以用于本發(fā)明的真菌內(nèi)切葡聚糖酶的實(shí)例包括但不僅限于，里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I(Penttila等，1986，Gene45:253-263)；里氏木霉Cel7B內(nèi)切葡聚糖酶I；GENBANK登錄號(hào)M15665;SEQIDNO4)；里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II(Saloheimo等，1988，Gene63:11-22；里氏木霉Cel5A內(nèi)切葡聚糖酶II;GENBANK登錄號(hào)M19373;SEQIDN0:6);里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III(Okada等，1988，Appl.Environ.Microbiol.64:555-563；GENBANK登錄號(hào)AB003694;SEQIDNO:8)；里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶IV(Saloheimo等，1997，Eur.J.Biochem.249:584-591;GENBANK登錄號(hào)Yl1113;SEQIDNO10)；里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V(Saloheimo等，1994，MolecularMicrobiology13:219-228；GENBANK登錄號(hào)Z33381；SEQIDNO12)；棘孢曲霉內(nèi)切葡聚糖酶(Ooi等，1990，NucleicAcidsResearchl85884)；川地曲霉(Aspergilluskawachii)內(nèi)切葡聚糖酶(Sakamoto等，1995，CurrentGenetics27:435-439)；胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwiniacarotovara)內(nèi)切葡聚糖酶(Saarilahti等，1990，Gene90:9-14)；尖鐮孢內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK登錄號(hào)L29381)；灰腐質(zhì)霉thermoidea變種內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK登錄號(hào)AB003107)；Melanocarpusalbomyces內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK登錄號(hào)MAL515703)；粗糙脈孢菌內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK登錄號(hào)XM_324477)；特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V(SEQIDNO14)；嗜熱毀絲霉CBS117.65內(nèi)切葡聚糖酶(SEQIDNO16)；擔(dān)子菌綱(basidiomycete)CBS495.95內(nèi)切葡聚糖酶(SEQIDNO18)；擔(dān)子菌綱CBS494.95內(nèi)切葡聚糖酶(SEQIDNO20)；土生梭孢霉NRRL8U6CEL6B內(nèi)切葡聚糖酶(SEQIDNO22)；土生梭孢霉NRRL8U6CEL6C內(nèi)切葡聚糖酶(SEQIDNO24)；土生梭孢霉NRRL8U6CEL7C內(nèi)切葡聚糖酶(SEQIDNO26)；土生梭孢霉NRRL8U6CEL7E內(nèi)切葡聚糖酶(SEQIDNO:28)；土生梭孢霉NRRL8U6CEL7F內(nèi)切葡聚糖酶(SEQIDNO30)；CladorrhinumfoecundissimumATCC62373CEL7A內(nèi)切葡聚糖酶(SEQIDNO32)；以及里氏木霉菌株VTT-D-80133內(nèi)切葡聚糖酶(SEQIDNO34；GENBANK登錄號(hào)M15665)。上述SEQIDN0:4、SEQIDN0:6、SEQIDN0:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14,SEQIDNO:16,SEQIDNO:18,SEQIDNO:20,SEQIDNO:22,SEQIDNO:24、SEQIDNO:26,SEQIDNO:28,SEQIDNO:30,SEQIDNO:32禾口SEQIDNO:34的內(nèi)切葡聚糖酶分別由SEQIDNO:3,SEQIDN0:5、SEQIDN0:7、SEQIDN0:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13,SEQIDNO:15,SEQIDNO:17,SEQIDNO:19,SEQIDN0:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25,SEQIDNO:27,SEQIDNO:29,SEQIDNO:31和SEQIDNO:33的成熟多肽編碼序列所編碼?？捎糜诒景l(fā)明的纖維二糖水解酶的實(shí)例包括但不僅限于，里氏木霉纖維二糖水解酶I(SEQIDNO36)；里氏木霉纖維二糖水解酶II(SEQIDNO38)；特異腐質(zhì)霉纖維二糖水解酶I(SEQIDNO:40)、嗜熱毀絲霉纖維二糖水解酶II(SEQIDNO42和SEQIDN0:44)、土生梭孢霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)(SEQIDNO:46)、嗜熱毛殼菌(Chaetomiumthermophilum)纖維二糖水解酶I(SEQIDNO48)以及嗜熱毛殼菌纖維二糖水解酶II(SEQIDNO50)。上述SEQIDNO:36、SEQIDNO:38、SEQIDNO:40、SEQIDNO:42、SEQIDNO:44、SEQIDNO:46、SEQIDNO48和SEQIDNO50的纖維二糖水解酶分別由SEQIDNO35,SEQIDNO37、SEQIDNO39、SEQIDNO:41、SEQIDNO:43、SEQIDNO:45、SEQIDNO47和SEQIDNO49的成熟多肽編碼序列所編碼。可用于本發(fā)明的方法的葡糖苷酶的實(shí)例包括但不僅限于米曲霉葡糖苷酶(SEQIDNO52)；煙曲霉β-葡糖苷酶(SEQIDNO54)；巴西青霉(Penicilliumbrasilianum)IBT20888β-葡糖苷酶(SEQIDNO56)；黑曲霉β-葡糖苷酶(SEQIDΝ0:58)；以及棘孢曲霉β-葡糖苷酶(SEQIDΝ0:60)。上述SEQIDNO52、SEQIDNO:54、SEQIDNO56、SEQIDNO:58禾口SEQIDNO60的β_葡糖苷酶分別由SEQIDNO:51、SEQIDNO:53,SEQIDNO55,SEQIDNO57禾口SEQIDNO:59的成熟多肽編碼序列所編碼。具有β-葡糖苷酶活性的米曲霉多肽可根據(jù)WO2002/095014獲得。具有β-葡糖苷酶活性的煙曲霉多肽可根據(jù)WO2005/047499獲得。具有β-葡糖苷酶活性的巴西青霉多肽可根據(jù)WO2007/019442獲得。具有β_葡糖苷酶活性的黑曲霉多肽可根據(jù)Dan等，2000，J.Biol.Chem.275:4973-4980獲得。具有β-葡糖苷酶活性的棘孢曲霉多肽可根據(jù)Kawaguchi等，1996，Gene173:287-288獲得。其它可用的內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶使用根據(jù)HenrissatB·，1991，Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino—acidsequencesimilarities,Biochem.J.280:309-316禾口HenrissatB.禾口BairochΑ.，1996，Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases,Biochem.J.316:695-696的分類公開(kāi)于許多糖基水解酶家族中。在一個(gè)方面，所述一種或多種(幾種)纖維素分解酶包含內(nèi)切葡聚糖酶。在另一個(gè)方面，所述一種或多種(幾種)纖維素分解酶包含內(nèi)切葡聚糖酶I。在另一個(gè)方面，所述一種或多種(幾種)纖維素分解酶包含內(nèi)切葡聚糖酶II。在另一個(gè)方面，所述一種或多種(幾種)纖維素分解酶包含內(nèi)切葡聚糖酶III。在另一個(gè)方面，所述一種或多種(幾種)纖維素分解酶包含內(nèi)切葡聚糖酶IV。在另一個(gè)方面，所述一種或多種(幾種)纖維素分解酶包含內(nèi)切葡聚糖酶V。在另一個(gè)方面，所述一種或多種(幾種)纖維素分解酶包含纖維二糖水解酶。在另一個(gè)方面，所述一種或多種(幾種)纖維素分解酶包含纖維二糖水解酶I。在另一個(gè)方面，所述一種或多種(幾種)纖維素分解酶包含β-葡糖苷酶。在另一個(gè)方面，所述一種或多種(幾種)纖維素分解酶包含β-葡糖苷酶融合蛋白。在另一個(gè)方面，所述一種或多種(幾種)纖維素分解酶包含內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶。所述一種或多種(幾種)纖維素分解酶包含內(nèi)切葡聚糖酶和纖維二糖水解酶I。所述一種或多種(幾種)纖維素分解酶包含內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶I和β-葡糖苷酶。在另一個(gè)方面，所述β-葡糖苷酶是米曲霉β-葡糖苷酶(SEQIDΝ0:52)。在另一個(gè)方面，所述β-葡糖苷酶是煙曲霉β-葡糖苷酶(SEQIDΝ0:54)。在另一個(gè)方面，所述β-葡糖苷酶是巴西青霉IBT20888β-葡糖苷酶(SEQIDNO:56)。在另一個(gè)方面，所述β-葡糖苷酶是黑曲霉β-葡糖苷酶(SEQIDΝ0:58)。在另一個(gè)方面，所述β_葡糖苷酶是棘孢曲霉β-葡糖苷酶(SEQIDΝ0:60)。在另一個(gè)方面，所述β-葡糖苷酶是SEQIDNO:62的米曲霉β-葡糖苷酶變體融合蛋白或SEQIDNO:64的米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白。在另一個(gè)方面，所述米曲霉β-葡糖苷酶變體融合蛋白是由SEQIDΝ0:61的多核苷酸編碼的，或所述米曲霉β-葡糖苷酶變體融合蛋白是由SEQIDNO:63的多核苷酸編碼的。在另一個(gè)方面，所述一種或多種(幾種)纖維素分解酶包含β-葡糖苷酶；里氏木霉纖維二糖水解酶I(CEL7A)，里氏木霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)和里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I(CEL7B)。在另一個(gè)方面，所述一種或多種(幾種)纖維素分解酶包含米曲霉葡糖苷酶；里氏木霉纖維二糖水解酶I(CEL7A)，里氏木霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)和里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I(CEL7B)。在另一個(gè)方面，所述一種或多種(幾種)纖維素分解酶包含黑曲霉β-葡糖苷酶；里氏木霉纖維二糖水解酶I(CEL7A)，里氏木霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)和里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I(CEL7B)。在另一個(gè)方面，所述一種或多種(幾種)纖維素分解酶包含煙曲霉β-葡糖苷酶；里氏木霉纖維二糖水解酶I(CEL7A)，里氏木霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)和里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I(CEL7B)。在另一個(gè)方面，所述一種或多種(幾種)纖維素分解酶包含巴西青霉β-葡糖苷酶；里氏木霉纖維二糖水解酶I(CEL7A)，里氏木霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)和里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I(CEL7B)。在另一個(gè)方面，所述一種或多種(幾種)纖維素分解酶包含米曲霉葡糖苷酶變體BG融合蛋白；里氏木霉纖維二糖水解酶I(CEL7A)，里氏木霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)和里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I(CEL7B)。在另一個(gè)方面，所述一種或多種(幾種)纖維素分解酶包含米曲霉葡糖苷酶融合蛋白；里氏木霉纖維二糖水解酶I(CEL7A)，里氏木霉纖維二糖水解酶II(CEL6A)和里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I(CEL7B)。在另一個(gè)方面，上述一種或多種(幾種)纖維素分解酶進(jìn)一步包含一種或多種(幾種)選自下組的酶里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II(CEL5A)，里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V(CEL45A)和里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III(CEL12A)。其它可用于本發(fā)明的纖維素分解酶描述于EP495，257、EP531，315、EP531,372、WO89/09259、WO94/07998、WO95/24471、WO96/11262、W096/29397、WO96/034108、WO97/14804、WO98/08940、WO98/012307、W098/13465、WO98/015619、WO98/015633、WO98/028411,WO99/06574、WO99/10481、WO99/025846、WO99/025847、WO99/031255、W02000/009707,WO2002/050245、WO2002/0076792、WO2002/101078、W02003/027306、WO2003/052054,WO2003/052055,WO2003/052056,W02003/052057,WO2003/052118、WO2004/016760、WO2004/043980,W02004/048592,WO2005/001065,WO2005/028636、WO2005/093050,W02005/093073,WO2006/074005,WO2006/117432、WO2007/071818、W02007/071820、WO2008/008070、WO2008/008793、美國(guó)專利No.4，435，307、美國(guó)專利No.5，457，046、美國(guó)專利No.5，648，洸3、美國(guó)專利No.5，686，593、美國(guó)專利No.5，691，178、美國(guó)專利No.5，763，254以及美國(guó)專利No.5，776，757。在一個(gè)方面，所述一種或多種(幾種)半纖維素分解酶包含商業(yè)的半纖維素分解酶制備物。適用于本發(fā)明的商業(yè)性半纖維素分解酶制備物的實(shí)例包括，例如SHEARZYME(NovozymesA/S)、CELLICHtec(NovozymesA/S)、VISCOZYME(NovozymesA/S)、ULTRAFLO(NovozymesA/S)、PULPZYMEHC(NovozymesA/S)、MULTIFECTXylanase(Genencor)、ECOPULPTX-200A(ABEnzymes)、HSP6000Xylanase(DSM),DEP0L333P(BiocatalystsLimit,Wales,UK)、DEP0L740L.(BiocatalystsLimit,Wales,UK)和DEP0L762P(BiocatalystsLimit,Wales,UK)可用于本發(fā)明方法的木聚糖酶的實(shí)例包括但不限于棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)木聚糖酶(GeneSeqP:AAR63790;W094/21785)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)木聚糖酶(W02006/078256)和土生梭孢霉(Thielaviaterrestris)NRRL8126木聚糖酶(W02009/079210)。可用于本發(fā)明方法的β-木糖苷酶的實(shí)例包括但不限于里氏木霉(Trichodermareesei)β-木糖苷酶(UniProtKB/TrEMBL登錄號(hào)Q92458)，埃默森踝節(jié)菌(Talaromycesemersonii)(SwissProt登錄號(hào)Q8X212)和粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)(SwissProt登錄號(hào)Q7S0W4)?？捎糜诒景l(fā)明方法的乙酰木聚糖酯酶的實(shí)例包括但不限于紅褐肉座菌(Hypocreajecorina)乙酰木聚糖酯酶(W02005/001036)、粗糙脈孢菌乙酰木聚糖酯酶(UniProt登錄號(hào)q7s259)、土生梭孢霉NRRL81乙酰木聚糖酯酶(W02009/042846)、球毛殼菌(Chaetomiumglobosum)乙酰木聚糖酯酶(Uniprot登錄號(hào)Q2GWX4)、細(xì)麗毛殼菌(Chaetomiumgracile)乙酰木聚糖酯酶(GenekqP登錄號(hào)AAB821M)、穎枯殼針孢(Phaeosphaerianodorum)乙酰木聚糖酯酶(Uniprot登錄號(hào)Q0UHJ1)和特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)DSM1800乙酰木聚糖酯酶(WO2OO9A^37O9)?？捎糜诒景l(fā)明方法的阿魏酸酯酶的實(shí)例包括但不限于特異腐質(zhì)霉DSM1800阿魏酸酯酶(W02009/076122)、粗糙脈孢菌阿魏酸酯酶(UniProt登錄號(hào)Q9HGR3)和費(fèi)希新薩托菌(Neosartoryafischer)阿魏酸酯酶(UniProt登錄號(hào)A1D9T4)?？捎糜诒景l(fā)明方法的阿拉伯呋喃糖苷酶的實(shí)例包括但不限于特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)DSM1800阿拉伯呋喃糖苷酶(W02009/073383)和黑曲霉(Aspergillusniger)阿拉伯呋喃糖苷酶(GenekqP登錄號(hào)AAR94170)?？捎糜诒景l(fā)明方法的α-葡糖醛酸糖苷酶的實(shí)例包括但不限于棒曲霉(Aspergillusclavatus)α-葡糖醛酸糖苷酶(UniProt登錄號(hào)alccl2)、里氏木霉(Trichodermareesei)α-葡糖醛酸糖苷酶(Uniprot登錄號(hào)Q99024)、埃默森踝節(jié)菌(Talaromycesemersonii)α-葡糖醛酸糖苷酶(UniProt登錄號(hào)Q8X211)、黑曲霉(Aspergillusniger)α-葡糖醛酸糖苷酶(Uniprot登錄號(hào)Q96WX9)、土曲霉(Aspergillusterreus)α-葡糖醛酸糖苷酶(SwissProt登錄號(hào)Q0CJP9)和煙曲霉(Aspergillusfumigatus)α-葡糖醛酸糖苷酶(SwissProt登錄號(hào)Q4WW45)。用于本發(fā)明方法的酶和蛋白可通過(guò)在含有合適碳源和氮源和無(wú)機(jī)鹽的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上，使用本領(lǐng)域已知方法(參見(jiàn)，例如Bennett,J.W.和LaSure,L.(編)，MoreGeneManipulationsinFungi,AcademicPress，CA，1991)發(fā)酵上述指出的微生物菌株來(lái)產(chǎn)生。合適的培養(yǎng)基可從供應(yīng)商獲得，或可根據(jù)已公開(kāi)組成制備(例如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄)。適于生長(zhǎng)和酶產(chǎn)生的溫度范圍和其他條件在本領(lǐng)域是已知的(參見(jiàn)，例如Bailey,J.E.禾口Ollis,D.F.,BiochemicalEngineeringFundamentals,McGraw-Hi11BookCompany,NY,1986)。所述發(fā)酵可以是任何其結(jié)果為酶表達(dá)或分離的培養(yǎng)細(xì)胞的方法。因此，發(fā)酵可以理解為包括在合適的培養(yǎng)基中并在允許所述酶得以表達(dá)或分離的條件下進(jìn)行的搖瓶培養(yǎng)，或在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小-或大規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補(bǔ)料分批或固態(tài)發(fā)酵)。通過(guò)上述方法產(chǎn)生的所得的酶可從發(fā)酵培養(yǎng)基回收并通過(guò)常規(guī)方法純化。具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽及其多核苷酸在第一個(gè)方面，具有纖維素分解增強(qiáng)活性的分離的多肽與SEQIDNO:2具有纖維素分解增強(qiáng)活性的成熟多肽具有至少75%，例如至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的序列同一性。在一個(gè)方面，所述多肽與SEQIDNO:2的成熟多肽相差不超過(guò)十個(gè)氨基酸，例如相差五個(gè)氨基酸，相差四個(gè)氨基酸，相差三個(gè)氨基酸，兩個(gè)氨基酸，和一個(gè)氨基酸。具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO2的氨基酸序列或其等位變體；或它們的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段，或者由上述這些組成。在另一個(gè)方面，多肽包含SEQIDNO:2，或由SEQIDN0:2組成。在另一個(gè)方面，多肽包含SEQIDNO:2的成熟多肽，或由SEQIDNO2的成熟多肽組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO2的氨基酸22至250，或由SEQIDNO2的氨基酸22至250組成。在第二個(gè)方面，所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的分離的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在中-高嚴(yán)格條件下與下列雜交(i)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈(J.Sambrook,E.F.Fritsch禾口T.Maniatis,1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarbor,NewYork)。SEQIDNO:1的多核苷酸或其亞序列；以及SEQIDNO:2的氨基酸序列或其片段，可用于設(shè)計(jì)核酸探針，以根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法從不同屬或種的菌株鑒定和克隆編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的DNA。具體而言，可將這些探針用于根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡方法與感興趣的屬或種的基因組或cDNA雜交，以鑒定并從其中分離相應(yīng)的基因。這些探針可明顯短于完整序列，但長(zhǎng)度上應(yīng)為至少14個(gè)，例如至少25個(gè)，至少35個(gè)，或至少70個(gè)核苷酸。優(yōu)選所述核酸探針長(zhǎng)度上是至少100個(gè)核苷酸，例如至少200個(gè)核苷酸，至少300個(gè)核苷酸，至少400個(gè)核苷酸，至少500個(gè)核苷酸，至少600個(gè)核苷酸，至少700個(gè)核苷酸，至少800個(gè)核苷酸，或至少900個(gè)核苷酸。DNA和RNA探針二者均可使用。通常將探針標(biāo)記用于檢測(cè)相應(yīng)的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)標(biāo)記)。將這些探針涵蓋于本發(fā)明中?？蓮挠蛇@些其它菌株制備的基因組DNA或cDNA文庫(kù)中篩選DNA，所述DNA與上述探針雜交并且編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽?？梢酝ㄟ^(guò)瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或通過(guò)其它分離技術(shù)分離來(lái)自這些其它菌株的基因組或其它DNA?？梢詫?lái)自文庫(kù)的DNA或分離的DNA轉(zhuǎn)移至硝化纖維素(nitrocellulose)或其它合適的載體材料并且固定于其上。為了鑒定與SEQIDNO:1或其亞序列同源的克隆或DNA，將所述載體材料優(yōu)選用在Sounthern印跡中。就本發(fā)明而言，雜交表示多核苷酸在非常低至非常高的嚴(yán)格條件下與標(biāo)記的核酸探針雜交，所述核酸探針對(duì)應(yīng)于SEQIDNO1；SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列；包含于SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列的cDNA序列；它們的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；或其亞序列。可使用例如X射線片(X-rayfilm)檢測(cè)在這些條件下與核酸探針雜交的分子。在一個(gè)方面，核酸探針是SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列。在另一個(gè)方面，核酸探針是SEQIDN0:1的核苷酸64至859或其cDNA序列。在另一個(gè)方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:2的多肽或其成熟多肽或其片段的多核苷酸序列。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO1或其cDNA序列。對(duì)于長(zhǎng)度至少100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)探針，將非常低至非常高的嚴(yán)格條件定義為在42°C，在5XSSPE.03%SDS、200yg/ml已剪切且變性的鮭精DNA中，并對(duì)于非常低和低嚴(yán)格性為25%甲酰胺、對(duì)于中和中-高嚴(yán)格性為35%甲酰胺、或?qū)τ诟吆头浅８邍?yán)格性為50%甲酰胺，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡步驟進(jìn)行預(yù)雜交和雜交最佳12至M小時(shí)。使用2XSSC、0.2%SDS在45°C(非常低嚴(yán)格性)，在50°C(低嚴(yán)格性)，在55°C(中嚴(yán)格性)，在60°C(中-高嚴(yán)格性)，在65°C(高嚴(yán)格性)，和在70°C(非常高嚴(yán)格性)將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。對(duì)于長(zhǎng)度大約15個(gè)核苷酸至大約70個(gè)核苷酸的短探針，將嚴(yán)格條件定義為在比使用根據(jù)Bolton和McCarthy計(jì)算法(1962，Proc.Natl.Acad.Sci.USA48:1390)計(jì)算得出的、低大約5°C至大約10°C，在0.9MNaCl，0.09MTris-HClpH7.6,6mMEDTA,0.5%NP-40,IXDenhardt溶液，ImM焦磷酸鈉，ImM磷酸二氧鈉(sodiummonobasicphosphate),0.ImM23ATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡步驟進(jìn)行預(yù)雜交和最佳12至24小時(shí)。將所述載體材料在6XSSC加0.1%SDS中最終洗滌一次15分鐘，并用6XSSC在比計(jì)算出的Tm低5°C至10°C的溫度洗滌兩次，每次15分鐘。在第三個(gè)方面，所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的分離的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或cDNA序列具有至少75%，例如至少80，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%的序列同一性，其編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。在第四個(gè)方面，所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的分離的多肽是SEQIDNO2的成熟多肽或其同源序列中包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(或數(shù)個(gè))氨基酸的變體。優(yōu)選地，氨基酸改變對(duì)性質(zhì)是較不重要的(ofaminornature)，即保守的氨基酸取代或插入，其不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性；通常為1至大約30個(gè)氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸殘基；多至大約20-25個(gè)殘基的小接頭肽；或通過(guò)改變凈電荷或其它功能來(lái)促進(jìn)純化的小延伸，如多組氨酸序列(poly-histidinetract)、抗原表位(antigenicepitope)或結(jié)合域(bindingdomain)。保守取代的實(shí)例是在以下組之內(nèi)堿性氨基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸組(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸組(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變比活性(specificactivity)的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill，1979，于TheProteins,AcademicPress,NewYork中描述。最普遍發(fā)生的交換是Ala/^er、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser,Ala/Gly,Ala/Thr,Ser/Asn,Ala/Val、Ser/Gly,Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu禾口Asp/Gly?？蛇x地，氨基酸改變具有這樣的性質(zhì)以使多肽的物理化學(xué)性質(zhì)改變。例如，氨基酸改變可改進(jìn)多肽的熱穩(wěn)定性，改變底物特異性，改變最適PH等。能夠根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法(Cunningham和Wells,1989,Science244:1081-1085)來(lái)鑒定親本多肽中的必需氨基酸。在后一技術(shù)中，將單一丙氨酸突變引入到分子中的每個(gè)殘基，并且測(cè)試所得突變分子的纖維素分解增強(qiáng)活性以鑒定對(duì)于所述分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。同樣參見(jiàn)Hilton等，1996，J.Biol.Chem.271:4699-4708.酶的活性部位或其它的生物相互作用也能夠通過(guò)結(jié)構(gòu)的物理分析而測(cè)定，如通過(guò)以下這些技術(shù)如核磁共振、晶體學(xué)、電子衍射或光親和標(biāo)記，連同推定的接觸位點(diǎn)氨基酸的突變來(lái)測(cè)定。參見(jiàn)例如deVos等，1992，Science255:306-312;Smith等，1992，J.Mol.Biol.224:899-904；Wlodaver等，1992，F(xiàn)EBSLett.309:59_64。必需氨基酸的身份(identity)也能夠從與相關(guān)于親本多肽的多肽的同一性分析來(lái)推斷。能夠使用已知的誘變、重組和/或改組(shuffling)方法，然后是有關(guān)的篩選方法，例如那些由Reidhaar-Olson禾ΠSauer,1988，Science241:53-57；Bowie禾ΠSauer,1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152-2156；WO95/17413；或W095/2^25公開(kāi)的那些方法來(lái)進(jìn)行并測(cè)試單個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失、和/或插入。能夠使用的其它方法包括易錯(cuò)PCR、噬菌體展示(例如，Lowman等，1991，Biochem.3010832-10837；美國(guó)專利5，223，409號(hào)；WO92/06204)和區(qū)域定向的誘變(Derbyshire等，1986，Gene46:145；Ner等，1988，DNA7:127)。誘變/改組方法能夠與高通量、自動(dòng)化的篩選方法組合以檢測(cè)由宿主細(xì)胞表達(dá)的克隆的、誘變的多肽的活性(Ness等，1999，NatureBiotechnology17:893-896)。能夠從宿主細(xì)胞回收編碼活性多肽的誘變的DNA分子，并且使用本領(lǐng)域內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)方法快速測(cè)序。這些方法允許快速確定多肽中單個(gè)氨基酸殘基的重要性。SEQIDNO2的成熟多肽中氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)不超過(guò)10，例如，1，2，3，4，5，6，7，8或9。具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽可為雜合多肽，其中一個(gè)多肽的一部分融合于另一個(gè)多肽的一部分的N端或C端。具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽可為融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一個(gè)多肽融合于多肽的N端或C端。融合多肽是通過(guò)將編碼另一個(gè)多肽的多核苷酸融合于本發(fā)明的多核苷酸來(lái)產(chǎn)生的。用于產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的，并包括連接編碼多肽的編碼序列從而使得它們符合讀框，且融合多肽的表達(dá)是在相同啟動(dòng)子和終止子的調(diào)控之下的。亦可使用內(nèi)蛋白技術(shù)構(gòu)建融合蛋白，其中融合物是翻譯后構(gòu)建的(Cooper等，1993，EMBOJ.12:2575-2583；Dawsonetal.，1994，Science266:776-779)。融合多肽可進(jìn)一步在兩個(gè)多肽之間包含切割位點(diǎn)。在融合蛋白分泌之后，切割該位點(diǎn)釋放兩個(gè)多肽。切割位點(diǎn)的實(shí)例包括但不限于，Martin等，2003，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568-576；Svetina等，2000,J.Biotechnol.76:245-251；Rasmussen-Wilson等,1997,Appl.Environ.Microbiol.63:3488-3493；Ward等,1995,Biotechnology13:498-503；禾口Contreras等，1991，Biotechnology9:378-381；Eaton等，1986，Biochemistry25:505-512；Collins-Racie等，1995,Biotechnology13:982-987；Carter等，1989,Proteins:Structure,Function,andGenetics6:240-248；禾口Stevens,2003,DrugDiscoveryWorld4:35-48中公開(kāi)的位點(diǎn)。具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽可獲得自任何屬的微生物。就本發(fā)明而言，用于本文與給定的來(lái)源有關(guān)的術(shù)語(yǔ)“獲得自”，應(yīng)意指核苷酸序列編碼的多肽由所述來(lái)源產(chǎn)生，或由其中插入了來(lái)自所述來(lái)源的多核苷酸的菌株產(chǎn)生。在一個(gè)優(yōu)選的方面，獲得自給定來(lái)源的多肽是胞外分泌的。所述多肽可以是細(xì)菌多肽。例如，所述多肽可以是具有纖維素分解增強(qiáng)活性的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌多肽例如芽孢桿菌屬(Bacillus)、梭菌屬(Clostridium)、腸球菌屬(Enterococcus)、地芽孢桿菌屬(Geobacillus)>ILfflifM(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、海洋芽孢桿菌屬(Oceanobacillus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)>鏈球菌屬Gtr印tococcus)或鏈霉菌屬(Sti^ptomyces)多肽；或革蘭氏陰性細(xì)菌多肽，如彎曲桿菌屬(Campylobacter)、大腸桿菌(E.coli)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、螺桿菌屬(Helicobacter)、泥桿菌屬(Ilyobacter)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)、假單胞菌屬(I^seudomonas)、沙門氏菌屬(Salmonella)或脲原體屬(Ureaplasma)屬多月太。在一個(gè)方面，所述多肽是嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢桿菌(Bacillusbrevis)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillusclausii)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillusfirmus)、燦爛芽孢桿菌(Bacilluslautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)或蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)多月太。在另一個(gè)方面，所述多肽是似馬鏈球菌(Streptococcusequisimilis)、釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、乳房鏈球菌(Streptococcusuberis)或馬鏈球菌獸痕亞禾中(Streptococcusequisubsp.Zooepidemicus)多月太。在另一個(gè)方面，所述多肽是不產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesachromogenes)、除蟲鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)、天藍(lán)鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)、灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)或淺青紫鏈霉菌(Streptomyceslividans)多月太。所述多肽也可以是真菌多肽。例如，所述多肽可為酵母多肽如假絲酵母屬(Candida)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉屬(Yarrowia)多肽；或絲狀真菌多肽如枝頂孢霉屬(Acremonium)、傘菌屬(Agaricus)、鏈格孢屬(Alternaria)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、Botryospaeria、擬錯(cuò)菌屬(Ceriporiopsis)、毛_殼屬(Chaetomidium)、金抱子菌屬(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼傘屬(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊殼屬(Corynascus)、隱叢赤殼菌屬(Cryphonectria)、隱球菌屬(Cryptococcus)、色二孢屬(Diplodia)、漂耳屬(Exidia)、Filibasidium、鐮孢屬(Fusarium)、赤霉屬(Gibberella)、全鞭毛蟲屬(Holomastigotoides)、腐質(zhì)毒屬(Humicola)、奉巴齒菌屬(Irpex)、薦燕屬(Lentinula)、Leptospaeria、梨抱菌屬(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孑L菌屬(Meripilus)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、新考瑪脂霉屬(Neocallimastix)、脈孢菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、平革菌屬(Phanerochaete)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、Poitrasia、假漂盤菌屬(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉屬(Rhizomucor)、裂糟菌屬(Schizophyllum)、柱頂孢屬(Scytalidium)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、木霉屬(Trichoderma)、長(zhǎng)毛盤菌屬(Trichophaea)、輪枝孢屬(Verticillium)、包腳菇屬(Volvariella)或炭角菌屬(Xylaria)多肽。在另一個(gè)方面，所述多肽是卡爾酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、克魯弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、諾地酵母(Saccharomycesnorbensis)或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)多月太。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是解纖維枝頂孢霉(Acremoniumcelluloyticus)、棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)、漂曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、Chrysosporiuminops、嗜角質(zhì)金抱子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、Chrysosporiummerdarium、租金抱子菌(Chrysosporiumpannicola)、Chrysosporiumqueenslandicum、熱帶金抱子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporiumzonatum、桿抱狀德抱(Fusariumbactridioides)、禾谷德抱(Fusariumcerealis)、庫(kù)威德抱(Fusariumcrookwellense)、大刀,廉抱(Fusariumculmorum)、禾本禾斗德抱(Fusariumgraminearum)、禾赤德抱(Fusariumgraminum)、異抱德抱(Fusariumheterosporum)、合歡木德抱(Fusariumnegundi)、尖,廉抱(Fusariumoxysporum)、多枝德抱(Fusariumreticulatum)、粉紅,廉抱(Fusariumroseum)、接骨木,廉抱(Fusariumsambucinum)、膚色德抱(Fusariumsarcochroum)、擬分枝抱,廉抱(Fusariumsporotrichioides)、硫色德抱(Fusariumsulphureum)、圓,廉抱(Fusariumtorulosum)、擬絲抱德抱(Fusariumtrichothecioides)、壤片德抱(Fusariumvenenatum)、灰腐質(zhì)霉(Humicolagrisea)、特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)、疏棉狀腐質(zhì)毒(Humicolalanuginosa)、白奉巴齒菌(Irpexlacteus)、米漂毛毒(Mucormiehei)、嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)、粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)、筆狀青毒(Peniclliumfuniculosum)、產(chǎn)紫青毒(Penicilliumpurpurogenum)、黃抱平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、無(wú)色梭抱殼(Thielaviaachromatica)、THielaviaalbomyces、Thielaviaalbopilosa、澳洲梭抱殼(Thielaviaaustraleinsis)、Thielaviafimeti、小抱梭抱殼(Thielaviamicrospora)、卵抱梭抱殼(Thielaviaovispora)ΛThielaviaperuviana、^；·^冑(Thielaviasetosa)、罾包冑(Thielaviaspededonium)、Thielaviasubthermophila、zh^MJfe^(Thielaviaterrestris)、哈茨7^霉(Trichodermaharzianum)、康寧木霉(Trichodermakoningii)、長(zhǎng)枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichodermareesei)或綠色木霉(Trichodermaviride)多肽。在另一個(gè)方面，所述多肽是具有纖維素分解增強(qiáng)活性的煙曲霉多肽，例如包含SEQIDNO2的成熟多肽的多肽?？衫斫獾氖菍?duì)于前述的種，本發(fā)明包含完全和不完全階段(perfectmdimperfectstates)，和其它分類學(xué)的等同物(equivalent)，例如無(wú)性型(mamorph)，而無(wú)論它們已知的種名。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員容易地識(shí)別適合的等同物的同一性。這些種的菌株在許多培養(yǎng)物保藏中心對(duì)于公眾能夠容易地取得，所述保藏中心諸如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSMZ)、真菌菌種保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures)(CBS)和農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection，NorthernRegionalResearchCenter)(NRRL)。可以使用上述的探針從其它來(lái)源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分離的微生物鑒定和獲得所述多肽。用于從天然生境(habitat)分離微生物的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)公知的。隨后可通過(guò)相似地篩選另一種微生物的基因組或cDNA文庫(kù)或混合的DNA樣品來(lái)獲得編碼所述多肽的多核苷酸。一旦用所述探針檢測(cè)到編碼多肽的多核苷酸，就能夠使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)將所述多核苷酸分離或克隆(參見(jiàn)，例如，Sambrook等，1989，見(jiàn)上文)?？煞蛛x并使用編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的多核苷酸來(lái)如本文中所述實(shí)施本發(fā)明的方法。用于分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或其組合?？赏ㄟ^(guò)例如使用熟知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或表達(dá)文庫(kù)的抗體篩選來(lái)檢測(cè)具有共有結(jié)構(gòu)特性的克隆DNA片段，從而實(shí)現(xiàn)從這種基因組DNA克隆多核苷酸。參見(jiàn)，例如，Innis等，1990，PCR:AGuidetoMethodsandApplication,AcademicPress,NewYork?？梢允褂闷渌怂釘U(kuò)增方法，如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、連接活化轉(zhuǎn)錄(LAT)和基于多核苷酸的擴(kuò)增(NASBA)?？蓮那箤倬?，或其它或相關(guān)生物體克隆多核苷酸，并由此可為例如所述多核苷酸的多肽編碼區(qū)的等位基因變體或種變體(speciesvariant)。在本發(fā)明的方法中，分離的多核苷酸包含核苷酸序列或由核苷酸序列組成，所述核苷酸序列與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少75%，例如至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或100%的序列同一性，其編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽。修飾編碼多肽的多核苷酸對(duì)于合成與所述多肽基本上相似的多肽可為必需的。術(shù)語(yǔ)與所述多肽“基本上相似”指多肽的非天然存在的形式。這些多肽可能以一些工程改造的方式而不同于從其天然來(lái)源分離的多肽，例如，比活性、熱穩(wěn)定性、最適PH等方面不同的變體?？梢栽谧鳛镾EQIDNO:1的多肽編碼序列或其cDNA序列存在的多核苷酸，例如其亞序列的基礎(chǔ)上，和/或通過(guò)引入如下核苷酸取代來(lái)構(gòu)建變體所述取代不導(dǎo)致多肽氨基酸序列的改變，但是符合意欲產(chǎn)生酶的宿主生物體的密碼子選擇；或者所述取代可產(chǎn)生不同的氨基酸序列。關(guān)于核苷酸取代的概述，參見(jiàn)，例如，i^ord等，1991JroteinExpressionandPurification2:95_107。在本發(fā)明的方法中，分離的多核苷酸在優(yōu)選中-高嚴(yán)格條件下，更優(yōu)選高嚴(yán)格條件下，且最優(yōu)選非常高嚴(yán)格條件下，與以下雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，()包含于SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列的cDNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；或它們的等位變體和亞序列(Sambrook等，1989，見(jiàn)上文)，如本文所定義的。在一個(gè)方面，所述多核苷酸包含SEQIDNO:1,SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列，或其cDNA序列，或編碼SEQIDNO:2具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段的SEQIDN0:1的亞序列，如SEQIDNO:1核苷酸64至859的多核苷酸，或者所述多核苷酸由SEQIDNO1,SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列，或其cDNA序列，或編碼SEQIDNO2具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段的SEQIDNO:1的亞序列，如SEQIDNO1核苷酸64至859的多核苷酸組成。核酸構(gòu)建體可以以多種方式操作編碼多肽，例如具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽、纖維素分解酶、半纖維素分解酶等的分離的多核苷酸，以提供多肽的表達(dá)，即構(gòu)建包含編碼多肽的分離的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，所述多核苷酸可操作地連接于一種或多種(幾種)調(diào)控序列，所述調(diào)控序列指導(dǎo)編碼序列在合適的宿主細(xì)胞中在與所述調(diào)控序列相容的條件下的表達(dá)。依賴于表達(dá)載體，在將多核苷酸的序列插入載體之前對(duì)其進(jìn)行操作可能是理想的或必需的。使用重組DNA方法修飾多核苷酸的序列的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。調(diào)控序列可為啟動(dòng)子序列，其是由用于表達(dá)編碼多肽的多核苷酸的宿主細(xì)胞所識(shí)別的多核苷酸。啟動(dòng)子序列含有介導(dǎo)多肽的表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。啟動(dòng)子可以是在所選的宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何多核苷酸，包括突變的、截短的和雜合的啟動(dòng)子，并且可以從編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因獲得。用于在細(xì)菌宿主細(xì)胞中指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的實(shí)例是從下述獲得的啟動(dòng)子解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌α_淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因、大腸桿菌Iac操縱子、天藍(lán)鏈霉菌瓊脂糖酶基因(dagA)和原核內(nèi)酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:3727-3731)，以及tac啟動(dòng)子(DeBoer等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:21-25)。另夕卜的啟動(dòng)子在"Usefulproteinsfromrecombinantbacteria“于Gilbert等，1980,ScientificAmerican,242:74-94中；和在Sambrook等，1989，見(jiàn)上文中描述。用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在絲狀真菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的實(shí)例是從下列酶的基因獲得的啟動(dòng)子構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(W096/00787)、鑲片鐮孢淀粉葡糖苷酶(W000/56900)、鑲片鐮孢Daria(W000/56900)、鑲片鐮孢Quinn(W000/56900)、曼赫根毛霉脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶I、里氏木霉纖維二糖水解酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶IV、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi啟動(dòng)子(一種修飾的啟動(dòng)子，其來(lái)自在曲霉屬中編碼中性α-淀粉酶的基因，其中未翻譯的前導(dǎo)序列由在曲霉屬中編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因的未翻譯的前導(dǎo)序列所替代；非限制性實(shí)例包括修飾的啟動(dòng)子，其來(lái)自在黑曲霉中編碼中性α-淀粉酶的基因，其中未翻譯的前導(dǎo)序列由在構(gòu)巢曲霉和米曲霉中編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因的未翻譯的前導(dǎo)序列所替代)；和它們的突變的、截短的和雜合的啟動(dòng)子。在酵母宿主中，有用的啟動(dòng)子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(ΕΝ0-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GALl)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH1，ADH2/GAP)、釀酒酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶(TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白(CUPl)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞其它有用的啟動(dòng)子由Romanos等，1992,Yeast8:423-488描述。調(diào)控序列也可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，其由宿主細(xì)胞識(shí)別以終止轉(zhuǎn)錄。所述終止子序列與編碼所述多肽的多核苷酸的3’末端可操作地連接?？梢詫⒃谒x宿主細(xì)胞中有功能的任何終止子用在本發(fā)明中。對(duì)于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細(xì)胞色素C(CYCl)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞其它有用的終止子由Romanos等，1992，見(jiàn)上文描述。調(diào)控序列還可以是合適的前導(dǎo)序列，當(dāng)被轉(zhuǎn)錄時(shí)其為對(duì)于宿主細(xì)胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列可操作地連接于編碼多肽的多核苷酸的5’-末端。可使用在所選宿主細(xì)胞中有功能的任何前導(dǎo)序列。對(duì)于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的前導(dǎo)序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞合適的前導(dǎo)序列從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(EN0-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母α因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)。調(diào)控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是與多核苷酸的3’末端可操作地連接的序列，并且在轉(zhuǎn)錄時(shí)，宿主細(xì)胞將其識(shí)別為將聚腺苷殘基添加至轉(zhuǎn)錄的mRNA的信號(hào)。可使用在所選宿主細(xì)胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。對(duì)于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的聚腺苷酸化序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sierman，1995,Mol.CellularBiol.15:5983-5990描述。調(diào)控序列還可以是信號(hào)肽編碼區(qū)，其編碼與多肽的N端相連的信號(hào)肽，并且指導(dǎo)所述多肽進(jìn)入細(xì)胞分泌途徑。多核苷酸的編碼序列5’端可固有地包含信號(hào)肽編碼序列，其與編碼所述多肽的編碼序列的區(qū)段一起天然地連接在翻譯閱讀框中?？晒┻x擇的是，編碼序列5’端可含有對(duì)于所述編碼序列異源的信號(hào)肽編碼序列。異源信號(hào)肽編碼序列在編碼序列不天然地含有信號(hào)肽編碼區(qū)時(shí)可為必需的。或者，外源信號(hào)肽編碼序列可以簡(jiǎn)單地取代天然信號(hào)肽編碼序列以增強(qiáng)多肽的分泌。然而，可使用指導(dǎo)表達(dá)的多肽進(jìn)入所選宿主細(xì)胞的分泌途徑的任何信號(hào)肽編碼序列。對(duì)于細(xì)菌宿主細(xì)胞有效的信號(hào)肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號(hào)肽編碼序列芽孢桿菌屬NCIB11837產(chǎn)麥芽糖淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢桿菌β-內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT，nprS,nprM)和枯草芽孢桿菌prsA。另外的信號(hào)肽由Simonen和Palva,1993,MicrobiologicalReviews57109-137描述。對(duì)于絲狀真菌宿主細(xì)胞有效的信號(hào)肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號(hào)肽編碼序列黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特異腐質(zhì)霉纖維素酶、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V、疏棉狀腐質(zhì)霉脂肪酶和曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞有用的信號(hào)肽從釀酒酵母α因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶的基因獲得。其它有用的信號(hào)肽編碼區(qū)由Romanos等，1992，見(jiàn)上文描述。調(diào)控序列還可以是前肽編碼序列，其編碼位于多肽N端的前肽。所得多肽稱為酶原(proenzyme)或前多肽(propolyp印tide)(或在某些情況下稱為酶原(zymogen))。前多肽通常是無(wú)活性的，并且能夠通過(guò)前肽的催化或自催化切割從前多肽轉(zhuǎn)化為活性多肽。前肽編碼序列可從如下酶的基因獲得枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、嗜熱毀絲霉漆酶(W095/33836)、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和釀酒酵母α因子。當(dāng)信號(hào)肽和前肽序列二者均出現(xiàn)在多肽的N端時(shí)，將前肽序列置于緊接著(nextto)多肽N端，并且將信號(hào)肽序列置于緊接著前肽序列的N端。同樣理想的是添加調(diào)節(jié)序列，其允許相對(duì)于宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)來(lái)調(diào)節(jié)多肽的表達(dá)。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實(shí)例是引起基因表達(dá)響應(yīng)化學(xué)或物理刺激物，包括調(diào)節(jié)化合物的存在而開(kāi)啟或關(guān)閉的那些系統(tǒng)。原核系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括lac、tac和trp操縱基因系統(tǒng)。在酵母中，可使用ADH2系統(tǒng)或GALl系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子、啟動(dòng)子TAKAα-淀粉酶啟動(dòng)子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子。調(diào)節(jié)序列的其它實(shí)例是那些允許基因擴(kuò)增的序列。在真核系統(tǒng)中，這些序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下擴(kuò)增的二氫葉酸還原酶基因，和以重金屬(withheavymetal)擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的多核苷酸可與調(diào)節(jié)序列可操作地連接。表達(dá)載體多種核苷酸和調(diào)控序列可以結(jié)合在一起以產(chǎn)生重組表達(dá)載體，所述表達(dá)載體可以包括一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))方便的限制位點(diǎn)以允許在這些位點(diǎn)插入或取代編碼多肽的多核苷酸，例如具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽，纖維素分解酶，半纖維素分解酶等。可供選擇的是，可以通過(guò)在適當(dāng)?shù)挠糜诒磉_(dá)的載體中插入包含所述序列的多核苷酸或核酸構(gòu)建體來(lái)表達(dá)所述多核苷酸。在制備表達(dá)載體的過(guò)程中，將編碼序列置于載體中，從而將該編碼序列與適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)調(diào)控序列可操作地連接。重組表達(dá)載體可以是任何載體(例如，質(zhì)?；虿《?，其能夠方便地進(jìn)行重組DNA步驟，并且能夠產(chǎn)生多核苷酸的表達(dá)。載體的選擇將通常依賴于載體與將引入該載體的宿主細(xì)胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。載體可以是自主復(fù)制載體，即，作為染色體外實(shí)體(entity)存在的載體，其復(fù)制獨(dú)立于染色體復(fù)制，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用于確保自復(fù)制的手段(means)?；蛘撸d體可以是一種當(dāng)被引入宿主細(xì)胞中時(shí)，整合到基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復(fù)制的載體。此外，可以使用單獨(dú)的載體或質(zhì)?；騼蓚€(gè)或更多個(gè)載體或質(zhì)粒，其共同含有待引入宿主細(xì)胞基因組的完整DNA(totalDNA)，或可以使用轉(zhuǎn)座子(transposon)。所述載體優(yōu)選地含有一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))選擇性標(biāo)記，其允許簡(jiǎn)單選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的細(xì)胞。選擇性標(biāo)記是基因，其產(chǎn)物提供殺生物劑或病毒抗性、對(duì)重金屬的抗性、對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)性(prototrophytoauxotrophs)等。細(xì)菌選擇性標(biāo)記的實(shí)例是來(lái)自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或賦予抗生素抗性的標(biāo)記，所述抗生素抗性如氨芐青霉素、氯霉素、卡那霉素或四環(huán)素抗性。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞合適的標(biāo)記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRPl和URA3。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的選擇性標(biāo)記包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶)、bar(草銨膦(phosphinothricin)乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hph(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸還原酶)(nitratereductase)、pyrG(乳清酸核苷-5，-磷酸脫羧酶)(orotidine-5，-phosphatedecarboxylase),sC(硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶)和trpC(鄰氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase))以及它們的等同物。優(yōu)選用在曲霉屬細(xì)胞中的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因禾口吸水鏈霄菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar基因。所述載體優(yōu)選含有元件，其允許載體整合入宿主細(xì)胞基因組或載體在細(xì)胞中獨(dú)立于基因組的自主復(fù)制。為了整合入宿主細(xì)胞基因組，載體可依賴編碼多肽的多核苷酸的序列或用于通過(guò)同源或非同源重組整合入基因組的任何其它載體元件。或者，載體可以含有額外的多核苷酸，用于指導(dǎo)通過(guò)同源重組整合入宿主細(xì)胞基因組染色體中的精確位置。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應(yīng)含有足夠數(shù)量的核酸，如100至10，000堿基對(duì)，400至10，000堿基對(duì)，和800至10，000堿基對(duì)，其與相應(yīng)的目標(biāo)序列具有高度序列同一性以增強(qiáng)同源重組的概率。整合元件可以是任何序列，其與宿主細(xì)胞基因組中的目標(biāo)序列同源。此夕卜，整合元件可以是非編碼或編碼的多核苷酸。另一方面，可以將載體通過(guò)非同源重組整合到宿主細(xì)胞的基因組中。為了自主復(fù)制，載體可以進(jìn)一步包含復(fù)制起點(diǎn)，其使載體能夠在所述的宿主細(xì)胞中自主地復(fù)制。復(fù)制起點(diǎn)可以是介導(dǎo)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制子(r印licator)，其在細(xì)胞中發(fā)揮功能。術(shù)語(yǔ)“復(fù)制起點(diǎn)”或“質(zhì)粒復(fù)制子”意指能夠使質(zhì)?；蜉d體體內(nèi)復(fù)制的多核苷酸。細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是允許在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復(fù)制起點(diǎn)，和允許在芽孢桿菌屬中復(fù)制的質(zhì)粒pUBllO、pE194、pTA1060和ρΑΜβ1的復(fù)制起點(diǎn)。用于酵母宿主細(xì)胞中的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是2微米復(fù)制起點(diǎn)，ARSl,ARS4，ARSl和CEN3的組合，和ARS4和CEN6的組合。在絲狀真菌細(xì)胞中有用的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是AMAl和ANSI(Gems等，1991，Gene98:61-67；Cullen等，1987，NucleicAcidsRes.15:9163-9175；W000/24883)。分離AMAl基因和構(gòu)建包含該基因的質(zhì)?；蜉d體能夠根據(jù)公開(kāi)于WO00/24883中的方法完成?？梢詫⒍嘤谝粋€(gè)拷貝的多核苷酸插入宿主細(xì)胞以增加多肽的產(chǎn)生。多核苷酸拷貝數(shù)的增加可通過(guò)如下方法獲得將至少一個(gè)額外拷貝的序列整合入宿主細(xì)胞基因組，或?qū)⒖蓴U(kuò)增的選擇性標(biāo)記基因包括于多核苷酸，其中可通過(guò)在合適的選擇劑(selectableagent)存在下培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)選擇含有選擇性標(biāo)記基因的擴(kuò)增拷貝，且由此含有多核苷酸的額外拷貝的細(xì)胞。用于連接上述元件以構(gòu)建重組表達(dá)載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(參見(jiàn)，例如，Sambrook等，1989，見(jiàn)上文)。宿主細(xì)胞包含編碼多肽，例如具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽、纖維素分解酶、半纖維素分解酶等的多核苷酸的重組宿主細(xì)胞可有利地用于多肽的重組產(chǎn)生。將包含此種多核苷酸的構(gòu)建體或載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使載體如前所述作為染色體整體或者作為自復(fù)制的染色體外載體維持。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包括親本細(xì)胞的任何后代，其由于復(fù)制過(guò)程中發(fā)生的突變而不同于親本細(xì)胞。宿主細(xì)胞的選擇將在很大程度上依賴于編碼多肽的基因及其來(lái)源。宿主細(xì)胞可以是在多肽的重組產(chǎn)生中有用的任何細(xì)胞，例如，原核或真核細(xì)胞。原核宿主細(xì)胞可以是任何革蘭氏陽(yáng)性或革蘭氏陰性細(xì)菌。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌包括但不限于，芽孢桿菌屬、梭菌屬、腸球菌屬、地芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、海洋芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬和鏈霉菌屬。革蘭氏陰性細(xì)菌包括但不限于，彎曲桿菌屬、大腸桿菌、黃桿菌屬、梭桿菌屬、螺桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬、假單胞菌屬、沙門氏菌屬和脲原體屬。細(xì)菌宿主細(xì)胞可以是任何芽孢桿菌屬細(xì)胞，包括但不限于嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞。細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈球菌屬細(xì)胞，包括但不限于，似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌和馬鏈球菌獸瘟亞種細(xì)胞。細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈霉菌屬細(xì)胞，包括但不限于，不產(chǎn)色鏈霉菌、除蟲鏈霉菌、天藍(lán)鏈霉菌、灰色鏈霉菌和淺青紫鏈霉菌細(xì)胞?？赏ㄟ^(guò)如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到芽孢桿菌屬細(xì)胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見(jiàn)，例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.168:111-115)，使用感受態(tài)細(xì)胞(參見(jiàn)，例如，Young禾口Spizizen，1961，J.Bacteriol.81:823-829或Dubnau禾口Davidoff-Abelson，1971，J.Mol.Biol.56:209-221)，電穿孔(參見(jiàn)，例如，Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques6:742-751)或接合(參見(jiàn)，例如，Koehler和Thorne，1987，J.Bacteriol.169:5771-5278)。可通過(guò)如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到大腸桿菌細(xì)胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見(jiàn)，例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.166:557-580)或電穿孔(參見(jiàn)，例如，Dower等，1988，NucleicAcidsRes.16:6127-6145)?？赏ㄟ^(guò)如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到鏈霉菌屬細(xì)胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和電穿孔(參見(jiàn)，例如，Gong等，2004，F(xiàn)oliaMicrobiol.(Praha)49:399-405)，接合(參見(jiàn)，例如，Mazodier等，1989，J.Bacteriol.171=3583-3585)，或轉(zhuǎn)導(dǎo)(參見(jiàn)，例如，Burke等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:6289-6294)?？赏ㄟ^(guò)如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到假單胞菌屬細(xì)胞例如電穿孔(參見(jiàn)，例如，Choi等，2006，J.Microbiol.Methods64:391-397)或接合(參見(jiàn)，例如，Pinedo和Smets，2005,Appl.Environ.Microbiol.7151-57)?？赏ㄟ^(guò)如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到鏈球菌屬細(xì)胞例如天然感受態(tài)(naturalcompetence)(參見(jiàn)，例如，Perry和Kuramitsu，1981，Infect.Immun.321295-1297)，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見(jiàn)，例如，Catt和Jollick,1991,Microbios.68:189-207)，電穿孔(參見(jiàn)，例如，Buckley等，1999，Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或接合(參見(jiàn)，例如，Clewell,1981，Microbiol.Rev.45:409-436)。然而，可以使用本領(lǐng)域已知的將DNA引入宿主細(xì)胞的任何方法。宿主細(xì)胞還可以是真核生物，如哺乳動(dòng)物、昆蟲、植物或真菌細(xì)胞。宿主細(xì)胞可為真菌細(xì)胞?！罢婢庇迷诒疚陌ㄒ韵麻T子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)禾口接合菌門(Zygomycota)(如由Hawksworth等，于AinsworthandBisby'sDictionaryofTheFungi,第8版，1995,CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK中所定義)以及卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，見(jiàn)上，171頁(yè)中所引用)，和所有有絲分裂孢子真菌(mitosporicfungi)(Hawksworth等，1995，見(jiàn)上文)。真菌宿主細(xì)胞可為酵母細(xì)胞?！敖湍浮庇迷诒疚陌óa(chǎn)子囊酵母(ascosporogenousyeast)(內(nèi)抱霉目(Endomycetales))、產(chǎn)擔(dān)子酵母(basidiosporogenousyeast)禾口屬于半知菌類(FungiImperfecti)(芽孢綱(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分類在未來(lái)可能改變，就本發(fā)明而言，將酵母定義為如BiologyandActivitiesofYeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.Μ.,禾口Davenport,R.R.編，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9，1980)中所述。酵母宿主細(xì)胞可為假絲酵母屬、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍霉屬細(xì)胞，如乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)、卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母、卵形酵母、或解脂西洋蓍霉(Yarrowialipolytica)細(xì)胞。真菌宿主細(xì)胞可為絲狀真菌細(xì)胞?！敖z狀真菌”包括真菌門(Eumycota)和卵菌門的亞門(如由Hawksworth等，1995，見(jiàn)上文，所定義)的所有絲狀形式。絲狀真菌通常的特征在于由殼多糖(chitin)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它復(fù)雜多糖組成的菌絲體壁。通過(guò)菌絲延伸進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母例如釀酒酵母的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)通過(guò)單細(xì)胞菌體的出芽生殖(budding)進(jìn)行，而碳分解代謝可以是發(fā)酵的。絲狀真菌宿主細(xì)胞可為枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管霉屬(Bjerkandera)、擬蠟菌屬、金孢子菌屬、鬼傘屬(Coprinus)、革蓋菌屬(Coriolus)、隱球菌屬、Filikisidium、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、梨孢菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬(Wianerochaete)、射脈菌屬(Phlebia)、瘤胃壺菌屬、側(cè)耳屬(Pleurotus)、裂褶菌屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、栓菌屬(Trametes)或木霉屬細(xì)胞。絲狀真菌宿主細(xì)胞可為泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霄、米曲霄、黑朿Ij煙管菌(Bjerkanderaadusta)、干擬賭菌(Ceriporiopsisaneirina)、Ceriporiopsiscaregiea>Ceriporiopsisgilvescens>Ceriporiopsispannocinta>Ceriporiopsisrivulosa、Ceriporiopsissubrufa、蟲擬M菌(Ceriporiopsissubvermispora)、Chrysosporiuminops、嗜角質(zhì)金抱子菌、Chrysosporiumlucknowense、Chrysosporiummerdarium>IS金包子菌、Chrysosporiumqueenslandicum>熱帶金3子菌、Chrysosporiumzonatum、灰蓋鬼傘(Coprinuscinereus)、毛革蓋菌(Coriolushirsutus)、桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫(kù)威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢、鑲片鐮孢、特異腐質(zhì)霉、疏棉狀腐質(zhì)霉、米黑毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、產(chǎn)紫青霉、黃孢平革菌(Wianerochaetechrysosporium)、輻射射脈菌(Phlebiaradiata)、刺芹側(cè)耳(Pleurotuseryngii)、土生梭孢霉、長(zhǎng)絨毛栓菌(Trametesvillosa)、變色栓菌CTrametesversicolor)、哈茨木霉、康寧木霉、長(zhǎng)枝木霉、里氏木霉或綠色木霉細(xì)胞?？梢詫⒄婢?xì)胞通過(guò)涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和細(xì)胞壁重建的方法以本身公知的方式轉(zhuǎn)化。用于轉(zhuǎn)化曲霉屬和木霉屬宿主細(xì)胞的合適方法在EP238023和Yelton等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA811470-1474中描述。用于轉(zhuǎn)化鐮孢屬菌種的合適方法由Malardier等，1989，Gene78147-156和WO96/00787描述。可以使用由如下文獻(xiàn)描述的方法轉(zhuǎn)化酵母Becker和Guarente，于Abelson，J.N.和Simon，Μ·I.編，GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology,Volume194,pp182-187,AcademicPress,Inc.，NewYork；Ito等，1983，J.Bacteriol.153:163；禾口Hinnen等，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:1920。產(chǎn)生方法產(chǎn)生多肽，例如具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽、纖維素分解酶、半纖維素分解酶等的方法，包括(a)在有助于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞以其野生型形式能夠產(chǎn)生所述多肽；和(b)回收所述多肽。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述細(xì)胞是曲霉屬的細(xì)胞。在一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述細(xì)胞是煙曲霉?；蛘?，產(chǎn)生多肽，例如具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽、纖維素分解酶、半纖維素分解酶等的方法包括(a)在有助于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞；和(b)回收所述多肽。在產(chǎn)生方法中，使用本領(lǐng)域熟知的方法在適合于產(chǎn)生所述多肽的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。例如，可以通過(guò)在合適培養(yǎng)基中和允許表達(dá)和/或分離所述多肽的條件下進(jìn)行的搖瓶培養(yǎng)，和實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補(bǔ)料分批或固態(tài)發(fā)酵)來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞。使用本領(lǐng)域已知的方法在合適的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基包含碳源和氮源和無(wú)機(jī)鹽。合適的培養(yǎng)基能夠從商業(yè)供應(yīng)商獲得或可以根據(jù)公開(kāi)的組成制備(例如，在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌到營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，該多肽能夠從所述培養(yǎng)基中直接回收。如果多肽不分泌，則其能夠從細(xì)胞裂解物(Iysate)回收?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的對(duì)于所述多肽是特異性的方法來(lái)檢測(cè)多肽。這些檢測(cè)方法可包括特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成或酶底物的消失。例如，酶試驗(yàn)(enzymeassay)可用于測(cè)定多肽的活性。具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽是使用本文中所述的方法檢測(cè)的。所得的培養(yǎng)液可按原樣使用或可以使用本領(lǐng)域已知的方法回收多肽。例如，可以通過(guò)常規(guī)方法從營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中回收多肽，所述常規(guī)方法包括但不限于離心、過(guò)濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。多肽可以通過(guò)多種本領(lǐng)域已知的方法純化以獲得基本上純的多肽，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型(pr印arative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS_PAGE或提取(參見(jiàn)，例如，ProteinPurification,J.-C.Janson禾口LarsRyden編，VCHPublishers,NewYork,1989)。在可選的方面，不回收多肽，而將表達(dá)多肽的宿主細(xì)胞用作多肽的來(lái)源。處理纖維素材料的方法本發(fā)明的組合物和方法可以用于將纖維素材料糖化成可發(fā)酵糖，并且將可發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化成很多有用的物質(zhì)，例如燃料、飲用乙醇和/或發(fā)酵產(chǎn)物(例如酸、醇、酮、氣體等)。從纖維素材料產(chǎn)生期望的發(fā)酵產(chǎn)物通常涉及預(yù)處理、酶水解(糖化)和發(fā)酵。根據(jù)本發(fā)明的纖維素材料的處理可以使用本領(lǐng)域的常規(guī)過(guò)程完成。此外，本發(fā)明的方法能使用經(jīng)配置以依照發(fā)明操作的任何常規(guī)生物質(zhì)處理設(shè)備進(jìn)行。35水解(糖化)和發(fā)酵，分別或同時(shí)，包括但不限于，分離的水解和發(fā)酵(SHF)、同步糖化和發(fā)酵(SSF)、同步糖化和共發(fā)酵(SSCF)、混合的水解和發(fā)酵(HHF)、分離的水解和共發(fā)酵(SHCF)、混合的水解和共發(fā)酵(HHCF)，和直接微生物轉(zhuǎn)化(DMC)。SHF使用分離的處理步驟以首先將纖維素材料酶水解為可發(fā)酵糖，例如，葡萄糖，纖維二糖、纖維三糖和戊糖，然后將可發(fā)酵糖發(fā)酵成為乙醇。在SSF中，將纖維素材料的酶水解和糖變?yōu)橐掖嫉陌l(fā)酵組合在一個(gè)步驟中(Philippidis,G.P.，1996，Cellulosebioconversiontechnology,于HandbookonBioethanol:ProductionandUtilization,ffyman,C.E編，Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)。SSCF包括多種糖的共發(fā)酵(Sheehan,J.，和Himmel，Μ.,1999,Enzymes,energyandtheenvironment:AstrategicperspectiveontheU.S.DepartmentofEnergy'sresearchanddevelopmentactivitiesforbioethanol,Biotechnol.Prog.15:817-827)。HHF在同步糖化和水解步驟之外，還涉及單獨(dú)的水解步驟，所述步驟可以在同一個(gè)反應(yīng)器中進(jìn)行。HHF過(guò)程中的步驟可以在不同的溫度進(jìn)行，S卩，高溫酶糖化，然后在發(fā)酵菌株能夠耐受的較低溫度進(jìn)行SSF。DMC在一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))步驟中組合了所有三個(gè)過(guò)程(酶產(chǎn)生、水解和發(fā)酵)，其中使用相同的生物體產(chǎn)生用于將纖維素材料轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖并將可發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化成終產(chǎn)物的酶(Lynd，L.R.,ffeimer,P.J.,vanZyl,W.H.,禾口Pretorius,I.S.,2002,Microbialcelluloseutilization!Fundamentalsandbiotechnology,Microbiol.Mol.Biol.Reviews66:506-577)。在本文可以理解的是，本領(lǐng)域中任何已知的方法，包括預(yù)處理、酶水解(糖化)、發(fā)酵，或它們的組合，可用于實(shí)施本發(fā)明的方法。常規(guī)設(shè)備包括補(bǔ)料批式攪拌反應(yīng)器、批式攪拌反應(yīng)器、具有超濾的連續(xù)流攪拌反應(yīng)器和/或連續(xù)活塞流柱式反應(yīng)器(FernandadeCastilhosCorazza,FlavioFariadeMoraes,GisellaMariaZanin禾口IvoNeitzel,2003,Optimalcontrolinfed-batchreactorforthecellobiosehydrolysis,ActaScientiarum.Technology25:33-38；Gusakov,A.V.,禾口Sinitsyn,A.P.,1985,Kineticsoftheenzymatichydrolysisofcellulose1.Amathematicalmodelforabatchreactorprocess,Enz.Microb.Technol.7:346-352)、研磨反應(yīng)器(Ryu,S.K.，和Lee，J.Μ.，1983，Bioconversionofwastecellulosebyusinganattritionbioreactor,Biotechnol.Bioeng.25:53-65),或者具有由電磁場(chǎng)引起的強(qiáng)烈攪拌的反應(yīng)器(Gusakov，Α.V.，Sinitsyn,Α.P.，Davydkin,I.Y.,Davydkin,V.Y.,Protas,0.V.,1996,Enhancementofenzymaticcellulosehydrolysisusinganoveltypeofbioreactorwithintensivestirringinducedbyelectromagneticfield,Appl.Biochem.Biotechnol.56:141-153)。其它反應(yīng)器類型包括流化床、升流層(upflowblanket)、固定化和用于水解和/或發(fā)酵的擠出機(jī)型的反應(yīng)器。預(yù)處理。在本發(fā)明的方法的實(shí)施中，可以使用本領(lǐng)域已知的任何預(yù)處理過(guò)程破壞植物細(xì)胞壁的纖維素材料組分(Chandra等，2007，Substratepretreatment:Thekeytoeffectiveenzymatichydrolysisoflignocellulosics？Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.108:67-93；Galbe禾口Zacchi,2007,Pretreatmentoflignocellulosicmaterialsforefficientbioethanolproduction,Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.108:41-65；Hendriks禾口Zeeman,2009,Pretreatmentstoenhancethedigestibilityoflignocellulosicbiomass,BioresourceTechnol.100:10-18；Mosier等，2005，F(xiàn)eaturesofpromisingtechnologiesforpretreatmentoflignocellulosicbiomass，BioresourceTechnol.96:673-686；Taherzadeh禾口Karimi，2008，PretreatmentoflignocellulosicwastestoimproveethanolandbiogasproductionAreview,Int.J.ofMol.Sci.9:1621-1651；Yang禾口Wyman，2008，Pretreatment:thekeytounlockinglow-costcellulosicethanol,BiofuelsBioproductsandBiorefining-Biofpr.2:26-40)。纖維素材料也可以在預(yù)處理之前使用本領(lǐng)域中已知的方法進(jìn)行粒度減小、預(yù)浸泡、潤(rùn)濕、洗滌或調(diào)節(jié)。常規(guī)的預(yù)處理包括但不限于，蒸汽預(yù)處理(伴隨或不伴隨爆炸)、稀酸預(yù)處理、熱水預(yù)處理、堿性預(yù)處理、石灰預(yù)處理、濕氧化、濕爆炸、氨纖維爆炸、有機(jī)溶劑預(yù)處理和生物預(yù)處理。其它預(yù)處理包括氨滲濾、超聲、電穿孔、微波、超臨界CO2、超臨界吐0、臭氧和、輻射預(yù)處理?？梢栽谒夂?或發(fā)酵之前預(yù)處理纖維素材料。預(yù)處理優(yōu)選在水解前進(jìn)行。或者，預(yù)處理可以與酶水解同時(shí)進(jìn)行以釋放可發(fā)酵糖，如葡萄糖、木糖和/或纖維二糖。在大多數(shù)情況下，預(yù)處理步驟本身使一些生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖(甚至在不存在酶的情況下)。蒸汽預(yù)處理。在蒸汽預(yù)處理中，加熱纖維素材料以破壞植物細(xì)胞壁成分，包括木質(zhì)素、半纖維素和纖維素，使酶可接觸纖維素和其它級(jí)分，例如，半纖維素。將纖維素材料通過(guò)或穿過(guò)反應(yīng)容器，其中注入蒸汽以將溫度增加至需要的溫度和壓力，并且在其中保持期望的反應(yīng)時(shí)間。蒸汽預(yù)處理優(yōu)選在140-230°C，更優(yōu)選160-200°C，并且最優(yōu)選170-190°C進(jìn)行，其中最優(yōu)的溫度范圍依賴于加入的任何化學(xué)催化劑。蒸汽預(yù)處理的停留時(shí)間優(yōu)選1-15分鐘，更優(yōu)選3-12分鐘，并且最優(yōu)選4-10分鐘，其中最優(yōu)的停留時(shí)間依賴于溫度范圍和加入的任何化學(xué)催化劑。蒸汽預(yù)處理允許相對(duì)較高的固體加載量，使纖維素材料在預(yù)處理過(guò)程中通常僅僅變得潮濕。蒸汽預(yù)處理經(jīng)常與預(yù)處理后的物質(zhì)的爆炸放料(explosivedischarge)組合，這稱為蒸汽爆炸，即，快速閃變至大氣壓和物質(zhì)的湍流，以通過(guò)破碎增加可接觸的表面積(Duff禾口Murray,1996，BioresourceTechnology8551-33；Galbe和Zacchi，2002，Appl.Microbiol.Biotechnol.59:618-628；美國(guó)專利申請(qǐng)No.20020164730)。在蒸汽預(yù)處理過(guò)程中，切割半纖維素乙酰基團(tuán)，并且得到的酸自催化纖維素部分水解成單糖和寡糖。去除木質(zhì)素僅至有限的程度。經(jīng)常在蒸汽預(yù)處理之前加入催化劑如H2SO4或SO2(通常0.3至3%w/w)，其可減少時(shí)間，降低溫度，增加回收率，并改進(jìn)酶水解(Ballesteros等，2006，Appl.Biochem.Biotechnol.129-132:496-508；Varga^,2004,Appl.Biochem.Biotechnol.113-116509-523；Sassner等·，2006，EnzymeMicrob.Technol.39:756-762)?；瘜W(xué)預(yù)處理術(shù)語(yǔ)“化學(xué)處理“指能促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素分離和/或釋放的任何化學(xué)預(yù)處理。合適的化學(xué)預(yù)處理步驟的實(shí)例包括例如稀酸預(yù)處理、石灰預(yù)處理、濕氧化、氨纖維/冷凍爆炸(AFEX)、氨滲濾(APR)和有機(jī)溶劑預(yù)處理。在稀酸預(yù)處理中，將纖維素材料與稀酸(通常是吐504)和水混合以形成漿料，由蒸汽加熱至期望的溫度，并在一段停留時(shí)間后閃變至大氣壓?？梢杂煤芏喾磻?yīng)器設(shè)計(jì)進(jìn)行稀酸預(yù)處理，例如，活塞流式反應(yīng)器、逆流反應(yīng)器或連續(xù)逆流收縮床反應(yīng)器(Duff和Murray，1996，supra；Schell等，2004，BioresourceTechnol.91:179-188；Lee等，1999，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.65:93-115)。還可以使用堿性條件下的幾種預(yù)處理方法。這些堿性預(yù)處理包括，但不限于，石灰預(yù)處理、濕氧化、氨滲濾(APR)和氨纖維/冷凍爆炸(AFEX)。用碳酸鈣、氫氧化鈉或氨，在85_150°C的低溫進(jìn)行石灰預(yù)處理，停留時(shí)間從1小時(shí)到幾天(Wyman等，2005，BioresourceTechnol.96:1959-1966；Mosier等，2005，BioresourceTechnol.96:673-686)WO2006/11089UW02006/110899,WO2006/110900和WO2006/110901公開(kāi)了使用氨的預(yù)處理方法。濕法氧化是熱預(yù)處理，通常在180-200°C進(jìn)行5_15分鐘，加入氧化劑如過(guò)氧化氫或過(guò)壓氧(Schmidt禾口Thomsen,1998,BioresourceTechnol.64:139-151；Palonen等，2004,Appl.Biochem.Biotechnol.1171-17；Varga^,2004,Biotechnol.Bioeng.88567-574;Martin等，2006，J.Chem.Technol.Biotechnol.81:1669-1677)。預(yù)處理以優(yōu)選1-40%干物質(zhì)，更優(yōu)選2-30%干物質(zhì)，并且最優(yōu)性5-20%干物質(zhì)進(jìn)行，并且由于加入堿如碳酸鈉，初始PH經(jīng)常會(huì)增加。濕法氧化預(yù)處理方法的修改方法，稱為濕爆炸(濕氧化和蒸汽爆炸的組合)，能夠處理高達(dá)30%的干物質(zhì)。在濕爆炸中，在預(yù)處理過(guò)程中在一定的停留時(shí)間后引入氧化劑。然后通過(guò)閃變至大氣壓而結(jié)束預(yù)處理(W02006/032282)。氨纖維爆炸(AFEX)涉及在中溫如90_100°C和高壓如17_20bar，用液體或氣體氨將纖維素材料處理5-10分鐘，其中干物質(zhì)含量可高達(dá)60%(Gollapalli等，2002，Appl.Biochem.Biotechnol.98:23-35；Chundawat等，2007,Biotechnol.Bioeng.96:219-231；Alizadeh^,2005,Appl.Biochem.Biotechnol.121:1133-1141；Teymouri^,2005,BioresourceTechnol.96:2014-2018)。AFEX預(yù)處理導(dǎo)致纖維素解聚，和半纖維素的部分水解。木質(zhì)素-糖復(fù)合物得到切割。有機(jī)溶劑預(yù)處理通過(guò)用含水乙醇00-60%乙醇)在160_200°C提取30-60分鐘而將纖維素材料去木質(zhì)素化(Pan等，2005，Biotechnol.Bioeng.90:473-481；Pan等，2006，Biotechnol.Bioeng.94:851-861；Kurabi等，2005，Appl.Biochem.Biotechnol.121219-230)。經(jīng)常加入硫酸作為催化劑。在有機(jī)溶劑預(yù)處理中，去除大部分半纖維素。合適的預(yù)處理方法的其他實(shí)例如Schell等，2003，Appl.BiochemandBiotechn.Vol.105-108:69-85，和Mosier等，2005，BioresourceTechnology96:673_686，和美國(guó)專利公開(kāi)申請(qǐng)2002/0164730所述。在一個(gè)方面，化學(xué)預(yù)處理優(yōu)選作為酸處理，并且更優(yōu)選作為連續(xù)稀酸和/或弱酸(mildacid)處理進(jìn)行。酸通常是硫酸，但也可以使用其它酸，如乙酸、檸檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氫或其混合物。弱酸處理在優(yōu)選1-5，更優(yōu)選1-4，并且最優(yōu)選1-3的PH范圍內(nèi)進(jìn)行。在一個(gè)方面，酸濃度在優(yōu)選0.01至20wt%酸，更優(yōu)選0.05至IOwt%酸，甚至更優(yōu)選0.1至5wt%酸，并且最優(yōu)選0.2至2.Owt%酸的范圍內(nèi)。酸與纖維素材料接觸，并在優(yōu)選160-220°C，和更優(yōu)選165-195°C范圍內(nèi)的溫度保持?jǐn)?shù)秒到數(shù)分鐘，例如1秒-60分鐘的時(shí)間。在另一個(gè)方面，預(yù)處理作為氨纖維爆炸步驟(AFEX預(yù)處理步驟)進(jìn)行。在另一個(gè)方面，預(yù)處理發(fā)生在含水漿料中。在優(yōu)選的方面，在預(yù)處理過(guò)程中纖維素材料以優(yōu)選10-80wt%，更優(yōu)選20-70wt%，并且最優(yōu)性30-60wt%，如約50wt%的量存在。預(yù)處理的纖維素材料可以不洗滌或者使用本領(lǐng)域任何已知的方法洗滌，例如，用水洗滌。機(jī)械預(yù)處理術(shù)語(yǔ)“機(jī)械預(yù)處理”指各種類型的磨制(grinding)或粉碎(milling)(例如，干磨、濕磨或振動(dòng)球磨)。物理預(yù)處理術(shù)語(yǔ)“物理預(yù)處理”指促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素從纖維素材料分離和/或釋放的任何預(yù)處理。例如，物理預(yù)處理可涉及輻射(例如，微波輻射)、汽蒸/蒸汽爆炸、水熱解(hydrothermolysis)和它們的組合。物理預(yù)處理可以涉及高壓和/或高溫(蒸汽爆炸)。在一個(gè)方面，高壓指優(yōu)選約300至約600psi，更優(yōu)選約350至約550psi，并且最優(yōu)選約400至約500psi，如約450psi的壓力。在另一個(gè)方面，高溫指約100至300°C，優(yōu)選約140至235°C的溫度。在一個(gè)優(yōu)選的方面，機(jī)械預(yù)處理在使用如上所定義的高溫和高壓的分批過(guò)程、蒸汽槍水解器系統(tǒng)，例如來(lái)自SundsDefibratorAB,Sweden的SundsHydrolyzer中進(jìn)行。組合的物理和化學(xué)預(yù)處理可以對(duì)纖維素材料進(jìn)行物理和化學(xué)預(yù)處理。例如，預(yù)處理步驟可以涉及稀酸或弱酸處理和高的溫度和/或壓力處理。根據(jù)需要，可以順序或同時(shí)進(jìn)行物理和化學(xué)預(yù)處理。還可以包括機(jī)械預(yù)處理。因此，在一個(gè)優(yōu)選的方面，對(duì)纖維素材料進(jìn)行機(jī)械、化學(xué)或物理預(yù)處理，或者它們的任何組合，以促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素的分離和/或釋放。生物預(yù)處理術(shù)語(yǔ)“生物預(yù)處理”指可以促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素從纖維素材料分離和/或釋放的任何生物預(yù)處理。生物預(yù)處理技術(shù)可以包括應(yīng)用溶解木質(zhì)素的微生物(參見(jiàn)，例如，Hsu，Τ.-Α.，1996，Pretreatmentofbiomass,于HandbookonBioethanol!ProductionandUtilization,ffyman,C.E編，Taylor&Francis,Washington,DC,179-212；Ghosh禾口Singh,1993,Physicochemicalandbiologicaltreatmentsforenzymatic/microbialconversionoflignocellulosicbiomass,Adv.App1.Microbiol.39:295-333；McMillan,J.D.，1994,Pretreatinglignocellulosicbiomass:areview,于EnzymaticConversionofBiomassforFuelsProduction,Himmel,Μ.Ε.,Baker,J.0.,禾口Overend,R.P.，編，ACSSymposiumSeries566,AmericanChemicalSociety,Washington,DC,第15章；Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.,禾口Tsao,G.Τ.,1999,Ethanolproductionfromrenewableresources,于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,Scheper,Τ.,編，Springer-VerlagBerlinHeidelberg,Germany,65:207-241；Olsson禾口Hahn-Hagerdal,1996,Fermentationoflignocellulosichydrolysatesforethanolproduction,Enz.Microb.Tech.18:312_331；禾口Vallander禾口Eriksson,1990,Productionofethanolfromlignocellulosicmaterials:Stateoftheart,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63-95)。趣化。在水解(也稱作糖化)步驟中，將例如經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料水解以將纖維素或者還有半纖維素分解成可發(fā)酵糖，如葡萄糖、纖維二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和/或可溶的寡糖。水解由本發(fā)明的酶組合物以酶法如本文中所述進(jìn)行。組合物的酶和蛋白組分可順序加入。酶水解優(yōu)選在易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定的條件下，在合適的含水環(huán)境中進(jìn)行。在一個(gè)優(yōu)選的方面，水解在適于酶的活性，即對(duì)于酶最優(yōu)的條件下進(jìn)行。水解可以作為補(bǔ)料批式或連續(xù)的工藝進(jìn)行，其中將經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料(底物)逐漸補(bǔ)加至，例如，含酶的水解溶液中。糖化通常在攪拌釜反應(yīng)器或發(fā)酵罐中，在受控的pH、溫度和混合條件下進(jìn)行。合適的處理時(shí)間、溫度和PH條件可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。例如，糖化可以持續(xù)長(zhǎng)達(dá)200小時(shí)，但是通常優(yōu)選進(jìn)行約12至約96小時(shí)，更優(yōu)選約16至約72小時(shí)，并且最優(yōu)選約24至約48小時(shí)。溫度優(yōu)選約25°C至約70°C，更優(yōu)選約30°C至約65°C，并且最優(yōu)選約40°C至約60°C，特別是約50°C。pH優(yōu)選約3至約8，更優(yōu)選約3.5至約7，并且最優(yōu)選約4至約6，特別是約pH5。干燥固體含量?jī)?yōu)選約5至約50wt%，更優(yōu)選約10至約40wt%，并且最優(yōu)選約20至約30wt%。具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽和酶的最優(yōu)量取決于幾種因素，包括但不限于組分纖維素分解酶的混合物，纖維素底物，纖維素底物的濃度，纖維素底物的預(yù)處理，溫度，時(shí)間，PH和發(fā)酵生物的包含(例如用于同時(shí)糖化和發(fā)酵的酵母)。在一個(gè)方面，纖維素分解酶蛋白對(duì)纖維素材料的有效量為約0.5至50mg，優(yōu)選約0.5至約40mg，更優(yōu)選約0.5至約25mg，更優(yōu)選約0.75至約20mg，更優(yōu)選約0.75至約15mg，甚至更優(yōu)選約0.5至約10mg，且最優(yōu)選約2.5至約IOmg每g纖維素材料。在另一個(gè)方面，具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽對(duì)纖維素材料的有效量為約0.01至約50.Omg,優(yōu)選約0.01至約40mg，更優(yōu)選約0.01至約30mg，更優(yōu)選約0.01至約20mg，更優(yōu)選約0.01至約10mg，更優(yōu)選約0.01至約5mg，更優(yōu)選約0.025至約1.5mg,更優(yōu)選約0.05至約1.25mg,更優(yōu)選約0.075至約1.25mg,更優(yōu)選約0.1至約1.25mg,甚至更優(yōu)選約0.15至約1.25mg,且最優(yōu)選約0.25至約1.Omg每g纖維素材料。在另一個(gè)方面，具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽對(duì)纖維素分解酶蛋白的有效量為約0.005至約1.Og,優(yōu)選約0.01至約1.Og,更優(yōu)選約0.15至約0.75g，更優(yōu)選約0.15至約0.5g，更優(yōu)選約0.1至約0.5g，甚至更優(yōu)選約0.1至約0.5g，且最優(yōu)選約0.05至0.2g每g纖維素分解酶蛋白。發(fā)醛?？赏ㄟ^(guò)一種或多種(幾種)能將糖直接或間接發(fā)酵成所需發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵微生物發(fā)酵自經(jīng)水解的纖維素材料獲得的可發(fā)酵糖?！鞍l(fā)酵”或“發(fā)酵方法”指任何發(fā)酵方法或包含發(fā)酵步驟的任何方法。發(fā)酵方法還包括用于消費(fèi)品醇工業(yè)(例如，啤酒和葡萄酒)、乳品業(yè)(例如，發(fā)酵乳產(chǎn)品)、皮革業(yè)和煙草業(yè)的發(fā)酵方法。發(fā)酵條件依賴于期望的發(fā)酵產(chǎn)物和發(fā)酵生物體，并且能由本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易地確定。在發(fā)酵步驟中，作為預(yù)處理和酶水解步驟的結(jié)果從纖維素材料釋放的糖，通過(guò)發(fā)酵生物體(如酵母)發(fā)酵成為產(chǎn)物，例如，乙醇。如上所述，水解(糖化)和發(fā)酵可以是單獨(dú)或同時(shí)的。在實(shí)施本發(fā)明的發(fā)酵步驟中可以使用任何合適的經(jīng)水解的纖維素材料。通常根據(jù)所需發(fā)酵產(chǎn)品(即，要從發(fā)酵獲得的物質(zhì))和使用的方法來(lái)選擇所述材料，如本領(lǐng)域中所公知的。術(shù)語(yǔ)“發(fā)酵培養(yǎng)基”在本文中可理解為指加入發(fā)酵微生物之前的培養(yǎng)基，如，由糖化過(guò)程產(chǎn)生的培養(yǎng)基，以及同步的糖化和發(fā)酵方法(SSF)中使用的培養(yǎng)基?！鞍l(fā)酵微生物”指適用于理想的發(fā)酵方法以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的任何微生物，包括細(xì)菌和真菌生物體。發(fā)酵生物體可以是(6和/或(5發(fā)酵生物體，或它們的組合。(6和(5發(fā)酵生物體均在本領(lǐng)域公知。合適的發(fā)酵微生物能將糖(如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麥芽糖、甘露糖、半乳糖或寡糖)直接或間接地發(fā)酵(即，轉(zhuǎn)化)成所需的發(fā)酵產(chǎn)品?？僧a(chǎn)生乙醇的細(xì)菌和真菌發(fā)酵生物體的實(shí)例如Lin等，2006，Appl.Microbiol.Biotechnol.69:627-642所述。能發(fā)酵C6糖的發(fā)酵微生物的實(shí)例包括細(xì)菌和真菌生物體，如酵母。優(yōu)選的酵母包括酵母屬菌種，優(yōu)選釀酒酵母。能發(fā)酵C5糖的發(fā)酵生物體的實(shí)例包括細(xì)菌和真菌生物體，如酵母。優(yōu)選的C5發(fā)酵酵母包括畢赤酵母屬，優(yōu)選樹干畢赤酵母(Pichiastipitis)的菌株，如樹干畢赤酵母CBS5773；假絲酵母屬，優(yōu)選博伊丁假絲酵母(Candidaboidinii)、蕓薹假絲酵母(Candidabrassicae)、休哈塔假絲酵母(Candidasheatae)、迪丹斯假絲酵母(Candidadiddensii)、假熱帶假絲酵母(Candidapseudotropicalis)或產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis)的菌株。其它發(fā)酵生物體包括發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)，如運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis)；漢遜酵母屬，如異常漢遜酵母(Hansenulaanomala)；克魯維酵母屬，如脆壁克魯維酵母；裂殖酵母屬，如粟酒裂殖酵母(S.pombe)；和大腸桿菌的菌株，特別是已經(jīng)經(jīng)過(guò)遺傳修飾而改進(jìn)乙醇產(chǎn)量的大腸桿菌菌株。在一個(gè)優(yōu)選的方面，酵母是酵母屬菌種。在一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是釀酒酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是糖化酵母(Saccharomycesdistaticus)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，酵母是克魯維酵母屬。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)0在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是脆壁克魯維酵母。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，酵母是假絲酵母屬。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是博伊丁假絲酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是蕓薹假絲酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是迪丹斯假絲酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是假熱帶假絲酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是產(chǎn)朊假絲酵母。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，酵母是棒孢酵母屬(Clavispora)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是葡萄牙棒孢酵母(Clavisporalusitaniae)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是仙人掌棒孢酵母(Clavisporaopuntiae)。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，酵母是管囊酵母屬(Pachysolen)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是嗜鞣管囊酵母(Pachysolentannophilus)0在另一個(gè)優(yōu)選的方面，酵母是畢赤酵母屬。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是樹干畢赤酵母。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，酵母是酒香酵母屬(Bretarmomyces)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，酵母是克勞森酒香酵母(Bretannomycesclausenii)(Philippidis,G.P.,1996,Cellulosebioconversiontechnology,于HandbookonBioethanolProductionandUtilization,ffyman,C.E.編，Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)。能有效地將己糖和戊糖發(fā)酵成乙醇的細(xì)菌包括，例如，運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌和熱纖維梭菌(Clostridiumthermocellum)(Philippidis,1996，見(jiàn)上文)。在一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌是發(fā)酵單胞菌屬。在更優(yōu)選的方面，細(xì)菌是運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌是梭菌屬。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，細(xì)菌是熱纖維梭菌。商業(yè)上可得到的適合乙醇產(chǎn)生的酵母包括，例如ETHANOLRED酵母(可從RedMar/Lesaffre，USA獲得)、FALI(可從Fleischmann，sYeast,BurnsPhilpFoodInc.,USA獲得)、SUPERSTART和THERM0SACC新鮮酵母(可從KhanolTechnology,WI，USA獲得)、BIOFERMAFT和XR(可從NABC-NorthAmericanBioproductsCorporation,GA,USA獲得)、GERTSTRAND(可從GertStrandAB,Sweden獲得)和FERMIOL(可從DSMSpecialties獲得)。在一個(gè)優(yōu)選的方面，發(fā)酵微生物已經(jīng)經(jīng)過(guò)遺傳修飾，提供發(fā)酵戊糖的能力，如利用木糖、利用阿拉伯糖和共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物。通過(guò)將異源基因克隆入多種發(fā)酵微生物已經(jīng)構(gòu)建了能將己糖和戊糖轉(zhuǎn)化成乙醇(共發(fā)酵)的生物體(Chen禾口Ho，1993，CloningandimprovingtheexpressionofPichiastipitisxylosereductasegeneinSaccharomycescerevisiae，App1.Biochem.Biotechnol.39-40135-147；Ho等，1998，GeneticallyengineeredSaccharomycesyeastcapableofeffectivelycofermentingglucoseandxylose,App1.Environ.Microbiol.64:1852-1859；Kotter禾口Ciriacy，1993，XylosefermentationbySaccharomycescerevisiae,Appl.Microbiol.Biotechnol.38:776-783；Walfridsson等，1995，Xylose-metabolizingSaccharomycescerevisiaestrainsoverexpressingtheTKLlandTALIgenesencodingthepentosephosphatepathwayenzymestransketolaseandtransaldolase,Appl.Environ.Microbiol.61:4184-4190；Kuyper等，2004，MinimalmetabolicengineeringofSaccharomycescerevisiaeforefficientanaerobicxylosefermentation:aproofofprinciple，F(xiàn)EMSYeastResearch4655-664;Beall等，1991，ParametricstudiesofethanolproductionfromxyloseandothersugarsbyrecombinantEscherichiacoli,Biotech.Bioeng.38:296-303；Ingram等，1998，Metabolicengineeringofbacteriaforethanolproduction,Biotechnol.Bioeng.58:204-214；Zhang等，1995，MetabolicengineeringofapentosemetabolismpathwayinethanologenicZymomonasmobilis，Science267:240-243;Deanda等，1996，Developmentofanarabinose-fermentingZymomonasmobilisstrainbymetabolicpathwayengineering,Appl.Environ.Microbiol.62:4465-4470；WO2003/062430,xyloseisomerase)0在一個(gè)優(yōu)選的方面，經(jīng)過(guò)遺傳修飾的發(fā)酵微生物是釀酒酵母。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，經(jīng)過(guò)遺傳修飾的發(fā)酵微生物是運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，經(jīng)過(guò)遺傳修飾的發(fā)酵微生物是大腸桿菌。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，經(jīng)過(guò)遺傳修飾的發(fā)酵微生物是產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)0在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述經(jīng)遺傳修飾的發(fā)酵微生物是克魯維酵母屬菌種。本領(lǐng)域中公知的是，上述生物體還能用于產(chǎn)生其它物質(zhì)，如本文所述。通常向降解的木素纖維素或水解物加入發(fā)酵微生物，并進(jìn)行約8至約96小時(shí)，如約M至約60小時(shí)發(fā)酵。溫度通常為約至約60°C，特別是約32°C或50°C，并且在約pH3至約pH8，如約pH4-5,6或7。在一個(gè)優(yōu)選的方面，對(duì)降解的纖維素材料施用酵母和/或另一種微生物，并進(jìn)行約12至約96小時(shí)，如通常為24-60小時(shí)發(fā)酵。在一個(gè)優(yōu)選的方面，溫度優(yōu)選為約20°C至約60°C，更優(yōu)選約25°C至約50°C，并且最優(yōu)選約32°C至約50°C，特別是約32°C或50°C，并且PH通常為約pH3至約pH7，優(yōu)選約pH4_7。然而，一些發(fā)酵生物體例如細(xì)菌，具有更高的最適發(fā)酵溫度。酵母或另一種微生物優(yōu)選以約IO5-IO12,優(yōu)選約IO7-IOltl,特別是約MlO842活細(xì)胞計(jì)數(shù)每ml發(fā)酵液的量施用。關(guān)于使用酵母進(jìn)行發(fā)酵的進(jìn)一步指導(dǎo)可以在例如“TheAlcoholTextbook，，(K.Jacques,Τ.P.Lyons禾口D.R.Kelsall編，NottinghamUniversityPress,UnitedKingdom1999)中找到，其通過(guò)提述并入本文。對(duì)于乙醇生產(chǎn)，在發(fā)酵后蒸餾發(fā)酵的漿料以提取乙醇。根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的乙醇可以用作，例如燃料乙醇；飲料乙醇，即，中性飲料酒，或工業(yè)乙醇。發(fā)酵刺激劑可以與本文所述的任何方法組合使用，以進(jìn)一步改進(jìn)發(fā)酵工藝，而且特定地，改進(jìn)發(fā)酵微生物的性能，如，速率增加和乙醇得率?！鞍l(fā)酵刺激劑”指用于發(fā)酵微生物(特別是酵母)生長(zhǎng)的刺激劑。優(yōu)選的用于生長(zhǎng)的發(fā)酵刺激劑包括維生素和礦物質(zhì)。維生素的實(shí)例包括多種維生素、生物素、泛酸(鹽)、煙酸、內(nèi)消旋肌醇(meso-inositol)、硫胺素、吡哆醇(pyridoxine)、對(duì)氨基苯甲酸、葉酸、核黃素和維生素A、B、C、D禾口E。參見(jiàn),例如，Alfenore等，ImprovingethanolproductionandviabilityofSaccharomycescerevisiaebyavitaminfeedingstrategyduringfed-barchprocess，Springer-Verlag(2002)，其通過(guò)提述并入本文。礦物質(zhì)的實(shí)例包括能夠提供營(yíng)養(yǎng)物的礦物質(zhì)和礦物質(zhì)鹽，所述營(yíng)養(yǎng)物包括P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu。發(fā)酵產(chǎn)物發(fā)酵產(chǎn)物可以是源自發(fā)酵的仵何物質(zhì)。發(fā)酵產(chǎn)物可為，不限于，醇(例如，阿拉伯醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1，3_丙二醇、山梨醇和木糖醇)；有機(jī)酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗壞血酸、檸檬酸、2，5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羥基丙酸、衣康酸、乳酸、蘋果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)；和氣體(例如，甲烷、氫氣(H2)、二氧化碳(CO2)和一氧化碳(C0))。發(fā)酵產(chǎn)物還可以是作為高價(jià)值產(chǎn)品的蛋白質(zhì)。在一個(gè)優(yōu)選的方面，發(fā)酵產(chǎn)物是醇?？衫斫獾氖?，術(shù)語(yǔ)“醇”包括包含一個(gè)或多個(gè)羥基基團(tuán)的物質(zhì)。在更優(yōu)選的方面，所述醇是阿拉伯醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是丁醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是乙醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是甘油。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是甲醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是1，3_丙二醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是山梨醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述醇是木糖醇。參見(jiàn)，例如，Gong,C.S.，Cao,N.J.，Du,J.，禾口Tsao，G.Τ.，1999，Ethanolproductionfromrenewableresources，于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,Scheper,T.編，Springer-VerlagBerlinHeidelberg，Germany,65:207-241；Silveira，Μ.M.，禾口Jonas，R.，2002，Thebiotechnologicalproductionofsorbitol，Appl.Microbiol.Biotechnol.59:400-408；Nigam，P.，禾口Singh，D.，1995，Processesforfermentativeproductionofxylitol-asugarsubstitute，ProcessBiochemistry30(2):117-124;Ezeji,T.C.,Qureshi,N.禾口Blaschek，H.P.，2003，Productionofacetone,butanolandethanolbyClostridiumbeijerinckiiBAlOlandinsiturecoverybygasstripping,WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnology19(6):595_603o在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述物質(zhì)是有機(jī)酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是乙酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是醋酮酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是己二酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是抗壞血酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是檸檬酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是2，5-二酮-D-葡糖酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是甲酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是反丁烯二酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是葡糖二酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是葡糖酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是葡糖醛酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是戊二酸。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是3-羥基丙酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是衣康酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是乳酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是蘋果酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是丙二酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是草酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是丙酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是琥珀酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是木糖酸。參見(jiàn)，例如，Chen，R.，禾口Lee，Y.Y.，1997，Membrane-mediatedextractivefermentationRorlacticacidproductionfromcellulosicbiomass，Appl.Biochem.Biotechnol.63—65:435_4480在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述物質(zhì)是酮。可理解的是術(shù)語(yǔ)“酮”涵蓋含有一個(gè)或多個(gè)酮基的物質(zhì)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述酮是丙酮。參見(jiàn)，例如，Qureshi和Blaschek，2003，見(jiàn)上文。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述物質(zhì)是氨基酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述有機(jī)酸是天冬氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是谷氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是甘氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是賴氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是絲氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氨基酸是蘇氨酸。參見(jiàn)，例如，Richard，A.,禾口Margaritis,A.,2004,Empiricalmodelingofbatchfermentationkineticsforpoly(glutamicacid)productionandothermicrobialbiopolymers,BiotechnologyandBioengineering87(4):501_515o在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述物質(zhì)是氣體。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氣體是甲烷。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氣體是H2。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氣體是C02。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述氣體是CO。參見(jiàn)，例如，Kataoka，N.，A.Miya，和K.Kiriyama,1997,Studiesonhydrogenproductionbycontinuousculturesystemofhydrogen-producinganaerobicbacteria,WaterScienceandTechnology36(6-7)41-47；禾口GunaseelanV.N.于BiomassandBioenergy,Vol.13(1-2),pp.83-114,1997,Anaerobicdigestionofbiomassformethaneproduction:Areview。回收可以使用本領(lǐng)域已知的任何方法，任選地從發(fā)酵培養(yǎng)基回收發(fā)酵產(chǎn)物，所述方法包括，但不限于，層析、電泳方法、差示溶解度、蒸餾或提取。例如，通過(guò)常規(guī)蒸餾方法從發(fā)酵的纖維素材料分離并純化醇?？梢垣@得純度高達(dá)約96ν01%的乙醇，其能用作，例如，燃料乙醇、飲用乙醇，即，中性飲料酒，或工業(yè)乙醇。通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述，但不應(yīng)將其理解為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。實(shí)施例材料作為緩沖液和底物使用的化學(xué)品是至少試劑等級(jí)的商業(yè)產(chǎn)品。菌株使用煙曲霉(NN051616)作為編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的家族61多肽的基因的來(lái)源。使用米曲霉JaL355株(W02002/40694)表達(dá)具有纖維素分解增強(qiáng)活性的煙曲霉家族61多肽。培養(yǎng)基pda平板由39g的馬鈴薯右旋糖瓊脂和去離子水至1升組成。YPG培養(yǎng)基由iog的酵母提取物，iog的細(xì)菌蛋白胨，20g的葡萄糖和去離子水至1升組成。YPM培養(yǎng)基由iog的酵母提取物，iog的細(xì)菌蛋白胨，20g的麥芽糖和去離子水至1升組成。M410培養(yǎng)基由50g的麥芽糖，50g的葡萄糖，2g的MgS04_7H20，2g的KH2PO4,4g的檸檬酸無(wú)水粉末，8g的酵母提取物，2g的尿素，0.5g的AMG微量金屬溶液，0.5g的CaCl2和去離子水至1升(pH6.0)組成。AMG微量金屬溶液由14.3g的ZnSO4·7H20，2.5g的CuSO4·5Η20，0·5g的NiCl2·6H20,13.8g的FeSO4·7Η20，8·5g的MnSO4·H2O,3g的檸檬酸，和去離子水至1升組成。實(shí)施例1鑒定煙曲霉基因組序列中的糖基水解酶家族gh61基因使用幾種已知的GH61蛋白包括來(lái)自桔橙嗜熱子囊菌的GH61A(Gen必eqP登錄號(hào)AEC05922)作為查詢序列(query)進(jìn)行煙曲霉部分基因組序列(TheInstituteforGenomicResearch,Rockville,MD)白勺tblastnWM(Altschul1997,NucleicAcidsRes.25:3389-3402)。基于與查詢序列在氨基酸水平的高度類似性將幾種基因鑒定為推定的家族GH61同源物。選擇一個(gè)大約850bp，與桔橙嗜熱子囊菌GH61A序列在氨基酸水平具有大于70%序列同一性的基因組區(qū)以供進(jìn)一步研究。實(shí)施例2煙曲霉基因組DNA提取如美國(guó)專利7，M4，605號(hào)中所述培養(yǎng)并收獲煙曲霉NN051616。將凍結(jié)的菌絲體用杵和研缽磨碎至細(xì)粉，并使用DNEASYPlantKit(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)依照生產(chǎn)商的指示分離基因組DNA。實(shí)施例3構(gòu)建用于煙曲霉家族GH61B基因的米曲霉表達(dá)載體設(shè)計(jì)了下文所示的兩個(gè)合成的寡核苷酸引物以從基因組DNAPCR擴(kuò)增煙曲霉家族GH61B蛋白基因。使用IN-FUSIONCloningKit(BDBiosciences,PaloAlto,CA,USA)將該片段直接克隆入表達(dá)載體pAlLo2(W02005/074647)，無(wú)需限制性消化和連接。正向引物5'-ACTGGATTTACCATGACTTTGTCCAAGATCACTTCCA-3'(SEQIDNO65)反向引物5，-tcacctctagttaatTAAGCGTTGMCAGTGCAGGACCAG-3，(seqidno:66)粗體字母代表編碼序列。剩余序列與PA1L02的插入位點(diǎn)同源。將上述引物各五十皮摩爾用于擴(kuò)增反應(yīng)，其包含2(Mng的煙曲霉基因組DNA(如實(shí)施例2中所述制備)，IXPfxAmplificationBuffer(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)，1.5μ1的IOmMdATP,dTTP,dGTP禾口dCTP混合物，2.5單位的PLATINUMPfxDNAPolymerase(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，和1μ1的5OmMMgSO4,終體積為50μ1。擴(kuò)增使用EPPENDORFMASTERCYCLER5333印gradientS(EppendorfScientific,Inc.，ffestbury,NY,USA)進(jìn)行，程序如下一個(gè)循環(huán)94°C進(jìn)行3分鐘；30個(gè)循環(huán)，每循環(huán)在94°C進(jìn)行30秒，56°C進(jìn)行30秒和72°C進(jìn)行1分鐘。然后將加熱塊保持在72°C進(jìn)行15分鐘，接著進(jìn)行4°C浸泡循環(huán)。通過(guò)使用40mMTris堿-20mM乙酸鈉-ImMEDTA二鈉(TAE)緩沖液的1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離反應(yīng)產(chǎn)物，其中從凝膠切出了大約850bp產(chǎn)物條帶，并使用MINELUTEGelExtractionKit(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)依照生產(chǎn)商的指示純化。然后將片段使用IN-FUSIONCloningKit克隆入PAlLo2。將載體用NcoI和I^acI消化。如上所述通過(guò)凝膠電泳和QIAQUICKGelPurificationKit(QIAGENInc.，Valencia,CA,USA)純化片段。將基因片段和經(jīng)消化的載體在反應(yīng)中合并在一起，得到表達(dá)質(zhì)粒PAG43(圖2)，其中家族GH61B蛋白基因的轉(zhuǎn)錄在NA2_tpi啟動(dòng)子(來(lái)自黑曲霉中性α-淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因的啟動(dòng)子的雜合體)調(diào)控之下。重組反應(yīng)物(20μ1)由IXIN-Fl^IONBuffer(BDBiosciences，PaloAlto,CA,USA)，IXBSA(BDBiosciences,PaloAlto,CA,USA)，1μ1的IN-Fl^ION酶(1:10稀釋)(BDBiosciences,PaloAlto,CA,USA)，166ng的用NcoI和PacI消化的pAlLo2，禾口IlOng的煙曲霉GH61B蛋白純化PCR產(chǎn)物。將反應(yīng)物在37°C溫育15分鐘，接著在50°C溫育15分鐘。將反應(yīng)物用40μ1的IOmMTris-0.IMEDTA緩沖液稀釋，并使用2.5μ1稀釋的反應(yīng)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌SOLOPACKGoldCompetent細(xì)胞(Stratagene，LaJolla,CA,USA)通過(guò)限制性酶消化鑒定了含有PAG43(GH61B蛋白基因)的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體，并使用BIOROBOT9600(QIAGENInc.，Valencia,CA,USA)制備了質(zhì)粒DNA。實(shí)施例4編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的家族61多肽的煙曲霉基因組序列的表征用Perkin-ElmerAppliedBiosystemsModel377XLAutomatedDNASequencer使用染料終止子化學(xué)(Giesecke等，1992，見(jiàn)上)和引物步移策略進(jìn)行862bpPCR片段的DNA測(cè)序。使用下述載體特異性引物進(jìn)行測(cè)序ρΑ11ο25序列5'TGTCCCTTGTCGATGCG3'(SEQIDNO67)ρΑ11ο23序列5'CACATGACTTGGCTTCC3'(SEQIDNO68)在PHRED/PHRAP軟件(UniversityofWashington,Seattle,WA,USA)的協(xié)助下細(xì)查核苷酸序列數(shù)據(jù)的品質(zhì)并將所有序列彼此比較。基于編碼的蛋白對(duì)具有纖維素分解增強(qiáng)活性的桔橙嗜熱子囊菌GH61A多肽(GenekqP登錄號(hào)AEC05922)的類似性構(gòu)建了煙曲霉序列的基因模型。煙曲霉GH61B基因的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列，分別為SEQIDNO1和SEQIDNO:2，示于圖1?；蚪M片段編碼250個(gè)氨基酸的多肽，其由53和56bp的兩個(gè)內(nèi)含子所分隔?；蚝统墒炀幋a序列的％G+C含量分別為53.9%和57%。使用SignalP軟件程序(Nielsen等，1997，見(jiàn)上)，預(yù)測(cè)出了21個(gè)殘基的信號(hào)肽。預(yù)期的成熟蛋白含有2個(gè)氨基酸，具有23.39kDa的預(yù)期分子量。使用如實(shí)施于EMBOSS的Needle程序的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970，J.Mol.Biol.48:443-453)，以缺口開(kāi)放罰分為10，缺口延伸罰分為0.5禾口EBL0SUM62矩陣，確定了氨基酸序列的比較性配對(duì)全局比對(duì)(comparativepairwiseglobalalignment)。該比對(duì)顯示編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61成熟多肽的煙曲霉基因的推導(dǎo)的氨基酸序列與具有纖維素分解增強(qiáng)活性的桔橙嗜熱子囊菌GH61A多肽(GeneSeqP登錄號(hào)AEC05922)的推導(dǎo)的氨基酸序列分享72.6%序列同一性(排除缺口)。實(shí)施例5在米曲霉JaL355中表達(dá)編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的GH61B多肽的煙曲霉基因組DNA米曲霉JaL355原生質(zhì)體是根據(jù)Christensen等，1988，Bio/Technology61419-1422的方法制備的，并用6μg的pAG43轉(zhuǎn)化。將二十六個(gè)轉(zhuǎn)化體分離至單個(gè)PDA平板。將M個(gè)轉(zhuǎn)化體的匯合的PDA平板分別用5ml的0.01%TWEEN20洗滌，并分別收集孢子。將八μ1的每個(gè)孢子儲(chǔ)備分別添加至M孔板中的Iml的YPG、YPM和M410培養(yǎng)基，并在;34°C溫育。在溫育3日之后，使用CRITERION無(wú)染色(Stain-free)，8-16%梯度SDS-PAGE凝膠(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)依照生產(chǎn)商的指示分析來(lái)自四個(gè)轉(zhuǎn)化體的7.5μ1上清?；谠撃z，選擇Μ410為最優(yōu)培養(yǎng)基。在溫育五日之后，使用CRITERION無(wú)染色，8-16%梯度SDS-PAGE凝膠分析來(lái)自每個(gè)M410培養(yǎng)的7.5μ1上清。培養(yǎng)物的SDS-PAGE圖譜(profile)顯示幾個(gè)轉(zhuǎn)化體具有大約25kDa的新的主條帶。將一個(gè)轉(zhuǎn)化體(在PDA上生長(zhǎng))的匯合平板用5ml的0.01%TWEEN20洗滌，并接種至四個(gè)含有100ml的M410培養(yǎng)基的500ml的錐形瓶以生成供表征酶的培養(yǎng)液。在第5日收獲燒瓶(300ml)，使用0.22μπιStericup吸濾器(suctionfilter)(Millipore,Bedford,MA,USA)過(guò)濾，并在4°C儲(chǔ)存。實(shí)施例6具有纖維素分解增強(qiáng)活性的煙曲霉GH61B多肽的純化使用IOkDaMWCOAMICONUltra離心濃縮器(Millipore,Bedford,MA,USA)將含有具有纖維素分解增強(qiáng)活性的煙曲霉GH61B多肽的經(jīng)過(guò)濾的搖瓶培養(yǎng)液(實(shí)施例5)濃縮至大約10倍更小的體積。使用在20mM三(羥甲基)氨基甲烷(Sigma，St.Louis，M0，USA)pH8·0中預(yù)平衡的BIO-GELP-6脫鹽柱(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)依照生產(chǎn)商的指示(但包括下述不同加載3ml樣品并用3ml緩沖液洗脫)對(duì)濃縮的濾過(guò)物進(jìn)行緩沖液交換和脫鹽。使用將牛血清白蛋白(Pierce，RoCkford，IL，USA)用作蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)的BCA測(cè)定法(Pierce，Rockford，IL,USA)對(duì)經(jīng)濃縮和脫鹽的GH61B蛋白進(jìn)行定量。定量重復(fù)進(jìn)行三次。使用8-16%梯度SDS-PAGE在200伏進(jìn)行1小時(shí)并用CoomassieBio-SafeStain(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)染色來(lái)石角證酶純度。實(shí)施例7玉米秸稈的預(yù)處理玉米禾吉禾干在U.S.DepartmentofEnergyNationalRenewableEnergyLaboratory(NREL)使用稀硫酸預(yù)處理。下述條件用于預(yù)處理在165°C和107psi以1.稀硫酸進(jìn)行8分鐘。根據(jù)NREL，經(jīng)預(yù)處理的玉米秸稈中的不溶于水的固體含有57.5%纖維素、4.6%半纖維素和28.4%木質(zhì)素。纖維素和半纖維素是通過(guò)兩階段硫酸水解及隨后使用NRELStandardAnalyticalProcedure#002進(jìn)行的高效液相色譜的糖分析來(lái)確定的。木質(zhì)素是在使用NRELStandardAnalyticalProcedure#003用硫酸水解纖維素和半纖維素級(jí)分之后以重量分析法確定的。在使用前磨制并用水洗滌經(jīng)預(yù)處理的玉米秸稈。經(jīng)磨制洗滌的經(jīng)預(yù)處理的玉米秸稈(起始干重32.35%)是通過(guò)在CosmosICMG40濕式多用途研磨機(jī)(wetmulti-utilitygrinder)(EssEmmCorporation,TamilNadu,India)中磨制，繼以用去離子水反復(fù)洗滌，并傾去上清級(jí)分來(lái)制備的。發(fā)現(xiàn)經(jīng)磨制、水洗的經(jīng)預(yù)處理的玉米秸稈的干重量為7.114%。實(shí)施例8通過(guò)具有纖維素分解增強(qiáng)活性的煙曲霉GH61B多肽增強(qiáng)經(jīng)預(yù)處理的玉米秸稈的水解經(jīng)預(yù)處理的玉米秸稈的水解是使用含有Ig總反應(yīng)質(zhì)量的2.2ml，96_深孔板(Axygen,UnionCity,CA)進(jìn)行的。水解是用經(jīng)洗滌、預(yù)處理的玉米秸稈的5%總固體進(jìn)行的，所述固體相當(dāng)于在含有ImM硫酸錳和^ig每8纖維素的里氏木霉纖維素酶組合物(補(bǔ)充了可從NovozymesA/S，Bagsvaerd,Denmark獲得的米曲霉β-葡糖苷酶的CELLUCLAST;在本文實(shí)施例中該纖維素酶組合物命名為“里氏木霉纖維素酶組合物”)的50mM乙酸鈉pH5.O緩沖液中每ml28.75mg纖維素。將煙曲霉GH61B多肽以O(shè)至93%(w/w)總蛋白的濃度添加。將板使用ALPS-300板熱密封器(plateheatsealer)(Abgene,Epsom,UnitedKingdom)密封，并在50°C以150rpm振蕩溫育O至168小時(shí)。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行兩次或三次。在溫育M至168小時(shí)之間的多個(gè)時(shí)點(diǎn)，移出100μ1等分試樣，并通過(guò)高效液相色譜(HPLC)使用下述實(shí)驗(yàn)方案測(cè)定水解程度。對(duì)于HPLC分析，用0.45μmMULTISCREEN96孔過(guò)濾板(filterplate)(Millipore,Bedford,MA,USA)過(guò)濾樣品，并如下所述就糖含量對(duì)濾過(guò)物進(jìn)行分析。使用4.6x250mmAMINEXHPX-87Hfe(Bio-RadLaboratories,Inc.，Hercules,CA,USA)Μ.過(guò)用0.5%w/w苯甲酸-5mMH2SO4以0.6ml每分鐘的流速在65°C洗脫11分鐘，并通過(guò)對(duì)來(lái)自由純糖樣品校準(zhǔn)的折射率檢測(cè)(CHEMSTATION,AGILENT1100HPLC，AgilentTechnologies,SantaClara,CA,USA)的葡萄糖和纖維二糖信號(hào)進(jìn)行積分而進(jìn)行定量，來(lái)測(cè)量在0.005MH2S04中稀釋的樣品的糖濃度。將所得的當(dāng)量值用于對(duì)于每個(gè)反應(yīng)計(jì)算纖維素轉(zhuǎn)化的百分比。每次水解的程度作為轉(zhuǎn)化為纖維二糖+葡萄糖的總纖維素的比率(fraction)來(lái)確定，且不對(duì)存在于經(jīng)預(yù)處理的玉米秸稈液中的可溶性糖進(jìn)行校正。^ffiKaleidagraph(Synergysoftware,Reading,PA,USA)S^fIifWWHPLC數(shù)據(jù)處理。針對(duì)適當(dāng)?shù)南♂屢蜃诱{(diào)整測(cè)得的糖濃度。對(duì)葡萄糖和纖維二糖用色譜法分離并進(jìn)行積分，并獨(dú)立確定其各自的濃度。然而，為了計(jì)算總轉(zhuǎn)化率，將葡萄糖和纖維二糖值合并。水解比率(fractionhydrolysi)報(bào)道為轉(zhuǎn)化為[葡萄糖+纖維二糖]的總質(zhì)量/[總纖維素](overallmassconversionto[glucose+cellobiose]/[totalcellulose])。)^三次重復(fù)的數(shù)據(jù)點(diǎn)取平均值，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差。將水解比率作為煙曲霉GH61B蛋白濃度的函數(shù)作圖，并用修飾的飽和結(jié)合模型使用Kaleidagraph(SynergySoftware)進(jìn)行擬合。結(jié)果示于圖3，顯示了在煙曲霉GH61B多肽的存在下通過(guò)里氏木霉纖維素酶組合物的水解的增強(qiáng)。通過(guò)下述編號(hào)段落進(jìn)一步描述本發(fā)明[1]一種降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法，包括在具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的存在下用酶組合物處理纖維素材料，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽選自下組(a)多肽，其包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少75%序列同一性的氨基酸序列；(b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在中-高嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(c)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少75%序列同一性的核苷酸序列；和(d)SEQIDNO2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的變體。[2]段1的方法，其中所述纖維素材料經(jīng)預(yù)處理。[3]段1或2的方法，其中所述酶組合物包含一種或多種(幾種)選自下組的纖維素分解酶內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。[4]段1-3任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物包含或進(jìn)一步包含一種或多種(幾種)選自下組的蛋白半纖維素酶、棒曲霉素、酯酶、木質(zhì)素分解酶、果膠酶、過(guò)氧化物酶、蛋白酶和膨脹素(swollenin)。[5]段4的方法，其中所述半纖維素酶是一種或多種(幾種)選自下組的酶乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。[6]段1-5任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括回收經(jīng)降解的纖維素材料。[7]段6的方法，其中所述經(jīng)降解的纖維素材料是糖。[8]段7的方法，其中所述糖選自下組葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖。[9]段1-8任一項(xiàng)的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少75%序列同一性的氨基酸序列。[10]段9的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。[11]段10的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。[12]段11的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。[13]段12的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少95%序列同一性的氨基酸序列。[14]段13的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少97%序列同一性的氨基酸序列。[15]段1-14任一項(xiàng)的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸序列或其成熟多肽，或它們具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段，或所述多肽由SEQIDNO:2的氨基酸序列或其成熟多肽，或它們具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段組成。[16]段1-8任一項(xiàng)的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在中-高嚴(yán)格條件下與下列雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，()包含于SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，(iii)⑴或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。[17]段16的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在高嚴(yán)格條件下與下列雜交(i)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。[18]段17的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在非常高嚴(yán)格條件下與下列雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。[19]段1-8任一項(xiàng)的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少75%序列同一性的核苷酸序列。[20]段19的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少80%序列同一性的核苷酸序列。[21]段20的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少85%序列同一性的核苷酸序列。[22]段21的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少90%序列同一性的核苷酸序列。[23]段22的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少95%序列同一性的核苷酸序列。[24]段23的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少97%序列同一性的核苷酸序列。[25]段I-M任一項(xiàng)的方法，其中具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含SEQIDNO:1的核苷酸序列或其成熟多肽編碼序列，或它們編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段的亞序列，或者所述多核苷酸由SEQIDNO:1的核苷酸序列或其成熟多肽編碼序列，或它們編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段的亞序列組成。[26]段1-8任一項(xiàng)的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽是SEQIDNO2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的變體。[27]段146任一項(xiàng)的方法，其中所述SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列是SEQIDNO1的核苷酸64至859。[28]段1-27任一項(xiàng)的方法，其中SEQIDNO2的成熟多肽是SEQIDNO2的氨基酸22至250。[29]一種產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括(A)在具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的存在下用酶組合物糖化纖維素材料，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽選自下組(a)多肽，其包含與SEQIDN0:2的成熟多肽具有至少75%序列同一性的氨基酸序列；(b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在中-高嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(c)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少75%序列同一性的核苷酸序列；和(d)SEQIDNO:2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的變體；(B)用一種或多種(幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵糖化的纖維素材料；和(C)從發(fā)酵回收發(fā)酵產(chǎn)物。[30]段四的方法，其中所述纖維素材料經(jīng)預(yù)處理。[31]段四或30的方法，其中所述酶組合物包含一種或多種(幾種)選自下組的纖維素分解酶內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。[32]段四-31任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物包含或進(jìn)一步包含一種或多種(幾種)選自下組的蛋白半纖維素酶、棒曲霉素、酯酶、木質(zhì)素分解酶、果膠酶、過(guò)氧化物酶、蛋白酶和膨脹素(swollenin)。[33]段32的方法，其中所述半纖維素酶是一種或多種(幾種)選自下組的酶乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。[34]段四-33任一項(xiàng)的方法，其中步驟(A)和(B)是在同時(shí)糖化和發(fā)酵中同時(shí)進(jìn)行。[35]段四-34任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)物是醇、有機(jī)酸、酮、氨基酸或氣體。[36]段四-35任一項(xiàng)的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽包含與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少75%序列同一性的氨基酸序列。[37]段36的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。[38]段37的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。[39]段38的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。[40]段39的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少95%序列同一性的氨基酸序列。[41]段40的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少97%序列同一性的氨基酸序列。[42]段四-41任一項(xiàng)的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸序列或其成熟多肽，或它們具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段，或所述多肽由SEQIDNO:2的氨基酸序列或其成熟多肽，或它們具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段組成。[43]段四-35任一項(xiàng)的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在中-高嚴(yán)格條件下與下列雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，()包含于SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，(iii)⑴或()的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。[44]段43的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在高嚴(yán)格條件下與下列雜交(i)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。[45]段44的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在非常高嚴(yán)格條件下與下列雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。[46]段四-35任一項(xiàng)的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少75%序列同一性的核苷酸序列。[47]段46的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少80%序列同一性的核苷酸序列。[48]段47的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少85%序列同一性的核苷酸序列。[49]段48的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少90%序列同一性的核苷酸序列。[50]段49的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少95%序列同一性的核苷酸序列。[51]段50的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少97%序列同一性的核苷酸序列。[52]段四-35任一項(xiàng)的方法，其中具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含SEQIDNO:1的核苷酸序列或其成熟多肽編碼序列，或它們編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段的亞序列，或者所述多核苷酸由SEQIDNO:1的核苷酸序列或其成熟多肽編碼序列，或它們編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段的亞序列組成。[53]段四-35任一項(xiàng)的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽是SEQIDNO2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的變體。[54]段四-53任一項(xiàng)的方法，其中所述SEQIDNO=I的成熟多肽編碼序列是SEQIDNO1的核苷酸64至859。[55]段四巧4任一項(xiàng)的方法，其中SEQIDNO2的成熟多肽是SEQIDNO2的氨基酸22至250。[56]一種發(fā)酵纖維素材料的方法，包括用一種或多種(幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵所述纖維素材料，其中所述纖維素材料是在具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的存在下用酶組合物糖化的，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽選自下組(a)多肽，其包含與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少75%序列同一性的氨基酸序列；(b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在中-高嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，()包含于SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(c)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少75%序列同一性的核苷酸序列；和(d)SEQIDNO:2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的變體。[57]段56的方法，其中所述纖維素材料的發(fā)酵產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物。[58]段57的方法，進(jìn)一步包括從發(fā)酵回收發(fā)酵產(chǎn)物。[59]段56-58任一項(xiàng)的方法，其中所述纖維素材料在糖化之前經(jīng)預(yù)處理。W0]段56-59任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物包含一種或多種(幾種)選自下組的纖維素分解酶內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。[61]段56-60任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物包含或進(jìn)一步包含一種或多種(幾種)選自下組的蛋白半纖維素酶、棒曲霉素、酯酶、木質(zhì)素分解酶、果膠酶、過(guò)氧化物酶、蛋白酶和膨脹素(swollenin)。W2]段61的方法，其中所述半纖維素酶是一種或多種(幾種)選自下組的酶乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。[63]段56-62任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)物是醇、有機(jī)酸、酮、氨基酸或氣體。[64]段56-63任一項(xiàng)的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽包含與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少75%序列同一性的氨基酸序列。[65]段64的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。[66]段64的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。[67]段66的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。[68]段67的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少95%序列同一性的氨基酸序列。[69]段68的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少97%序列同一性的氨基酸序列。[70]段56-69任一項(xiàng)的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸序列或其成熟多肽，或它們具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段，或所述多肽由SEQIDNO:2的氨基酸序列或其成熟多肽，或它們具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段組成。[71]段56-63任一項(xiàng)的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在中-高嚴(yán)格條件下與下列雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，()包含于SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，(iii)⑴或()的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。[72]段71的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在高嚴(yán)格條件下與下列雜交(i)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。[73]段72的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在非常高嚴(yán)格條件下與下列雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。[74]段56-63任一項(xiàng)的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少75%序列同一性的核苷酸序列。[75]段74的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少80%序列同一性的核苷酸序列。[76]段75的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少85%序列同一性的核苷酸序列。[77]段76的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少90%序列同一性的核苷酸序列。[78]段77的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少95%序列同一性的核苷酸序列。[79]段78的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少97%序列同一性的核苷酸序列。[80]段56-79任一項(xiàng)的方法，其中具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含SEQIDNO:1的核苷酸序列或其成熟多肽編碼序列，或它們編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段的亞序列，或者所述多核苷酸由SEQIDNO:1的核苷酸序列或其成熟多肽編碼序列，或它們編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段的亞序列組成。[81]段56-63任一項(xiàng)的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽是SEQIDNO2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的變體。[82]段56-81任一項(xiàng)的方法，其中所述SEQIDNO=I的成熟多肽編碼序列是SEQIDNO1的核苷酸64至859。[83]段56-82任一項(xiàng)的方法，其中SEQIDNO2的成熟多肽是SEQIDNO2的氨基酸22至250。[84]一種酶組合物，其包含具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽和一種或多種(幾種)纖維素分解酶，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽選自下組(a)多肽，其包含與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少75%序列同一性的氨基酸序列；(b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在中-高嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，()包含于SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)⑴或()的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(c)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少75%序列同一性的核苷酸序列；和(d)SEQIDNO:2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的變體。[85]段84的酶組合物，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少75%序列同一性的氨基酸序列。[86]段85的酶組合物，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。54[87]段86的酶組合物，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。[88]段87的酶組合物，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。[89]段88的酶組合物，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少95%序列同一性的氨基酸序列。[90]段89的酶組合物，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少97%序列同一性的氨基酸序列。[91]段84-90任一項(xiàng)的酶組合物，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸序列或其成熟多肽，或它們具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段，或所述多肽由SEQIDNO:2的氨基酸序列或其成熟多肽，或它們具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段組成。[92]段84的酶組合物，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在中-高嚴(yán)格條件下與下列雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。[93]段92的酶組合物，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在高嚴(yán)格條件下與下列雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，(iii)⑴或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。[94]段93的酶組合物，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在非常高嚴(yán)格條件下與下列雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。[95]段84的酶組合物，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少75%序列同一性的核苷酸序列。[96]段95的酶組合物，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少80%序列同一性的核苷酸序列。[97]段96的酶組合物，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少85%序列同一性的核苷酸序列。[98]段97的酶組合物，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少90%序列同一性的核苷酸序列。[99]段98的酶組合物，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少95%序列同一性的核苷酸序列。[100]段99的酶組合物，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少97%序列同一性的核苷酸序列。[101]段84-100任一項(xiàng)的酶組合物，其中具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含SEQIDNO:1的核苷酸序列或其成熟多肽編碼序列，或它們編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段的亞序列，或者所述多核苷酸由SEQIDNO:1的核苷酸序列或其成熟多肽編碼序列，或它們編碼具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段的亞序列組成。[102]段84的酶組合物，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽是SEQIDNO2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的變體。[103]段84-102任一項(xiàng)的酶組合物，其中所述SEQIDNO=I的成熟多肽編碼序列是SEQIDNO1的核苷酸77至766。[104]段84-103任一項(xiàng)的酶組合物，其中SEQIDNO2的成熟多肽是SEQIDNO2的氨基酸20至對(duì)9。[105]段84-104任一項(xiàng)的酶組合物，其中所述一種或多種(幾種)纖維素分解酶選自下組內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。[106]段84-105任一項(xiàng)的酶組合物，其中所述一種或多種(幾種)纖維素分解酶包含內(nèi)切葡聚糖酶。[107]段84-106任一項(xiàng)的酶組合物，其中所述一種或多種(幾種)纖維素分解酶包含纖維二糖水解酶。[108]段84-107任一項(xiàng)的酶組合物，其中所述一種或多種(幾種)纖維素分解酶包含β-葡糖苷酶。[109]段84-108任一項(xiàng)的酶組合物，其進(jìn)一步包含一種或多種(幾種)選自下組的蛋白半纖維素酶、棒曲霉素、酯酶、木質(zhì)素分解酶、果膠酶、過(guò)氧化物酶、蛋白酶和膨脹素(swollenin)0[110]段109的酶組合物，其中所述半纖維素酶是一種或多種(幾種)選自下組的酶乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。本文描述和要求保護(hù)的本發(fā)明并不局限于本文公開(kāi)的具體方面的范圍內(nèi)，因?yàn)檫@些方面旨在作為本發(fā)明幾個(gè)方面的說(shuō)明。旨在將任何等同的方面包含于本發(fā)明的范圍內(nèi)。實(shí)際上，從前面的說(shuō)明中，除本文所顯示和描述的之外，本發(fā)明的多種修改對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。這些修改也旨在落入所附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。在沖突的情況下，將以包括定義部分的本公開(kāi)為準(zhǔn)。權(quán)利要求1.一種降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法，包括在具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的存在下用酶組合物處理纖維素材料，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽選自下組(a)多肽，其包含與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少75%序列同一性的氨基酸序列；(b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在中-高嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)⑴或()的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(c)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少75%序列同一性的核苷酸序列；和(d)SEQIDNO:2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的變體。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述酶組合物包含一種或多種(幾種)選自下組的纖維素分解酶內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述酶組合物包含或進(jìn)一步包含一種或多種(幾種)選自下組的蛋白半纖維素酶、棒曲霉素、酯酶、木質(zhì)素分解酶、果膠酶、過(guò)氧化物酶、蛋白酶和膨脹素(swollenin)。4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括回收所述經(jīng)降解的纖維素材料。5.權(quán)利要求4的方法，其中所述經(jīng)降解的纖維素材料是糖。6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽包含SEQIDNO2的氨基酸序列或其成熟多肽，或它們具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段，或所述多肽由SEQIDNO:2的氨基酸序列或其成熟多肽，或它們具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段組成。7.—種產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括(A)在具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的存在下用酶組合物糖化纖維素材料，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽選自下組(a)多肽，其包含與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少75%序列同一性的氨基酸序列；(b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在中-高嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)⑴或()的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(c)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少75%序列同一性的核苷酸序列；和(d)SEQIDNO:2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的變體；(B)用一種或多種(幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵糖化的纖維素材料；(C)從所述發(fā)酵回收發(fā)酵產(chǎn)物。8.權(quán)利要求7的方法，其中所述酶組合物包含一種或多種(幾種)選自下組的纖維素分解酶內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。9.權(quán)利要求7或8的方法，其中所述酶組合物包含或進(jìn)一步包含一種或多種(幾種)選自下組的蛋白半纖維素酶、棒曲霉素、酯酶、木質(zhì)素分解酶、果膠酶、過(guò)氧化物酶、蛋白酶和膨脹素(swollenin)。10.權(quán)利要求7-9任一項(xiàng)的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸序列或其成熟多肽，或它們具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段，或所述多肽由SEQIDNO:2的氨基酸序列或其成熟多肽，或它們具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段組成。11.一種發(fā)酵纖維素材料的方法，包括用一種或多種(幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵所述纖維素材料，其中在具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的存在下用酶組合物糖化所述纖維素材料，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽選自下組(a)多肽，其包含與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少75%序列同一性的氨基酸序列；(b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在中-高嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)⑴或()的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(c)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少75%序列同一性的核苷酸序列；和(d)SEQIDNO:2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的變體。12.權(quán)利要求11的方法，其中所述纖維素材料的發(fā)酵產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物。13.權(quán)利要求12的方法，進(jìn)一步包括從所述發(fā)酵回收發(fā)酵產(chǎn)物。14.權(quán)利要求11-13任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物包含一種或多種(幾種)選自下組的纖維素分解酶內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。15.權(quán)利要求11-14任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合物包含或進(jìn)一步包含一種或多種(幾種)選自下組的蛋白半纖維素酶、棒曲霉素、酯酶、木質(zhì)素分解酶、果膠酶、過(guò)氧化物酶、蛋白酶和膨脹素(swollenin)。16.權(quán)利要求11-15任一項(xiàng)的方法，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸序列或其成熟多肽，或它們具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段，或所述多肽由SEQIDNO:2的氨基酸序列或其成熟多肽，或它們具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段組成。17.—種酶組合物，其包含具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽和一種或多種(幾種)纖維素分解酶，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽選自下組(a)多肽，其包含與SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少75%序列同一性的氨基酸序列；(b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在中-高嚴(yán)格條件下與以下雜交(i)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含于SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中的cDNA序列，或(iii)⑴或()的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(c)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少75%序列同一性的核苷酸序列；和(d)SEQIDNO:2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的變體。18.權(quán)利要求17的酶組合物，其中所述具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽包含SEQIDNO2的氨基酸序列或其成熟多肽，或它們具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段，或所述多肽由SEQIDNO:2的氨基酸序列或其成熟多肽，或它們具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段組成。19.權(quán)利要求17或18的酶組合物，其中所述一種或多種(幾種)纖維素分解酶選自下組內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。20.權(quán)利要求17-19任一項(xiàng)的酶組合物，其包含或進(jìn)一步包含一種或多種(幾種)選自下組的蛋白半纖維素酶、棒曲霉素、酯酶、木質(zhì)素分解酶、果膠酶、過(guò)氧化物酶、蛋白酶和膨脹素(swollenin)。全文摘要本發(fā)明涉及降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法，包括在具有纖維素分解增強(qiáng)活性的多肽的存在下用酶組合物處理纖維素材料。文檔編號(hào)C12N9/42GK102459582SQ201080033326公開(kāi)日2012年5月16日申請(qǐng)日期2010年5月27日優(yōu)先權(quán)日2009年5月29日發(fā)明者A.加納,J.奎因蘭,P.哈里斯,R.克拉默申請(qǐng)人:諾維信股份有限公司

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技術(shù)研發(fā)人員：A.加納;P.哈里斯;J.奎因蘭;R.克拉默
技術(shù)所有人：諾維信股份有限公司
我是此專利的發(fā)明人

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