專(zhuān)利名稱：果糖基肽基氧化酶和用于測(cè)定糖化蛋白質(zhì)的傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的果糖基肽基氧化酶(FPOX)。更具體地，本發(fā)明涉及在用于測(cè)量糖化蛋白質(zhì)(glycated proteins)，例如糖化白蛋白、果糖胺、HbAlc、果糖基六肽、果糖基纈氨酸和果糖基纈氨酰組氨酸的試劑盒和傳感器中使用的果糖基肽基氧化酶。
背景技術(shù)：
糖化的蛋白質(zhì)通過(guò)蛋白質(zhì)上的氨基和糖的還原端之間的共價(jià)鍵非酶促地產(chǎn)生，并又被稱作Amadori化合物。在血液中，葡萄糖在血紅蛋白β鏈的N端結(jié)合纈氨酸，從而產(chǎn)生糖化的血紅蛋白(糖化血紅蛋白(glycohemoglobin^HbAlc)。與正常的健康個(gè)體相比，在患有糖尿病的患者中HbAlc與血紅蛋白(Hb)的豐度比值較高，且已知血液中的HbAlc濃度反映了在過(guò)去幾周內(nèi)的血糖水平。因此血液中的HbAlc濃度在診斷糖尿病的臨床檢測(cè)和在患有糖尿病的患者的血糖控制中非常重要。可使用對(duì)果糖基纈氨酸具有特異性的酶測(cè)量血液中的HbAlc濃度。果糖基氨基酸氧化酶是FAD依賴性酶，其催化下述反應(yīng)，其中果糖基氨基酸被氧化，從而生成2-酮基-D-葡萄糖和相應(yīng)的氨基酸。已經(jīng)從多種生物中分離出果糖基氨基酸氧化酶，且已表明可使用這樣的酶分析糖化蛋白質(zhì)，例如糖化白蛋白、HbAlc和果糖胺。為了以高特異性測(cè)定HbAlc，果糖基氨基酸氧化酶優(yōu)選地具有對(duì)果糖基纈氨酸的選擇性(相比果糖基賴氨酸)。更優(yōu)選地，果糖基氨基酸氧化酶可具有對(duì)果糖基纈氨酰組氨酸的氧化酶活性，果糖基纈氨酰組氨酸對(duì)應(yīng)于Hb的N端的2個(gè)氨基酸。Hirokawa等人 (Biochem Biophys Res Commun, 311(1)，2003，104-111)公開(kāi)了來(lái)源于 Achaetomiella 和Chaetomius屬的絲狀細(xì)菌的果糖基肽基氧化酶。本發(fā)明的目的是提供用于測(cè)量糖化蛋白質(zhì)的新的果糖基肽基氧化酶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是基于具有圖1所示的氨基酸序列(SEQ ID NO: 1)的來(lái)源于小麥穎枯病菌 (.Phaeosphaeria floi/ory )的果糖基肽基氧化酶的發(fā)現(xiàn)。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含與SEQ ID NO: 1中所述的氨基酸序列具有至少70%同一性的氨基酸序列并對(duì)果糖基纈氨酰組氨酸具有ImM或更低的Km值的果糖基肽基氧化酶用于測(cè)定樣品中的糖化蛋白質(zhì)的用途。 本發(fā)明還提供了包含與SEQ ID NO: 1中所述的氨基酸序列具有至少70%同一性的氨基酸序列并對(duì)果糖基纈氨酰組氨酸具有10U/mg · mM或更高的Vmax/Km值的果糖基肽基氧化酶用于測(cè)定樣品中的糖化蛋白質(zhì)的用途。本發(fā)明還提供了包含與SEQ ID N0:1中所述的氨基酸序列具有至少70%同一性的氨基酸序列并且當(dāng)在50°C熱處理10分鐘時(shí)具有50%或更高的殘留活性的果糖基肽基氧化酶用于測(cè)定樣品中的糖化蛋白質(zhì)的用途。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了測(cè)定樣品中的糖化蛋白質(zhì)的方法，其包括使樣品接觸如上定義的果糖基肽基氧化酶，并測(cè)量被果糖基肽基氧化酶氧化的糖化蛋白質(zhì)的量。在還另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了測(cè)定HbAlc的方法，其包括消化樣品中的HbAlc以產(chǎn)生果糖基纈氨酸或果糖基纈氨酰組氨酸，使果糖基纈氨酸或果糖基纈氨酰組氨酸接觸如上定義的果糖基肽基氧化酶，并測(cè)量被氧化的果糖基纈氨酸或果糖基纈氨酰組氨酸的量。在還另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了測(cè)定樣品中果糖基纈氨酸、果糖基纈氨酰組氨酸、 果糖基六肽或HbAlc的裝置，其包含如上定義的果糖基肽基氧化酶和電子轉(zhuǎn)移介質(zhì)。優(yōu)選地，電子轉(zhuǎn)移介質(zhì)是N，N-雙羥乙基-4-亞硝基苯胺。也優(yōu)選地，所述裝置還包含一種或多種選自皂苷、膽紅素氧化酶和蛋白酶N的試劑。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了測(cè)定樣品中果糖基纈氨酸、果糖基纈氨酰組氨酸、果糖基六肽或HbAlC的試劑盒，其包含如上定義的果糖基肽基氧化酶和電子轉(zhuǎn)移介質(zhì)。在還另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了酶電極，其具有固定在電極上的如上定義的果糖基肽基氧化酶。優(yōu)選地，使用可光交聯(lián)的聚乙烯醇樹(shù)脂將果糖基肽基氧化酶固定在電極上。在還另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了測(cè)定果糖基纈氨酸、果糖基纈氨酰組氨酸、果糖基六肽或HbAlc的酶?jìng)鞲衅鳎浒景l(fā)明的酶電極作為工作電極。


圖1顯示了來(lái)自小麥穎枯病菌的果糖基肽基氧化酶的氨基酸序列。圖2顯示了果糖基肽基氧化酶的純化步驟。圖3顯示了純化的果糖基肽基氧化酶的SV曲線。圖4顯示了果糖基肽基氧化酶的熱穩(wěn)定性。圖5顯示了在m-PMS/DCIP系統(tǒng)中使用果糖基肽基氧化酶測(cè)量果糖基纈氨酸。圖6顯示了使用果糖基肽基氧化酶測(cè)量果糖基六肽。圖7顯示了使用果糖基肽基氧化酶測(cè)量HbAlc。圖8顯示了在H2A系統(tǒng)中使用具有果糖基肽基氧化酶的電極測(cè)量果糖基纈氨酸。圖9顯示了在普魯士藍(lán)系統(tǒng)中使用具有果糖基肽基氧化酶的電極測(cè)量果糖基纈氨酸。圖10顯示了在亞硝基苯胺(NA)系統(tǒng)中使用具有果糖基肽基氧化酶的電極測(cè)量果糖基纈氨酸。圖11顯示了在m-PMS系統(tǒng)中使用具有果糖基肽基氧化酶的電極測(cè)量果糖基纈氨酸。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的果糖基肽基氧化酶(PnFPOX)來(lái)源于小麥穎枯病菌，并具有圖1中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO: I).在本發(fā)明中也可使用具有與SEQ ID NO: 1中所述的氨基酸序列至少80%序列同一性的修飾的氨基酸序列的果糖基肽基氧化酶變體。優(yōu)選地，序列同一性為至少85%，更優(yōu)選地至少90%，和最優(yōu)選地至少95%。小麥穎枯病菌的基因組序列已被公開(kāi)，但此基因還沒(méi)有被注釋。沒(méi)有跡象或暗示顯示小麥穎枯病菌具有果糖基肽基氧化酶或此基因可能編碼任意種類(lèi)的酶。PnFPOX 的氨基酸序列顯示了與 FP0X-E (土正青霉(Eupenicillum terrenum)ATCC 18547; GenBank: BAD00185. 1)的 71% 的同一性和與FP0X-C (錐毛殼屬物種(Coniochaeta sp. )NISL 9330; GenBank: BAD00186. 1)的74%的同一性。與其他已知果糖基氨基酸氧化酶的序列同源性為約30%。如在下面的實(shí)施例中所描述地，PnFPOX顯示了對(duì)果糖基纈氨酸的更高的活性(相比對(duì)果糖基賴氨酸)。其也顯示了對(duì)果糖基纈氨酰組氨酸的甚至更高的活性。PnFPOX對(duì)果糖基纈氨酰組氨酸的Km值是ImM或更低，優(yōu)選地0. 5mM或更低，和更優(yōu)選地0. 3mM或更低， 這比FPOX-E和FPOX-C的低約10倍。PnFPOX對(duì)果糖基纈氨酰組氨酸的Vmax/Km值是IOU/ mg · mM或更高。此特征在使用此酶以更高的靈敏度和特異性測(cè)定HbAlc中特別有利。本發(fā)明的果糖基肽基氧化酶的另一個(gè)有利特征是其熱穩(wěn)定性。當(dāng)在10 mM PPB (pH 7.0)中在50°C熱處理PnFPOXlO分鐘時(shí)，觀察到約75%的殘留活性?？墒褂帽绢I(lǐng)域熟知的技術(shù)通過(guò)重組表達(dá)制備本發(fā)明的果糖基肽基氧化酶。PnFPOX 的核酸序列可見(jiàn)GenBank: ΧΡ_001798711. 1?？蛇m當(dāng)?shù)匦揎椈蛟O(shè)計(jì)序列，從而在選定的宿主生物中獲得更好的表達(dá)水平。編碼PnFPOX的多核苷酸可從小麥穎枯病菌中克隆，或使用一系列化學(xué)合成的寡核苷酸通過(guò)PCR制備，或使用自動(dòng)化DNA合成儀完全合成。將編碼PnFPOX的基因插入合適的表達(dá)載體，并將載體引入合適的宿主細(xì)胞，例如大腸桿菌。培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，并從細(xì)胞或培養(yǎng)基中收集在轉(zhuǎn)化體中表達(dá)的果糖基肽基氧化酶。這樣得到的重組果糖基肽基氧化酶可通過(guò)本領(lǐng)域已知的任意純化技術(shù)純化，所述技術(shù)包括離子交換柱層析、親和層析、液體層析、過(guò)濾、超濾、鹽沉淀、溶劑沉淀、免疫沉淀、 凝膠電泳、等電電泳和透析。本發(fā)明的果糖基肽基氧化酶在測(cè)定樣品中的糖化蛋白質(zhì)中有用。測(cè)定方法包括使樣品接觸本發(fā)明的果糖基肽基氧化酶，并測(cè)量被果糖基肽基氧化酶氧化的糖化蛋白質(zhì)的量。通過(guò)本發(fā)明測(cè)定的糖化蛋白質(zhì)包括，例如，果糖基纈氨酸、果糖基纈氨酰組氨酸、果糖基六肽、HbAlc、糖化白蛋白和果糖胺。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了測(cè)定HbAlc的方法，其包括消化樣品中的HbAlc以產(chǎn)生果糖基纈氨酸，使果糖基纈氨酸接觸本發(fā)明的果糖基肽基氧化酶，并測(cè)量被氧化的果糖基纈氨酸的量?？捎玫鞍酌?proteinase)(例如蛋白酶(protease) 和蛋白酶N)消化HbAlc。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法包括用蛋白酶N消化樣品中的 HbAlc以產(chǎn)生果糖基纈氨酰組氨酸，使果糖基纈氨酰組氨酸接觸本發(fā)明的果糖基肽基氧化酶，并測(cè)量被氧化的果糖基纈氨酰組氨酸的量。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了通過(guò)內(nèi)切蛋白酶(endoprotease) Glu-C消化HbAlc以產(chǎn)生果糖基六肽，并通過(guò)本發(fā)明的果糖基肽基氧化酶測(cè)定果糖基六肽來(lái)測(cè)定HbAlc的方法?，F(xiàn)在令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，來(lái)自小麥穎枯病菌的果糖基氨基酸氧化酶能夠氧化果糖基六肽，而現(xiàn)有技術(shù)的FPOX-C (錐毛殼屬物種MSL 9330 ； GenBank: BADOO186. 1)不能。可通過(guò)本領(lǐng)域已知的任意方法，例如使用H2A檢測(cè)試劑如4AA/T0DB/P0D (4_氨基安替比林/N，N -雙磺丁基)-3-甲基苯胺二鈉鹽/辣根過(guò)氧化物酶)或通過(guò)鉬電極測(cè)量產(chǎn)生的H2A的量來(lái)實(shí)現(xiàn)被果糖基肽基氧化酶氧化的糖化蛋白質(zhì)的量的測(cè)量?？蛇x地，可在電子介質(zhì)的存在下進(jìn)行測(cè)定，并使用例如mPMS/DCIP (1-甲氧基-5-甲基吩嗪 甲基硫酸化物/2，6-二氯靛酚)，cPES (三氟乙酸-1-(3-羧基-丙氧基)-5-乙基-吩嗪 H，NA BM31_1144 (N，N-雙(羥乙基)-3-甲氧基-亞硝基苯胺鹽酸化物，NA BM31_1008 (N, N- 二羥乙基-4-亞硝基苯胺)和N-N-4- 二甲基-亞硝基苯胺測(cè)量轉(zhuǎn)移至介質(zhì)的電子的量。其中，特別優(yōu)選NA_BM31_1008。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了測(cè)定樣品中果糖基纈氨酸、果糖基纈氨酰組氨酸、果糖基六肽或HbAlc的裝置，其包含本發(fā)明的果糖基肽基氧化酶。測(cè)定裝置可具有與常規(guī)的、市售的用于監(jiān)控血糖水平的測(cè)量電流的生物傳感器檢測(cè)條類(lèi)似的結(jié)構(gòu)。這樣的裝置的實(shí)例具有放置在絕緣基質(zhì)上的2個(gè)電極(工作電極和參考電極或?qū)﹄姌O)、試劑端口和樣品接收器。試劑端口包含本發(fā)明的果糖基肽基氧化酶、FAD 和電子轉(zhuǎn)移介質(zhì)。當(dāng)向樣品接收器中加入例如血樣的樣品時(shí)，樣品中包含的果糖胺將與果糖基肽基氧化酶反應(yīng)從而產(chǎn)生電流，其指示樣品中果糖胺的量。當(dāng)使用全血作為樣品時(shí)， 裝置還可包含用于溶血的試劑。特別優(yōu)選的溶血試劑是皂苷。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，裝置還可包含膽紅素氧化酶(BOD)以減少由全血樣品中包含的還原性成分導(dǎo)致的傳感器的背景電流。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，裝置還可包含蛋白酶N以實(shí)現(xiàn)果糖基纈氨酸或果糖基纈氨酰組氨酸從血液中存在的糖化白蛋白中的釋放。皂苷、BOD和蛋白酶N可被單獨(dú)地固定在裝置上，使得全血樣品與皂苷接觸以實(shí)現(xiàn)溶血，然后與BOD和蛋白酶N接觸。適于測(cè)定酶底物的電化學(xué)傳感器的一般實(shí)例是已知的，例如來(lái)自WO 2004/113900和US 5，997，817。作為電化學(xué)傳感器的替代選擇，可使用光學(xué)檢測(cè)技術(shù)。一般地，這樣的光學(xué)裝置是基于包含酶、電子轉(zhuǎn)移介質(zhì)和指示劑的試劑系統(tǒng)中發(fā)生的顏色變化?？墒褂脽晒?、吸收或減輕(remission)的測(cè)量定量顏色變化。適于測(cè)定酶底物的光學(xué)裝置的一般實(shí)例是已知的，例如來(lái)自 US 7,008,799，US 6, 036, 919,和 US 5，334，508。在還另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于測(cè)定樣品中果糖基纈氨酸、果糖基纈氨酰組氨酸、果糖基六肽或HbAlc的試劑盒，其包含本發(fā)明的果糖基肽基氧化酶?？墒褂帽景l(fā)明的果糖基肽基氧化酶構(gòu)建用于測(cè)量果糖基纈氨酸、果糖基纈氨酰組氨酸或果糖基六肽的試劑盒。除了本發(fā)明的果糖基肽基氧化酶以外，試劑盒可包含測(cè)量所必需的緩沖液，合適的介質(zhì)，用于制作校準(zhǔn)曲線的果糖基纈氨酸、果糖基纈氨酰組氨酸或果糖基六肽或其衍生物的標(biāo)準(zhǔn)品，和使用說(shuō)明書(shū)。試劑盒也可包含內(nèi)切蛋白酶Glu-C，用于消化HbAlc以產(chǎn)生果糖基六肽?？梢远喾N形式提供本發(fā)明的果糖基肽基氧化酶，例如作為凍干試劑或作為在合適的儲(chǔ)存溶液中的溶液。也有可能使用本發(fā)明的果糖基肽基氧化酶構(gòu)建果糖胺、糖化白蛋白或HbAlc測(cè)定試劑盒。酶促或化學(xué)消化果糖胺、糖化白蛋白或HbAlc，從而產(chǎn)生果糖胺化合物例如糖基纈氨酸或果糖基纈氨酰組氨酸，其然后通過(guò)使用本發(fā)明的果糖基肽基氧化酶被定量。因此， 用于果糖胺、糖化白蛋白或HbAlc的本發(fā)明的測(cè)定試劑盒可還包含用于水解的試劑或蛋白酶。優(yōu)選的蛋白酶是蛋白酶N，其將消化HbAlc以產(chǎn)生果糖基纈氨酰組氨酸。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了具有固定在電極上的本發(fā)明的果糖基肽基氧化酶的酶電極。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用聚合物將本發(fā)明的果糖基氨基酸氧化酶固定在電極上，以避免BOD和蛋白酶N與果糖基氨基酸氧化酶和介質(zhì)接觸。否則，BOD將干擾介質(zhì)的氧化還原性能，且蛋白酶N將降解果糖基氨基酸氧化酶。優(yōu)選的聚合物是可光交聯(lián)的聚乙烯醇樹(shù)脂，例如由Toyo Gosei有限公司(Chibii，Japan)提供的具有疊氮化物單元側(cè)基的 (azide-unit pendant)水溶性光聚合物(AWP)。為了構(gòu)建酶電極，向電極表面應(yīng)用包含AWP、 果糖基氨基酸氧化酶和介質(zhì)如NA_BM31_1008的緩沖溶液。在干燥溶液后，輻射紫外光以實(shí)現(xiàn)聚合物的交聯(lián)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于測(cè)定果糖基纈氨酸、果糖基纈氨酰組氨酸、果糖基六肽或HbAlc的酶?jìng)鞲衅?，其包含本發(fā)明的酶電極作為工作電極。
可通過(guò)測(cè)量通過(guò)酶反應(yīng)產(chǎn)生的電子的量測(cè)定樣品中果糖胺的濃度。本發(fā)明的果糖基肽基氧化酶被固定在電極，例如碳電極、金屬電極和鉬電極上?？赏ㄟ^(guò)交聯(lián)、封裝進(jìn)大分子基質(zhì)、用透析膜覆蓋、光交聯(lián)聚合物、導(dǎo)電聚合物、氧化還原聚合物或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它方法和任意其組合固定酶。當(dāng)在測(cè)量電流的系統(tǒng)中進(jìn)行測(cè)量時(shí)，使用具有固定的PnFPOX的碳電極、金電極或鉬電極作為工作電極，同時(shí)使用對(duì)電極(例如鉬電極)和參考電極(例如Ag/AgCl電極)。將電極插入包含介質(zhì)的緩沖液并維持在預(yù)定的溫度下。對(duì)工作電極應(yīng)用預(yù)定的電壓，然后加入樣品并測(cè)量電流的增加值。在測(cè)定中使用的介質(zhì)的實(shí)例包括鐵氰化鉀、二茂鐵、鋨衍生物、釕衍生物、吩嗪甲基硫酸化物等等。一般也可能使用所謂的雙電極系統(tǒng)，其具有一個(gè)工作電極和一個(gè)對(duì)電極或假參考電極。為了制造用于測(cè)量果糖胺、糖化白蛋白或HbAlc的傳感器，將上述用于測(cè)量果糖基纈氨酸或果糖基纈氨酰組氨酸的傳感器進(jìn)一步與包含固定的蛋白酶(如蛋白酶N或蛋白酶，優(yōu)選蛋白酶N)的膜組合，以構(gòu)建復(fù)合傳感器。這樣的通過(guò)組合多種酶基于連續(xù)反應(yīng)的復(fù)合傳感器的結(jié)構(gòu)是本領(lǐng)域熟知的。見(jiàn)，例如Anthony P. F. Tuner, Isao Karube和George S. Wilson 的“Biosensor - Fundamental 禾口 Applications，，，Oxford University Press, 1987。在本說(shuō)明書(shū)中引用的所有專(zhuān)利和參考文件內(nèi)容以其整體引入本文作為參考。 實(shí)施例通過(guò)下面的實(shí)施例將詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，盡管本發(fā)明不應(yīng)受限于這些實(shí)施例。實(shí)施例1
小麥穎枯病菌果糖基肽基氧化酶的制備
在公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)中的小麥穎枯病菌的基因組信息中發(fā)現(xiàn)PnFPOX的核苷酸序列 (GenBank: XP_001798711. 1)。由于推定的ORF包含大腸桿菌中的一些稀有密碼子，因此優(yōu)化了基因的密碼子使用以在大腸桿菌中表達(dá)基因。在此優(yōu)化后，在序列中不存在顯著的稀有密碼子。將合成的基因亞克隆進(jìn)表達(dá)載體pET28a以構(gòu)建pEPN (pET28a-PnFP0X)。在50 ml補(bǔ)充50 μ g/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中在37°C培養(yǎng)用PnFAOD表達(dá)載體(pEPN)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21 (DE3)細(xì)胞，并在0D660nm = 0.8時(shí)加入IPTG (終濃度0. 4 mM)。在25°C繼續(xù)培養(yǎng)，直到0D660nm達(dá)到約3。通過(guò)離心(5，000xg, 4°C，10分鐘)收集細(xì)胞，洗滌(0.85% NaCl 溶液，6，000xg，4°C , 5 分鐘)，在:3ml 10 mM PPB (pH 7.0)中懸浮，并通過(guò)超聲波均質(zhì)器均質(zhì)。將得到的懸浮液離心(10，OOOxg，4°C , 20分鐘)，并進(jìn)一步離心上清(60，000 rpm, 4°C，60分鐘)。將上清針對(duì)添加25 μ M FAD的IOmM PPB (ρΗ7. 0)透析以得到水溶性級(jí)分。在SDS-PAGE分析中，水溶性級(jí)分顯示了約48_50kDa的條帶，這與PnFPOX的預(yù)測(cè)分子量一致。使用P0D/T0DB/4A. A.法用3種底物果糖基纈氨酸(FV)、果糖基賴氨酸(ΠΟ和果糖基纈氨酰組氨酸(FVH)檢查水溶性級(jí)分的氧化酶活性。果糖基肽基氧化酶不僅顯示了對(duì)果糖基氨基酸(FV、HO的氧化活性，而且顯示了對(duì)果糖基二肽(FVH)的氧化活性。實(shí)施例2
小麥穎枯病菌果糖基肽基氧化酶的純化和表征在圖2中總結(jié)了純化步驟。在含有50 yg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基(7L)中在37 V 有氧培養(yǎng)用pEPN (pET28a-PnFP0X)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21 (DE3)。在達(dá)到1. 4的A660nm 值后，用0. 3 mM IPTG誘導(dǎo)細(xì)胞，并在25 °C繼續(xù)培養(yǎng)，直到達(dá)到3. 0的A660nm值。通過(guò)離心收獲細(xì)胞，并將1/4的收獲細(xì)胞(約10. 5g)在10 mM PPB, pH 7.0中重懸，并通過(guò)2個(gè)通道穿過(guò)弗氏壓碎器(1，000 kg cm-2)裂解。以10，OOOg在4 °C離心裂解液20分鐘，并以 40, 000 rpm在4 ！離心上清90分鐘。然后將上清對(duì)含有25 μ M FAD的10 mM PPB, pH 8.0透析。向透析的上清中加入硫酸銨至35%飽和，然后通過(guò)以15，OOOg離心20分鐘沉淀形成的沉淀物。向上清中加入硫酸銨至95%飽和，以15，OOOg離心20分鐘。在含有25 μ M FAD和1%甘露糖的IOmM PPB, pH 8. 0中溶解得到的沉淀物，并在4 °C對(duì)相同的緩沖液透析,并且之后對(duì)含有25 μ M FAD的10 mM PPB, pH 8. 0透析。對(duì)用10 mM PPB, pH 8. 0平衡的RESOURCE Q柱(GE Healthcare)應(yīng)用透析的酶溶液。收集活性流通(flow-through) 級(jí)分，并用1 M NaCl洗脫顯示無(wú)FAOD活性的吸附的蛋白質(zhì)。收集活性流通級(jí)分，并對(duì)10 mM PPB, pH 7. 0 透析。對(duì)用10 mM PPB, pH 7. 0 平衡的 HiLoad 16/60 Superdex 75 pg 柱(GE Healthcare)應(yīng)用透析的酶溶液。用相同的緩沖液進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析。收集活性級(jí)分，并將純化的酶溶液對(duì)含有100 μ M FAD的10 mM PPB, pH 7.0透析，并儲(chǔ)存在4 °C。通過(guò) SDS-PAGE驗(yàn)證純化的酶的純度，并使用DC蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(Bio-Rad，CA, USA)測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。如在表1中總結(jié)的，通過(guò)硫酸銨沉淀、陰離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析，從大腸桿菌BL21(DE3)/pEPN(pET28a-PnFP0X)的細(xì)胞提取物中純化了 35倍的PnFPOX。純化的制品在SDS-PAGE上顯示了接近單個(gè)條帶。 表1重組PnFPOX的純化
權(quán)利要求
1.果糖基肽基氧化酶用于測(cè)定樣品中的糖化蛋白質(zhì)的用途，所述果糖基肽基氧化酶包含與SEQ ID NO: 1中所述的氨基酸序列具有至少70%同一性的氨基酸序列并對(duì)果糖基纈氨酰組氨酸具有ImM或更低的Km值。
2.果糖基肽基氧化酶用于測(cè)定樣品中的糖化蛋白質(zhì)的用途，所述果糖基肽基氧化酶包含與SEQ ID NO: 1中所述的氨基酸序列具有至少70%同一性的氨基酸序列并對(duì)果糖基纈氨酰組氨酸具有10U/mg · mM或更高的Vmax/Km值。
3.果糖基肽基氧化酶用于測(cè)定樣品中的糖化蛋白質(zhì)的用途，所述果糖基肽基氧化酶包含與SEQ ID NO: 1中所述的氨基酸序列具有至少70%同一性的氨基酸序列并且當(dāng)在50°C 熱處理10分鐘時(shí)具有50%或更高的殘留活性。
4.一種用于測(cè)定樣品中的糖化蛋白質(zhì)的方法，其包括使所述樣品接觸如在權(quán)利要求 1-3的任一項(xiàng)中定義的果糖基肽基氧化酶，并測(cè)量被所述果糖基肽基氧化酶氧化的糖化蛋白質(zhì)的量。
5.一種用于測(cè)定HbAlc的方法，其包括消化樣品中的HbAlc以產(chǎn)生果糖基纈氨酸或果糖基纈氨酰組氨酸，使所述果糖基纈氨酸或果糖基纈氨酰組氨酸接觸如在權(quán)利要求1-3的任一項(xiàng)中定義的果糖基肽基氧化酶，并測(cè)量被氧化的果糖基纈氨酸或果糖基纈氨酰組氨酸的量。
6.一種用于測(cè)定樣品中果糖基纈氨酸、果糖基纈氨酰組氨酸、果糖基六肽或HbAlc的裝置，其包含如在權(quán)利要求1-3的任一項(xiàng)中定義的果糖基肽基氧化酶和電子轉(zhuǎn)移介質(zhì)。
7.如權(quán)利要求6中要求保護(hù)的裝置，其中所述電子轉(zhuǎn)移介質(zhì)是N，N-雙羥乙基-4-亞硝基苯胺。
8.如權(quán)利要求6或7中要求保護(hù)的裝置，其還包含一種或多種選自皂苷、膽紅素氧化酶和蛋白酶N的試劑。
9.一種用于測(cè)定樣品中果糖基纈氨酸、果糖基纈氨酰組氨酸、果糖基六肽或HbAlc的試劑盒，其包含如在權(quán)利要求1-3的任一項(xiàng)中定義的果糖基肽基氧化酶和電子轉(zhuǎn)移介質(zhì)。
10.如權(quán)利要求9中要求保護(hù)的試劑盒，其中所述電子轉(zhuǎn)移介質(zhì)是N，N-雙羥乙基-4-亞硝基苯胺。
11.如權(quán)利要求10或11中要求保護(hù)的試劑盒，其還包含一種或多種選自皂苷、膽紅素氧化酶和蛋白酶N的試劑。
12.一種酶電極，其具有固定在電極上的如在權(quán)利要求1-3的任一項(xiàng)中定義的果糖基肽基氧化酶。
13.如權(quán)利要求12中要求保護(hù)的酶電極，其中使用具有疊氮化物單元側(cè)基的水溶性光聚合物(AWP)將果糖基肽基氧化酶固定在電極上。
14.如權(quán)利要求12或13中要求保護(hù)的酶電極，其還包含固定在電極上的N，N-雙羥乙基-4-亞硝基苯胺。
15.一種用于測(cè)定果糖基纈氨酸、果糖基纈氨酰組氨酸、果糖基六肽或HbAlc的酶?jìng)鞲衅?，其包含?quán)利要求12-14中任一項(xiàng)的酶電極作為工作電極。
全文摘要
公開(kāi)了來(lái)源于芽殖酵母小麥穎枯病菌(Phaeosphaerianodorum)的果糖基肽基氧化酶用于測(cè)定樣品中的糖化蛋白質(zhì)的用途。本發(fā)明的果糖基肽基氧化酶具有對(duì)果糖基纈氨酸以及果糖基纈氨酰組氨酸的較高的活性，并以較高的靈敏度和特異性用于測(cè)定HbA1c。還公開(kāi)了包含這種酶的電極傳感器。
文檔編號(hào)C12Q1/26GK102575278SQ201080033796
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2010年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月3日
發(fā)明者K.伊克布庫(kù)羅, K.索德 申請(qǐng)人:究極酵素國(guó)際股份有限公司, 霍夫曼-拉羅奇有限公司