專(zhuān)利名稱(chēng)：用于在植物根部調(diào)節(jié)基因表達(dá)的啟動(dòng)子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及植物分子生物學(xué)領(lǐng)域以及植物中基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。本發(fā)明披露了來(lái)自玉蜀黍(玉米)的核苷酸序列，這些核苷酸序列包括一個(gè)調(diào)節(jié)元件，例如啟動(dòng)子。更具體地，本發(fā)明涉及植物根部對(duì)根冠具有特異性的基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。發(fā)明背景
操縱作物植物以改變和/或改進(jìn)表型特性(例如產(chǎn)率或品質(zhì))要求在植物組織中表達(dá)異源基因。此類(lèi)遺傳操縱由于兩個(gè)發(fā)現(xiàn)而成為可能將異源遺傳材料轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞中的能力，以及存在能夠促進(jìn)該異源遺傳材料表達(dá)的啟動(dòng)子。有利的是擁有各種不同的啟動(dòng)子選擇，以便在轉(zhuǎn)基因植物中給出所希望的效果?？梢赃x擇適當(dāng)?shù)膯?dòng)子用于特定的基因、構(gòu)建體、細(xì)胞、組織、植物或環(huán)境。對(duì)植物轉(zhuǎn)基因表達(dá)有用的啟動(dòng)子包括以下類(lèi)型可誘導(dǎo)型、病毒型、合成型、組成型(Odell etal. ,1985, Nature 313:810-812;Granger & Cyr, 2001, Plant Cell Repo. 20:227-234),時(shí)間性調(diào)節(jié)型、空間性調(diào)節(jié)型、組織特異型以及時(shí)空調(diào)節(jié)型的啟動(dòng)子(KuhIemeier etal. 1987, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mo I. Biol. 38:221-257)。來(lái)自細(xì)菌、真菌、病毒以及植物的啟動(dòng)子已經(jīng)用于控制植物細(xì)胞中的基因表達(dá)。啟動(dòng)子由該啟動(dòng)子全部功能所必須的幾個(gè)區(qū)域構(gòu)成。這些區(qū)域中有一些是模塊式的，換言之它們可以用于分離以給予啟動(dòng)子活性或者它們可以與其他元件進(jìn)行組裝以構(gòu)建新的啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子區(qū)域中的第一個(gè)緊靠在編碼序列的上游，并且形成“核心啟動(dòng)子區(qū)域”，該區(qū)域包含幾個(gè)共有序列，通常是緊接在編碼序列上游的20-70個(gè)堿基對(duì)。核心啟動(dòng)子區(qū)域包括一個(gè)TATA盒,并且通常包括一個(gè)起始子元件和一個(gè)起始位點(diǎn)。核心啟動(dòng)子區(qū)域的精確長(zhǎng)度不是固定的，但通常很好識(shí)別。這種區(qū)域通常存在于大部分啟動(dòng)子中，并且有一些變異。存在于不同的表征良好的元件之間的堿基序列似乎不太重要。核心啟動(dòng)子區(qū)域通常是指一個(gè)最小啟動(dòng)子區(qū)域，因?yàn)樗旧砭哂泄δ芸梢詥?dòng)基線水平的轉(zhuǎn)錄。這種核心啟動(dòng)子區(qū)域的存在將一個(gè)序列定義為啟動(dòng)子。如果該區(qū)域不存在，則該啟動(dòng)子沒(méi)有功能。該核心區(qū)域發(fā)揮作用使該啟動(dòng)子使用通用轉(zhuǎn)錄機(jī)制進(jìn)行轉(zhuǎn)錄起始。然而，該核心啟動(dòng)子區(qū)域不足以提供全部的啟動(dòng)子活性。一系列調(diào)節(jié)序列(通常位于該核心的上游)構(gòu)成了該啟動(dòng)子的剩余部分。這些調(diào)節(jié)序列決定了表達(dá)水平、表達(dá)的空間與時(shí)間形式、以及一個(gè)子集啟動(dòng)子在誘導(dǎo)條件下(通過(guò)諸如光線、溫度、化學(xué)物質(zhì)以及激素等外部因素調(diào)節(jié))的表達(dá)。調(diào)節(jié)序列可以是6-100個(gè)堿基對(duì)的短DNA序列區(qū)域，這些區(qū)域限定了反式作用因子(例如轉(zhuǎn)錄因子)的結(jié)合位點(diǎn)。調(diào)節(jié)序列還可以是增強(qiáng)子，與該核心啟動(dòng)子區(qū)域具有一定距離時(shí)(有時(shí)距離該核心區(qū)域超過(guò)數(shù)千個(gè)堿基)能發(fā)揮作用的較長(zhǎng)的DNA序列區(qū)域。調(diào)節(jié)序列的活性可以受到反式作用因子的影響，這些因子包括通用轉(zhuǎn)錄機(jī)制、轉(zhuǎn)錄因子以及染色體組裝因子。通常，希望的是感興趣的基因在植物中具有組織特異性表達(dá)。組織特異型啟動(dòng)子專(zhuān)門(mén)啟動(dòng)一組組織的表達(dá)，而不是整個(gè)植株的表達(dá)；組織偏好型啟動(dòng)子促進(jìn)一個(gè)子集組織的較高水平的表達(dá)，而該表達(dá)在該植物的其他組織中是顯著較低的。例如，可能希望的是僅在玉米種子中而非該植物的其余部分表達(dá)一個(gè)增值產(chǎn)物。另一個(gè)例子是通過(guò)組織特異性消除來(lái)產(chǎn)生雄性不育。在這種情況下，表達(dá)只限于根部，更具體地是根冠。農(nóng)業(yè)生物技術(shù)中有很多方面使用并要求組織特異性表達(dá)。玉米根冠可以由多達(dá)10，000個(gè)細(xì)胞構(gòu)成。這些帽細(xì)胞起源于分生組織，它的作用僅是產(chǎn)生新的帽細(xì)胞。分生組織具有約12小時(shí)的細(xì)胞周期。細(xì)胞由分生組織產(chǎn)生之后，經(jīng)過(guò)根冠并最終溶解成為黏膠。玉蜀黍的根冠細(xì)胞從分生組織到成為黏膠這一過(guò)程花費(fèi)五到八天。依據(jù)根尖的結(jié)構(gòu)，分生組織已被分為開(kāi)放的或封閉的。玉蜀黍具有封閉的根系統(tǒng)，這意味著細(xì)胞列在根錐頂點(diǎn)會(huì)合，這使得可以清晰地分辨根部的不同部分。這是相對(duì)于開(kāi)放的根系統(tǒng)而言的，開(kāi)放的根系統(tǒng)在根本身與根冠之間沒(méi)有單獨(dú)的邊界，使得很難追蹤細(xì)胞列((Lim The Plant Cell 12:1307-1318 (2000) )0玉蜀黍的根系統(tǒng)與草的根系統(tǒng)相似，由發(fā)育過(guò)程中在不同階段與位置形成的不同類(lèi)型的根構(gòu)成。胚胎發(fā)生時(shí)，形成主根和側(cè)根。胚后發(fā)育時(shí)，冠根以及支持/支柱根由莖組織產(chǎn)生。 這提供了在植物根部表達(dá)所選擇的基因時(shí)需要啟動(dòng)子的一個(gè)重要例子。這種植物的根由許多細(xì)胞類(lèi)型構(gòu)成，例如表皮、根冠、囊軸、皮層、中柱鞘、維管以及形成生毛細(xì)胞的根毛，它們組織成根的組織或區(qū)域，例如根尖、根表皮、分生組織區(qū)、主根、側(cè)根、根毛以及維管組織。分離成根特異性或根偏好性的啟動(dòng)子可以偏向在這些細(xì)胞類(lèi)型的一個(gè)或一些類(lèi)型中啟動(dòng)表達(dá)。這種細(xì)胞特異性的活性可用于特定應(yīng)用，例如僅在分生組織細(xì)胞區(qū)調(diào)節(jié)分生組織的活性，或僅在線蟲(chóng)害蟲(chóng)接觸的細(xì)胞類(lèi)型中調(diào)節(jié)一個(gè)殺線蟲(chóng)基因的表達(dá)。在其他情況中，更廣泛的細(xì)胞類(lèi)型特異性是所希望的，以便在整個(gè)根組織表達(dá)感興趣的基因。這可用于表達(dá)一種殺蟲(chóng)基因來(lái)控制一種以植物根為食的害蟲(chóng)，例如玉米根蟲(chóng)(根螢葉甲屬)。根冠特異性可以通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)使用一種單一的具有廣泛細(xì)胞類(lèi)型特異性的根特異性啟動(dòng)子、或通過(guò)使用兩個(gè)或多個(gè)具有不同細(xì)胞類(lèi)型表達(dá)特異性的根特異性或根偏好性的啟動(dòng)子。有限數(shù)量的根偏好性啟動(dòng)子以及根特異性啟動(dòng)子的例子已經(jīng)進(jìn)行說(shuō)明。這些例子包括來(lái)自普通煙草的RB7啟動(dòng)子(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，459，252和5，750，386 )、來(lái)自擬南芥的ARSKl啟動(dòng)子(Hwang and Goodman (1995)Plant J 8:37-43)、來(lái)自玉蜀黍的MR7啟動(dòng)子(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，837，848)、玉蜀黍的ZRP2啟動(dòng)子(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，633，363)以及來(lái)自玉蜀黍的MTL啟動(dòng)子(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，466，785和6，018，099)。這些例子中有很多披露了表達(dá)模式限定于有限數(shù)量的根組織的啟動(dòng)子。其他啟動(dòng)子不能提供表達(dá)已選基因所需要的根特異性。因此，在本領(lǐng)域內(nèi)存在著用于分離并鑒定新的根啟動(dòng)子的需要，以便獲得具有不同廣度、表達(dá)水平和細(xì)胞類(lèi)型表達(dá)特異性的啟動(dòng)子用于根特異性與根偏好性表達(dá)，特別是根冠特異性表達(dá)。發(fā)明概述在本發(fā)明中，提供了用于在轉(zhuǎn)基因植物中指導(dǎo)根冠特異表達(dá)的組合物和方法。尤其是，提供了一種從玉蜀黍中分離的新穎的核酸分子，該分子促進(jìn)異源基因以根冠特異的方式在植物中表達(dá)。本發(fā)明還涉及多種表達(dá)盒和載體，它們包括本發(fā)明的新穎的核酸分子，該核酸分子可操作地連接至異源編碼序列。本發(fā)明還涉及包括本發(fā)明表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明還提供了以下方法，這些方法用于在轉(zhuǎn)基因植物的根部特異性地表達(dá)一種異源編碼序列，用于分離一種根特異性cDNA、用于分離一種可用于指導(dǎo)根特異性表達(dá)的核酸分子并且用于分離一種根特異性啟動(dòng)子。本發(fā)明還提供了多種引物和核苷酸探針以便從其他植物基因組中鑒定相關(guān)的核苷酸序列，這些序列指導(dǎo)根冠特異性轉(zhuǎn)錄或根冠偏好性轉(zhuǎn)錄。根據(jù)ー個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種分離的核酸分子，該分子編碼了ー種能夠在植物中指導(dǎo)根冠特異性轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，其中該啟動(dòng)子的核苷酸序列包括在SEQ ID NO: I中給出的核苷酸序列。根據(jù)ー個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種分離的核酸分子，該分子編碼了ー種能夠在植物中指導(dǎo)根冠特異性轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，其中該啟動(dòng)子的核苷酸序列包括在SEQ ID N0:2中給出的核苷酸序列。SEQ ID N0:2是SEQ ID NO: I的截短形式。本發(fā)明還提供了 ー個(gè)表達(dá)盒，該表達(dá)盒包括本發(fā)明的可操作地連接至ー個(gè)異源編碼序列的核酸分子。一方面，該表達(dá)盒包括ー個(gè)異源編碼序列，該序列選自下組，其構(gòu)成為殺蟲(chóng)編碼序列、殺線蟲(chóng)編碼序列、除草劑耐受編碼序列、抗微生物編碼序列、抗真菌編碼序列、抗病毒編碼序列、非生物脅迫耐受編碼序列、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)編碼序列、可見(jiàn)標(biāo)記編碼序列以及選擇標(biāo)記編碼序列。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，該表達(dá)盒包括ー個(gè)殺蟲(chóng)編碼序列，該序列編碼了有效抵抗一種鞘翅目害蟲(chóng)的毒素。在這個(gè)實(shí)施方案的ー個(gè)方面，該鞘翅目害蟲(chóng)是根螢葉 甲屬的ー個(gè)物種。在又另ー個(gè)實(shí)施方案中，該表達(dá)盒包括ー個(gè)非生物脅迫耐受性編碼序列，該脅迫包括但不限于干旱脅迫、營(yíng)養(yǎng)脅迫、鹽脅迫、水脅迫以及重金屬脅迫。在又另ー個(gè)實(shí)施方案中，該表達(dá)盒包括ー種可見(jiàn)標(biāo)記編碼序列，該可見(jiàn)標(biāo)記包括但不限于綠色熒光蛋白(GFP)、葡萄糖醛酸酶(⑶S)以及螢光素莓(LUC)。在又另ー個(gè)實(shí)施方案中，該表達(dá)盒包括一個(gè)選擇標(biāo)記編碼序列，該選擇標(biāo)記包括但不限于磷酸甘露糖異構(gòu)酶(PMI)，ー種抗生素抗性基因例如潮霉素、卡那霉素以及類(lèi)似物，ー種除草劑耐受性基因例如草丁膦(PAT)、芽孢桿菌RNA酶(BAR)、EPSPS, GAT以及類(lèi)似物。本發(fā)明還提供了ー種包括本發(fā)明的表達(dá)盒的重組載體。在這個(gè)實(shí)施方案的ー個(gè)方面，該重組載體是ー個(gè)質(zhì)粒。此外，本發(fā)明提供了ー種轉(zhuǎn)基因的非人類(lèi)宿主細(xì)胞，該細(xì)胞包括本發(fā)明的表達(dá)盒。根據(jù)本發(fā)明的這一方面的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞優(yōu)選地是ー種植物細(xì)胞。此外，本發(fā)明提供了一種包括這種轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物。根據(jù)本發(fā)明的這一方面的轉(zhuǎn)基因植物可以是高梁、小麥、向日葵、番茄、馬鈴薯、甘藍(lán)類(lèi)蔬菜、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、煙草、大麥、油菜以及玉米，優(yōu)選玉米。此外，本發(fā)明提供了選自下組的轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因種子，該組的構(gòu)成為高粱、小麥、向日葵、番茄、甘藍(lán)類(lèi)蔬菜、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、煙草、大麥、油菜以及玉米。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，該轉(zhuǎn)基因種子來(lái)自ー種轉(zhuǎn)基因玉米植物。另ー方面，本發(fā)明提供了在本發(fā)明的ー種核酸分子的轉(zhuǎn)錄控制下在轉(zhuǎn)基因植物根部特異性地表達(dá)ー個(gè)異源編碼序列的方法，包括(a)使用ー種載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中該載體包括本發(fā)明的可操作地連接至ー個(gè)異源編碼序列的核酸分子，(b)使包含該載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞生長(zhǎng)，并且(C)從這些已轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，其中該異源編碼序列在本發(fā)明的ー種核酸分子的控制下特異地表達(dá)于植物根部。在這一方面的一個(gè)實(shí)施方案中，該轉(zhuǎn)基因植物是ー種玉米植物或水稻植物。在這一方面的另ー個(gè)實(shí)施方案中，該異源編碼序列是選自下組，其構(gòu)成為殺蟲(chóng)編碼序列、殺線蟲(chóng)編碼序列、除草劑耐受編碼序列、抗微生物編碼序列、抗真菌編碼序列、抗病毒編碼序列、非生物脅迫耐受編碼序列、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)編碼序列、可見(jiàn)標(biāo)記編碼序列以及選擇標(biāo)記編碼序列。在又另ー個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了根據(jù)這一方面所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，這些轉(zhuǎn)基因植物是玉米植物或水稻植物。由本發(fā)明提供的還有以下核苷酸引物，這些引物包含SEQ ID N0S: 1-2中任何ー個(gè)的至少16個(gè)連續(xù)核苷酸。這些引物用于檢測(cè)這些啟動(dòng)子的存在。此類(lèi)引物的實(shí)例在SEQID NO:7 - 10中給出。序列表中的序列的簡(jiǎn)要說(shuō)明SEQ ID NO: I是ZmRCPl-I啟動(dòng)子的核苷酸序列。SEQ ID N0:2是ZmRCPl-2啟動(dòng)子的核苷酸序列。SEQ ID NO:3 是 ZmRCPl-ICDS 的核苷酸序列。SEQ ID NO:4 是 ZmRCPl-ImRNA 的核苷酸序列。 SEQ ID NO:5是pN0V6901載體的核苷酸序列。SEQ ID N0:6是pSYN15605載體的核苷酸序列。SEQ ID NO:7是pSYN15861載體的核苷酸序列。SEQ ID N0:8是pSYN15888載體的核苷酸序列。SEQ ID N0:9是ZmRCPl-I啟動(dòng)子正向引物的核苷酸序列。SEQ ID NO: 10是ZmRCPl-I啟動(dòng)子反向引物的核苷酸序列。SEQ ID NO: 11是ZmRCPl-2啟動(dòng)子正向引物的核苷酸序列。SEQ ID勵(lì):12是21111^^1-2啟動(dòng)子反向引物的核苷酸序列。SEQ ID NO: 13是ZmRCP突變I引物的核苷酸序列。SEQ ID NO: 14是ZmRCP突變2引物的核苷酸序列。SEQ ID NO: 15是ZmRCP突變3引物的核苷酸序列。SEQ ID NO: 16是ZmRCP突變4引物的核苷酸序列。SEQ ID NO: 17是ZmRCP突變5引物的核苷酸序列。SEQ ID NO: 18是ZmRCP突變6引物的核苷酸序列。SEQ ID NO: 19是ZmRCPl終止子正向引物的核苷酸序列。SEQ ID NO:20是ZmRCPl終止子反向引物的核苷酸序列。SEQ ID N0:21是pSYN15670載體的核苷酸序列。定義“反義抑制”指產(chǎn)生了反義RNA轉(zhuǎn)錄物，它能夠抑制來(lái)自?xún)?nèi)源基因或轉(zhuǎn)基因的蛋白的表達(dá)?！扒逗象w的”是指ー個(gè)DNA序列(例如一個(gè)載體或基因)包括兩段或多段不同起源的DNA序列,這些DNA序列通過(guò)重組DNA技術(shù)融合到一起而產(chǎn)生ー個(gè)DNA序列,這ー過(guò)程不會(huì)自然發(fā)生?！叭旧w整合的”指ー個(gè)外來(lái)基因或DNA構(gòu)建體通過(guò)共價(jià)鍵整合進(jìn)入宿主DNA。若基因不是“染色體整合的”，則它們可以是“瞬時(shí)表達(dá)的”?；虻乃矔r(shí)表達(dá)指不整合進(jìn)入宿主染色體中但獨(dú)立發(fā)揮作用的基因的表達(dá)，其作用例如作為自主復(fù)制質(zhì)粒的一部分或表達(dá)盒，或作為另ー個(gè)生物系統(tǒng)(例如病毒)的一部分。“編碼序列”指ー個(gè)DNA或RNA序列，該序列編碼ー個(gè)特定的氨基酸序列并排除非編碼序列。它可以構(gòu)成ー個(gè)“不受干擾的編碼序列”，即例如在ー個(gè)cDNA中缺少內(nèi)含子，或者它可以包括一個(gè)或多個(gè)被合適的剪接連接界定的內(nèi)含子?！皟?nèi)含子”是ー個(gè)RNA序列，該序列包含在初級(jí)轉(zhuǎn)錄物中，但通過(guò)細(xì)胞內(nèi)RNA的切割與再連接被除去，以產(chǎn)生可以被翻譯為蛋白質(zhì)的成熟mRNA。“組成型啟動(dòng)子”是指ー種啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子能夠在所有或幾乎所有的植物組織中、在植物的所有或幾乎所有的發(fā)育階段過(guò)程中表達(dá)它所控制的基因，由此產(chǎn)生該基因的“組成型表達(dá)”?！肮惨种啤焙汀罢x抑制”指產(chǎn)生了正義RNA轉(zhuǎn)錄物，它能夠抑制完全一致的或基本一致的轉(zhuǎn)基因或內(nèi)源基因的表達(dá)(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，231，020)?！斑B續(xù)的”在此是指彼此前后排列在一起的核苷酸序列。 如在此所使用，“玉米根蟲(chóng)”指根螢葉甲屬的昆蟲(chóng)，包括幼蟲(chóng)階段或成蟲(chóng)階段(優(yōu)選幼蟲(chóng)階段)的南方玉米根蟲(chóng)、北方玉米根蟲(chóng)、西方玉米根蟲(chóng)以及墨西哥玉米根蟲(chóng)。本發(fā)明的根冠特異性啟動(dòng)子用于在轉(zhuǎn)基因植物根部表達(dá)玉米根蟲(chóng)毒素，由此保護(hù)轉(zhuǎn)基因植物的田地免受玉米根蟲(chóng)的傷害。術(shù)語(yǔ)“玉米根蟲(chóng)”和根螢葉甲屬在此可互換使用?！氨磉_(dá)”指mRNA的轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定積累。表達(dá)還可以指蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。如在此所使用，“表達(dá)盒”是指ー個(gè)DNA序列，該序列能夠指導(dǎo)ー個(gè)特定的核苷酸序列在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中的表達(dá)，該DNA序列包括ー個(gè)可操作地連接至感興趣的核苷酸序列的啟動(dòng)子，該感興趣的核苷酸序列被可操作地連接至終止信號(hào)。它還典型地包括適當(dāng)翻譯該核苷酸序列所要求的序列。該編碼區(qū)通常編碼ー種感興趣的蛋白質(zhì)，但是還可以編碼ー種感興趣的功能性RNA，例如正義或反義方向的反義RNA或非翻譯性RNA。包含感興趣的核苷酸序列的表達(dá)盒可以是嵌合的，這意味著它的組分中至少有ー個(gè)相對(duì)于它的其他組分中至少ー個(gè)是異源的。啟動(dòng)子(帶有或沒(méi)有增強(qiáng)子)的“表達(dá)模式”是以下表達(dá)水平模式，該模式顯示該啟動(dòng)子在植物的哪個(gè)部分以及發(fā)育階段開(kāi)始轉(zhuǎn)錄。當(dāng)一個(gè)啟動(dòng)子的表達(dá)模式與另ー個(gè)啟動(dòng)子的表達(dá)模式顯示出少量重疊時(shí)，這組啟動(dòng)子的表達(dá)模式被認(rèn)為是互補(bǔ)的?！盎颉笔侵副磉_(dá)mRNA、功能性RNA、或特異性蛋白的核酸片段，包括調(diào)節(jié)序列。術(shù)語(yǔ)“原生基因”是指在自然界中發(fā)現(xiàn)的基因。術(shù)語(yǔ)“嵌合基因”是指包含以下序列的任何基因1)DNA序列，包括調(diào)節(jié)序列和編碼序列，在自然界中這些調(diào)節(jié)序列和編碼序列沒(méi)有發(fā)現(xiàn)在一起，或2)編碼了未自然鄰近的蛋白部分的序列，或3)未自然鄰接的啟動(dòng)子的部分。因此，嵌合基因可以包括源自不同來(lái)源的調(diào)節(jié)序列和編碼序列，或包括源自相同來(lái)源、但以與自然界中所發(fā)現(xiàn)的方式不同的方式進(jìn)行安排的調(diào)節(jié)序列和編碼序列?！稗D(zhuǎn)基因”是指ー個(gè)基因，該基因已經(jīng)通過(guò)轉(zhuǎn)化引入到該基因組中并且得到穩(wěn)定維持。轉(zhuǎn)基因可以包括例如，與有待轉(zhuǎn)化的特定植物的基因異源或同源的基因。此外，轉(zhuǎn)基因可以包括插入到非天然生物內(nèi)的原生基因、或嵌合基因。術(shù)語(yǔ)“內(nèi)源性基因”是指在ー種生物的基因組中位于其天然位置的原生基因?！巴鈦?lái)”基因是指通常地未在宿主生物中發(fā)現(xiàn)、但通過(guò)基因轉(zhuǎn)移引入到該生物中的基因?！盎虺聊笔侵覆《净?、轉(zhuǎn)基因或內(nèi)源性核基因的同源依賴(lài)性抑制。當(dāng)該抑制由于這些受影響的基因轉(zhuǎn)錄而減少時(shí)，基因沉默可以是轉(zhuǎn)錄基因沉默；當(dāng)該抑制由于與這些受影響的基因同源的RNA種類(lèi)的更替(降解)增加時(shí)，基因沉默可以是轉(zhuǎn)錄后基因沉默。(English, et al.，1996，Plant Cell 8:179-1881)?；虺聊ú《菊T導(dǎo)的基因沉默(Ruiz et al. , 1998, Plant Cell 10:937-946)?！斑z傳上穩(wěn)定的”和“可遺傳的”指染色體整合的遺傳元件，這些元件穩(wěn)定維持在植物中并且被子代穩(wěn)定地遺傳連續(xù)數(shù)代?！爱愒碊NA序列”是ー種DNA序列，該序列與將其引入的宿主細(xì)胞并非自然地結(jié)合，包括ー個(gè)自然發(fā)生的DNA序列的非自然發(fā)生的多個(gè)拷貝?！罢T導(dǎo)型啟動(dòng)子”是指那些受調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子，它們可以通過(guò)ー種外部刺激(例如，化學(xué)物質(zhì)、光、激素、應(yīng)力、或ー種病原體)而在ー種或多種細(xì)胞類(lèi)型中出現(xiàn)?！皻⑾x(chóng)的”被定義為ー種能夠控制昆蟲(chóng)的毒性生物活性，優(yōu)選通過(guò)殺死昆蟲(chóng)?！?’非編碼序列”指位于編碼序列5’端(上游)的一個(gè)核苷酸序列。它存在于起始密碼子上游的完全加工過(guò)的mRNA中，并且可以影響初級(jí)轉(zhuǎn)錄物加工成mRNA、mRNA的穩(wěn)定性或翻譯效率。(Turner et al. , 1995, Molecular Biotechnology, 3:225)?！?’非編碼序列”指位于編碼序列的3’端(下游)的核苷酸序列，并且包括多腺苷酸化信號(hào)序列以及其他編碼調(diào)節(jié)信號(hào)的序列，這些調(diào)節(jié)信號(hào)能夠影響mRNA的加工或基因 表達(dá)。多腺苷酸化信號(hào)通常的特征是影響多聚腺苷束添加到mRNA前體的3’末端。不同的3，非編碼序列的用途通過(guò)Ingelbrecht等人舉例說(shuō)明(1989，Plant Cell, I 671-680,)。術(shù)語(yǔ)“核苷酸”指ー種高分子量的多聚核苷酸，它可以是單鏈或雙鏈，由含有ー種糖、磷酸鹽和一種堿基的単體(核苷酸)組成，該堿基是ー種嘌呤或嘧啶。“多核苷酸片段”是一種給定核酸分子的一部分。在高等植物中，脫氧核糖核酸(DNA)是遺傳物質(zhì)，而核糖核酸(RNA)涉及將DNA中所含的信息傳遞到蛋白中?！盎蚪M”是在ー種生物的每個(gè)細(xì)胞中所含有的遺傳物質(zhì)的整體。術(shù)語(yǔ)“核苷酸序列”指DNA或RNA的聚合物，它可以是單鏈或雙鏈，可任選地含有能夠結(jié)合到DNA或RNA聚合物中的合成的、非自然的或改變的核苷酸堿基。術(shù)語(yǔ)“開(kāi)放閱讀框”和“0RF”是指在一個(gè)編碼序列的翻譯起始和終止密碼子之間編碼的氨基酸序列。術(shù)語(yǔ)“起始密碼子”和“終止密碼子”是指ー個(gè)編碼序列中三個(gè)相鄰的核苷酸(“密碼子”)単位，它對(duì)應(yīng)地指明蛋白質(zhì)合成(mRNA翻譯)的起始和鏈終止?！翱刹僮鞯剡B接”和“操作地連接”指將核酸序列結(jié)合到一個(gè)單個(gè)的核酸片段上，這樣ー個(gè)序列的功能會(huì)被另ー個(gè)影響。例如，當(dāng)一個(gè)啟動(dòng)子能夠影響一個(gè)編碼序列或功能RNA的表達(dá)時(shí)(即，該編碼序列或功能RNA受到該啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制)，則該啟動(dòng)子與該編碼序列或功能RNA是可操作地連接的。正義方向或反義方向的編碼序列能夠與調(diào)節(jié)序列可操作地連接?！斑^(guò)表達(dá)”是指轉(zhuǎn)基因生物中的表達(dá)水平，該水平超過(guò)在正?；蛭崔D(zhuǎn)化生物中表達(dá)的水平?！爸参锝M織”包括已分化的和未分化的組織或植物，包括但不限于根、莖、嫩枝、葉、花粉、種子、瘤組織、以及細(xì)胞和培養(yǎng)物的各種形式，例如單個(gè)細(xì)胞、原生質(zhì)體、胚和愈傷組織。植物組織可以在植物中或在器官、組織或細(xì)胞培養(yǎng)物中?！捌帽磉_(dá)”是基因產(chǎn)物的表達(dá)，這些產(chǎn)物以較高的水平優(yōu)選表達(dá)于ー個(gè)或ー些植物組織中(空間限制)和/或ー個(gè)或ー些植物發(fā)育階段中(時(shí)間限制)，同時(shí)在其他組織/發(fā)育階段的表達(dá)水平相對(duì)較低?！俺醮D(zhuǎn)化體”和“ TO代”指轉(zhuǎn)基因植物，這些植物與最初轉(zhuǎn)化的組織具有相同的遺傳代數(shù)(即，從轉(zhuǎn)化起沒(méi)有經(jīng)過(guò)減數(shù)分裂和受精)“次代轉(zhuǎn)化體”和“T1、T2、T3等代”指通過(guò)一次或多次減數(shù)分裂和受精循環(huán)、衍生自“初代轉(zhuǎn)化體”的轉(zhuǎn)基因植物。它們可以通過(guò)初代或次代轉(zhuǎn)化體的自體受精、或者初代或次代轉(zhuǎn)化體與其他轉(zhuǎn)化的或未轉(zhuǎn)化的植物的雜交而獲得。術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”、“肽”和“多肽”在此可互換使用。“啟動(dòng)子”是典型地編碼區(qū)上游的非翻譯DNA序列，它含有RNA聚合成酶的結(jié)合位點(diǎn)并且啟動(dòng)該DNA的轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子區(qū)域也可包括充當(dāng)基因表達(dá)調(diào)節(jié)物的其他元件?！皢?dòng)子調(diào)節(jié)序列”由近端以及更遠(yuǎn)端的上游元件構(gòu)成，更遠(yuǎn)端的上游元件經(jīng)常被稱(chēng)為增強(qiáng)子。因此，“增強(qiáng)子”是ー個(gè)DNA序列，它可以促進(jìn)啟動(dòng)子的活性，并且可以是該啟動(dòng)子的ー個(gè)固有元件或?yàn)榱嗽鰪?qiáng)ー種啟動(dòng)子的水平或組織特異性而插入的異源元件。它能夠在兩個(gè)方向(正?；蚍D(zhuǎn))上進(jìn)行操作，并且甚至從該啟動(dòng)子的上游或下游移動(dòng)時(shí)還能夠發(fā)揮作用。啟動(dòng)子可以全部衍生自ー種原生基因、或者由自然界中發(fā)現(xiàn)的不同啟動(dòng)子所衍生的不同元件構(gòu)成、或甚至由合成的DNA區(qū)段構(gòu)成。“最小或核心啟動(dòng)子”是ー種僅由轉(zhuǎn)錄起始所需要的全部基礎(chǔ)元件(例如，ー個(gè)TATA盒和/或一個(gè)起始子)構(gòu)成的啟動(dòng)子。如在此所使用，“參比序列”被定義為作為序列比較基礎(chǔ)的ー個(gè)序列。一個(gè)參比序列可以是ー個(gè)特定序列子集或整體；例如，作為ー個(gè)全長(zhǎng)cDNA或基因序列的片段、或該全 長(zhǎng)cDNA或基因序列。“受調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子”是指非組成型地、但卻以ー種時(shí)間和/或空間的調(diào)節(jié)方式指導(dǎo)基因表達(dá)的啟動(dòng)子，并且包括組織特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。它包括自然序列以及合成序列、連同可能是合成序列與自然序列的組合的多個(gè)序列。不同啟動(dòng)子可以在不同的組織或細(xì)胞類(lèi)型中、或在發(fā)育的不同階段、或響應(yīng)于不同的環(huán)境條件來(lái)指導(dǎo)基因的表達(dá)?！罢{(diào)節(jié)序列”和“合適的調(diào)節(jié)序列”各自指位于ー個(gè)編碼序列的上游(5'非編碼序列)、內(nèi)部、或下游(3'非編碼序列)的核苷酸序列，并且這些核苷酸序列影響了相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性、或翻譯。這些調(diào)節(jié)序列包括增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子、以及多腺苷酸化信號(hào)序列。它們包括自然序列和合成序列、連同可能是合成序列與自然序列的組合的多個(gè)序列。術(shù)語(yǔ)“RNA轉(zhuǎn)錄物”指由RNA聚合酶催化通過(guò)ー個(gè)DNA序列的轉(zhuǎn)錄而得到的產(chǎn)物。當(dāng)RNA轉(zhuǎn)錄物是該DNA序列的完美互補(bǔ)拷貝時(shí)，它被稱(chēng)作初級(jí)轉(zhuǎn)錄物；或者它可以是由初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的轉(zhuǎn)錄后加工而衍生的RNA序列，并且被稱(chēng)為成熟RNA?！靶攀筊NA” (mRNA)指沒(méi)有內(nèi)含子并且可以被細(xì)胞翻譯成蛋白質(zhì)的RNA?！癱DNA”指一種單鏈或雙鏈的DNA，它與mRNA互補(bǔ)并且衍生自mRNA。“功能性RNA”指一種反義RNA、核糖核酸酶、或其他不被翻譯但作為RNA參與ー個(gè)反應(yīng)或過(guò)程的RNA。術(shù)語(yǔ)“根”指植物的基本結(jié)構(gòu)。通常，根是ー個(gè)種子植物本體的地下部分，通常源自下胚軸。它作為一種吸收、換氣以及食物貯藏的器官、或作為錨固與支撐手段的器官而發(fā)揮專(zhuān)用干。根與莖不同，特別是在缺少生葉處、芽以及葉方面。玉米植物有三種根。種子根、不定根以及支持根。種子根由胚根發(fā)育而成，并且持續(xù)很長(zhǎng)時(shí)間。不定根是由地下莖較下方的生葉處所發(fā)育的須根，并且是植物有作用的、有活性的根。支持根或支柱根由該莖的較下方的兩個(gè)生葉處產(chǎn)生。術(shù)語(yǔ)“根冠”指套管狀的薄壁細(xì)胞團(tuán)，它覆蓋著生長(zhǎng)的根尖并且將其保護(hù)，因?yàn)樗┩竿翂锤陔S著根尖的生長(zhǎng)增長(zhǎng)而向前推迸。根冠周?chē)募?xì)胞隨著根冠的推進(jìn)而脫落，而新的細(xì)胞由頂端分生組織加入。根冠保護(hù)了頂端的分生組織，當(dāng)根穿透土壤時(shí)輔助根，并且在控制根對(duì)重力的反應(yīng)(向地性)方面發(fā)揮重要作用。
“選擇標(biāo)記基因”指ー種基因，該基因在植物細(xì)胞中的表達(dá)給予該細(xì)胞ー種選擇優(yōu)勢(shì)。用選擇標(biāo)記基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞所具有的選擇優(yōu)勢(shì)可以是由于與非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)能力相比，這些轉(zhuǎn)化細(xì)胞在陰性選擇劑(例如抗菌素或除草剤)存在下具有生長(zhǎng)能力。這些轉(zhuǎn)化細(xì)胞所具有的選擇優(yōu)勢(shì)還可以是由干與非轉(zhuǎn)化細(xì)胞相比，它們將ー種添加的化合物用作營(yíng)養(yǎng)素、生長(zhǎng)因子或能源的能力增強(qiáng)。轉(zhuǎn)化細(xì)胞所具有的選擇優(yōu)勢(shì)還可以是由于丟失了ー個(gè)先前擁有的基因，這被稱(chēng)為“負(fù)性選擇”。其中，加入ー種化合物，該化合物僅對(duì)沒(méi)有丟失母細(xì)胞中存在的特定基因(ー個(gè)負(fù)性選擇標(biāo)記基因)的細(xì)胞具有毒性，該母細(xì)胞典型地來(lái)自ー種轉(zhuǎn)基因植物。 “特異性表達(dá)”是表達(dá)了基因產(chǎn)物，該表達(dá)被限定在ー個(gè)或ー些植物組織中(空間限制)和/或ー個(gè)或ー些植物發(fā)育階段(時(shí)間限制)。基本一致的在兩個(gè)核酸或蛋白質(zhì)序列的背景下，短語(yǔ)“基本一致的”是指兩個(gè)或多個(gè)序列或子序列，當(dāng)比較和比對(duì)最大對(duì)應(yīng)性時(shí)，它們具有至少60%、優(yōu)選80%、更優(yōu)選90%、甚至更優(yōu)選95%、并且最優(yōu)選至少99%的核苷酸或氨基酸殘基的一致性，正如使用以下序列比較算法之一或通過(guò)目測(cè)檢查所測(cè)量。優(yōu)選地，這種基本一致存在于整個(gè)長(zhǎng)度為至少約50個(gè)殘基的序列的區(qū)域中，更優(yōu)選地整個(gè)至少約100個(gè)殘基的區(qū)域中，并且最優(yōu)選地該序列在至少約150殘基中是基本一致的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，這些序列在整個(gè)編碼區(qū)的長(zhǎng)度內(nèi)是基本一致的。此外，基本一致的核酸或蛋白序列基本上執(zhí)行相同的功能。對(duì)于序列比較，典型地是ー個(gè)序列充當(dāng)參比序列而與測(cè)試序列進(jìn)行比較。當(dāng)使用ー種序列比較算法吋，將測(cè)試序列與參比序列輸入到計(jì)算機(jī)中(如有必要，指定子序列坐標(biāo))，并且指定序列算法程序的參數(shù)。然后，這種序列比較算法依據(jù)所指定的程序參數(shù)來(lái)計(jì)算這個(gè)或這些測(cè)試序列相對(duì)于參比序列的序列一致性百分?jǐn)?shù)。本領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，為了避免由于多聚核苷酸包含空隙而導(dǎo)致與參比序列的高度相似性，典型地引入空隙罰分并且將其從匹配數(shù)中減去。用于比較的序列最佳比對(duì)可以按照以下方式進(jìn)行，例如通過(guò)Smith &Waterman, 1981, Adv. App I. Math. 2:482 的局部同源性算法、通過(guò) Needleman &Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443 的同源比對(duì)算法、通過(guò) Pearson & Lipman, 1988, Proc.Nat' I. Acad. Sci. 85:2444的相似性法搜索、通過(guò)這些算法(威斯康辛州麥迪遜市科學(xué)大道575號(hào)遺傳計(jì)算基團(tuán)(Genetics Computer Group)的威斯康辛遺傳軟件包中的GAP、BESTFIT、FASTA、以及TFASTA)的計(jì)算機(jī)化實(shí)施、或通過(guò)目測(cè)檢查(通常參見(jiàn)Ausubel等人，見(jiàn)下文)。適合于確定序列一致性百分?jǐn)?shù)以及序列相似性的算法的ー個(gè)實(shí)例是BLAST算法，它說(shuō)明于 Altschul et al.，1990，J. Mol. Biol. 215:403-410.。執(zhí)行 BLAST 分析的軟件可通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information)公開(kāi)獲得(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)。這種算法涉及首先通過(guò)識(shí)別查詢(xún)序列中長(zhǎng)度為W的短字而識(shí)別得分高的序列對(duì)(HSP)，這些得分高的序列對(duì)當(dāng)與數(shù)據(jù)庫(kù)中長(zhǎng)度相同的字符比對(duì)時(shí)匹配或滿(mǎn)足某個(gè)陽(yáng)性值的閾值得分T。T被稱(chēng)為鄰近字符得分閾值(Altschul等人，1990)。這些初始的鄰近字符命中充當(dāng)種子用于啟動(dòng)捜索，以便發(fā)現(xiàn)包含它們的較長(zhǎng)的HSP。然后，將這些字符命中在兩個(gè)方向上沿著每個(gè)序列延長(zhǎng)，直到累積的比對(duì)得分可以增加。對(duì)于核苷酸序列，使用參數(shù)M (—對(duì)匹配殘基的獎(jiǎng)賞得分；總是>0 ^PN (錯(cuò)配殘基的罰分；總是〈O)來(lái)計(jì)算累積的得分。對(duì)于氨基酸序列，使用打分矩陣來(lái)計(jì)算累積的得分。當(dāng)累積的比對(duì)得分從它所達(dá)到的最大值降低數(shù)量X、由于ー個(gè)或多個(gè)得分為負(fù)的殘基比對(duì)使累積的得分降至O或O以下時(shí)、或者到達(dá)各自序列的末端時(shí)，這些字符命中在每個(gè)方向的延伸停止。BLAST算法的參數(shù)W、T、和X決定了該比對(duì)的靈敏度與速度。BLASTN程序(對(duì)于核苷酸序列)使用的默認(rèn)值是字符長(zhǎng)度(W) 11、期望值(E) 10、截止值100、M=5、N=-4、以及兩股比較。對(duì)于氨基酸序列，BLASTP程序使用的默認(rèn)值是字符長(zhǎng)度(W) 3、期望值(E) 10、以及BLOSUM62得分矩陣(見(jiàn) Henikoff & Henikoff 1989，Proc. Natl. Acad. Sci. 89:10915)。除了計(jì)算序列 一致性百分?jǐn)?shù)之外，BLAST算法還進(jìn)行兩個(gè)序列之間相似性的統(tǒng)計(jì)分析(見(jiàn)，例如Karlin & Altschul, Proc. Nat' I. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993))。由BLAST算法提供的相似性的ー種測(cè)量值是最小概率和(P (N))，它提供了兩個(gè)核苷酸或氨基酸序列之間偶然發(fā)生匹配的概率的指示。例如，若在測(cè)試核酸序列與參比核酸序列的比較中最小概率和小于約0. I、更優(yōu)選地是小于約0. 01、并且最優(yōu)選地是小于約0. 001，則該測(cè)試核酸序列被認(rèn)為是與該參比序列類(lèi)似的。為了本發(fā)明的目的，比較核苷酸序列用于確定與在此公開(kāi)的啟動(dòng)子序列的序列一致性百分比，優(yōu)選地是使用BlastN程序(I. 4. 7或以后版本)及其默認(rèn)參數(shù)或任何等效程序。提及“等效程序”是指任何序列比較程序，當(dāng)任意兩段關(guān)注的序列與優(yōu)選程序所產(chǎn)生的對(duì)應(yīng)比對(duì)比較時(shí)，該程序產(chǎn)生了具有相同的核苷酸或氨基酸殘基匹配的比對(duì)，以及相同的百分比序列一致性。兩個(gè)核酸序列是基本一致的另ー種指標(biāo)是這兩個(gè)分子在嚴(yán)格雜交條件下彼此雜交。短語(yǔ)“特異性雜交”是指當(dāng)ー個(gè)特定的核苷酸序列存在于DNA或RNA的復(fù)雜混合物(例如，總細(xì)胞)時(shí)，ー個(gè)分子在嚴(yán)格雜交條件下只與該序列結(jié)合、雙鏈化或雜交。“基本上結(jié)合”是指探針核酸與靶核酸之間的互補(bǔ)性雜交，并且涵蓋了少量錯(cuò)配，這些錯(cuò)配可以通過(guò)降低雜交介質(zhì)的嚴(yán)格程度來(lái)調(diào)節(jié)，從而實(shí)現(xiàn)所希望的目標(biāo)核酸序列檢測(cè)。在核酸雜交實(shí)驗(yàn)的背景下(例如，DNA及RNA雜交)，“嚴(yán)格雜交條件”和“嚴(yán)格雜交洗滌條件”是序列依賴(lài)的，并且在不同環(huán)境參數(shù)下是不同的。較長(zhǎng)的序列在較高的溫度下特異性地雜交。核酸雜交的全面指導(dǎo)發(fā)現(xiàn)于Tijssen (1993)《實(shí)驗(yàn)室生物化學(xué)與分子生物學(xué)技木》-核苷酸探針雜交第I部分，第二章“雜交原理概論和核酸探針測(cè)定的策略”，愛(ài)思維爾(Elsevier)，紐約。通常，在限定的離子強(qiáng)度和pH值條件下，選擇高嚴(yán)格雜交條件和洗滌條件，使其比該特異序列的熱熔點(diǎn)(Tm)約低5°C。典型地，在高嚴(yán)格條件下，探針將與它的靶子序列雜交，而不與其他序列雜交。Tm是50%的目標(biāo)序列與ー種完全匹配的探針進(jìn)行雜交所處的溫度(在限定的離子強(qiáng)度及PH下)。選擇極度高嚴(yán)格條件，使其與ー種特定探針的! 相同。用于互補(bǔ)核酸(這些核酸在DNA印跡法或RNA印跡法的濾紙上具有超過(guò)100個(gè)互補(bǔ)的殘基)雜交的高嚴(yán)格雜交條件的ー個(gè)實(shí)例是50%甲酰胺與Img肝素在42°C雜交過(guò)夜。極高嚴(yán)格洗滌條件的ー個(gè)實(shí)例是0. 15M NaCl，在72°C下約15分鐘。高嚴(yán)格洗滌條件的ー個(gè)實(shí)例是0. 2x SSC洗滌，在65°C下進(jìn)行15分鐘(參見(jiàn)，Sambrook，見(jiàn)下文對(duì)于SSC緩沖液的描述)。通常，一種高嚴(yán)格洗滌之前會(huì)先進(jìn)行ー種低嚴(yán)格洗滌，以去除背景探針信號(hào)。對(duì)于例如具有超過(guò)100個(gè)核苷酸的雙鏈體，中等嚴(yán)格洗滌的實(shí)例是Ix SSC，在45°C持續(xù)15分鐘。對(duì)于例如具有超過(guò)100個(gè)核苷酸的雙鏈體，低嚴(yán)格洗滌的例子是在40°C下以4-6x SSC持續(xù)15分鐘。對(duì)于短探針(例如，大約10-50個(gè)核苷酸)，高嚴(yán)格條件典型地涉及鹽濃度小于約I. OM的Na離子，典型地在pH 7. 0-8. 3下大約0. 01至I. OM的Na離子濃度(或其他鹽類(lèi))，并且溫度典型地是至少約30°C。高嚴(yán)格條件還可以通過(guò)加入去穩(wěn)定試劑(例如甲酰胺)來(lái)實(shí)現(xiàn)。一般而言，在特定的雜交測(cè)定中觀察到比不相關(guān)的探針高出2倍(或更高)的信噪比就表明檢測(cè)到ー種特異的雜交。如果核酸編碼的蛋白質(zhì)基本一致，則在高嚴(yán)格條件下彼此不雜交的核酸仍然是基本一致的。例如，當(dāng)使用遺傳密碼允許的最大程度的密碼簡(jiǎn)并而生成ー個(gè)核酸的拷貝時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)這種情況。
低嚴(yán)格條件包括用30%至35%的甲酰胺、IM NaCl、1%SDS (十二烷基硫酸鈉)的緩沖溶液在37°C下雜交，并且在IX至2X SSC (20X SSC=3. OM NaCl/0. 3M枸櫞酸三鈉)中在50°C至55°C下洗滌。示例性的中等嚴(yán)格條件包括在40%至45%甲酰胺、I. OM NaCl、l%SDS中在37°C下雜交，并且在0. 5X至IX SSC中在55°C至60°C下洗滌。示例性的高嚴(yán)格條件包括在0%甲酰胺、IM NaCl、l%SDS中在37°C下雜交，并且在0. IX SSC在60°C至65°C下洗滌。以下是可以用來(lái)克隆同源核苷酸序列的雜交/洗滌條件組的例子，這些序列與本發(fā)明的參比核苷酸序列是基本一致的一種參比核苷酸序列在以下條件下優(yōu)選地與該參比核苷酸序列雜交在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0. 5M NaPO4UmM EDTA中在50°C下，并且在2x SSC、0. 1%SDS中在50°C下洗滌；更令人希望的是在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0. 5MNaPO4UmM EDTA中在50°C下，并且在Ix SSC,0. 1%SDS中在50°C下洗滌；仍又更加令人希望的是在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0. 5M NaPO4UmM EDTA中在50°C下，并且在0. 5x SSC、0. 1%SDS中在50°C下洗滌；優(yōu)選在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0. 5M NaPO4UmM EDTA中在50°C下，并且在0. Ix SSC,0. 1%SDS中在50°C下洗滌；更優(yōu)選在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、
0.5M NaPO4UmM EDTA 中在 50°C下，并且在 0. Ix SSC,0. 1%SDS 中在 65°C下洗滌。特異性典型地是雜交后洗滌的功能，關(guān)鍵因素為最終洗滌溶液的離子強(qiáng)度和溫度。對(duì)于 DNA-DNA 雜交，！ 可以由 Meinkoth and Wahl Anal. Biochem. 138:267-284 (1984)的方程近似計(jì)算出來(lái)；TM 81. 5°C +16. 6 (log M) +0. 41 (%GC) -0. 61 (%form) -500/L ;其中 M是一價(jià)陽(yáng)離子的摩爾濃度，%GC是該DNA中鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶核苷酸的百分比，%形式是該雜交溶液中甲酰胺的百分比，并且L是堿基對(duì)中雜交的長(zhǎng)度。TM是ー個(gè)互補(bǔ)的目標(biāo)序列的50%雜交到ー個(gè)完全匹配的探針時(shí)的溫度(在限定的離子強(qiáng)度及PH下)。每1%的錯(cuò)配會(huì)使T降低大約1°C ;因此，可以調(diào)節(jié)TM、雜交和/或洗滌條件以便使其雜交到具有所希望的一致性的序列上。例如，若找到一致性大于90%的序列，則該Tm可以降低10°C。通常，對(duì)于處于限定的離子強(qiáng)度和PH值條件下的特異序列及其互補(bǔ)序列，高嚴(yán)格條件被選擇為比熱熔點(diǎn)(Tm)約低19°C。然而，極高嚴(yán)格條件可以利用比熱熔點(diǎn)(Tm)低1°C、2°C、3°C或4°C的雜交和/或洗滌；中等嚴(yán)格條件可以利用比熱熔點(diǎn)(Tm)低6°C、7°C、8°C、9°C或10°C的雜交和/或洗滌；低嚴(yán)格條件可以利用比熱熔點(diǎn)(Tm)低ire、12°C、13°C、14°C、150C或20°C的雜交和/或洗滌。使用這些方程、雜交和洗滌組合物以及所希望的T，普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解雜交和/或洗滌溶液的嚴(yán)格程度變化是固有地描述。如果所希望的錯(cuò)配程度導(dǎo)致低于45°C (水性溶液)或32°C (甲酰胺溶液)的T，優(yōu)選增加SSC濃度這樣可以使用更高的溫度。核酸雜交的全面指導(dǎo)見(jiàn)于Tijssen (1993)《實(shí)驗(yàn)室生物化學(xué)與分子生物學(xué)技木》-核苷酸探針雜交第I部分第二章(愛(ài)思維爾，紐約)；以及Ausubel等人(1995)《現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)方案》第
2章(Greene Publishing and Wiley - Interscience,紐約)。參見(jiàn) Sambrook 等人(1989)《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，普萊恩維爾(Plainview)，紐約)。兩個(gè)核酸序列或蛋白質(zhì)是基本一致的另ー個(gè)指示是指由該第一核酸編碼的蛋白質(zhì)與由該第二核酸編碼的蛋白進(jìn)行免疫性交聯(lián)反應(yīng)或與其特異性結(jié)合。因此，ー種蛋白質(zhì)典型地是與ー種第二蛋白質(zhì)是基本一致的，例如當(dāng)這兩種蛋白的區(qū)別僅僅是保存性置換時(shí)?！敖M織特異性啟動(dòng)子“是指以下受調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子，它們不表達(dá)于所有植物細(xì)胞中而僅僅在特定器官(例如，葉、根或種子)或特異性組織(例如，胚或子葉)的ー個(gè)或多個(gè)細(xì)胞類(lèi)型、或特定的細(xì)胞類(lèi)型(例如，葉實(shí)質(zhì)或種子存儲(chǔ)細(xì)胞)中。這些啟動(dòng)子還包括受時(shí)間調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子，例如在胚形成的初期或晩期、在種子或果實(shí)發(fā)育的果實(shí)催熟期、在完全分化的葉中、或在開(kāi)始衰老時(shí)。術(shù)語(yǔ)“反式激活基因”指編碼ー種反式激活蛋白的基因。它可以編碼ー種轉(zhuǎn)錄因子。它可以是ー種天然基因(例如ー種植物轉(zhuǎn)錄激活子)或一種嵌合基因，例如當(dāng)植物調(diào)節(jié)序列可操作地連接至來(lái)自另ー種生物的轉(zhuǎn)錄因子的開(kāi)放閱讀框吋。“反式激活基因”可以是染色體整合的或瞬時(shí)表達(dá)的。“反式激活”指通過(guò)另ー種反式(調(diào)控的)基因的表達(dá)而開(kāi)啟基因。“表達(dá)盒”在5' -3'的轉(zhuǎn)錄方向上包括一個(gè)轉(zhuǎn)錄和翻譯的起始區(qū)、一個(gè)感興趣的DNA序列以及ー個(gè)在植物中發(fā)揮作用的轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止區(qū)。該終止區(qū)可以是與該轉(zhuǎn)錄起始區(qū)原生的，可以是與該感興趣的DNA序列原生的，或可以從其他來(lái)源衍生。“轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)”是圍繞著該第一核苷酸的位置，它是經(jīng)轉(zhuǎn)錄的序列的一部分，還被定義為位置+1。根據(jù)這個(gè)位置，對(duì)該基因的所有其他序列及它們的控制區(qū)域進(jìn)行編號(hào)。對(duì)下游序列(即，在3'方向上的其他蛋白編碼序列)進(jìn)行正性命名，而對(duì)上游序列(在5'方向上的大多數(shù)控制區(qū)域)進(jìn)行負(fù)性命名。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”指將ー個(gè)核酸片段轉(zhuǎn)移到ー個(gè)宿主細(xì)胞的基因組中，導(dǎo)致遺傳學(xué)上的穩(wěn)定遺傳?！八矔r(shí)轉(zhuǎn)化的”指已引入轉(zhuǎn)基因或外來(lái)DNA的細(xì)胞(例如，通過(guò)諸如農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化或基因槍轟擊)，但不選擇用于穩(wěn)定保持?！胺€(wěn)定轉(zhuǎn)化的”是指已被選擇并且在轉(zhuǎn)化后在選擇性培養(yǎng)基上再生的細(xì)胞“轉(zhuǎn)化的/轉(zhuǎn)基因的/重組的”是指已經(jīng)引入一種異源核酸分子的宿主生物，例如一種細(xì)菌或植物。該核酸分子可以被穩(wěn)定地整合到宿主的基因組中，或者該核酸分子還可以作為ー種染色體外分子存在。這種染色體外分子能夠自動(dòng)復(fù)制。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織或植物應(yīng)當(dāng)理解為不僅包含一個(gè)轉(zhuǎn)化過(guò)程的最終產(chǎn)物，還包含其轉(zhuǎn)基因子代?！胺寝D(zhuǎn)化的”、“非轉(zhuǎn)基因的”、或“非重組的”宿主是指ー種野生型生物，例如一種細(xì)菌或植物，它不含異源核酸分子。“瞬時(shí)表達(dá)”是指在細(xì)胞中表達(dá)，其中ー種病毒或轉(zhuǎn)基因通過(guò)病毒感染或通過(guò)諸如農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、電穿孔或基因槍轟擊等方法被引入到細(xì)胞中，但不選擇用于穩(wěn)定維持。術(shù)語(yǔ)“翻譯前導(dǎo)序列”是指在啟動(dòng)子和編碼序列之間的基因DNA序列部分，該部分被轉(zhuǎn)錄成RNA并且存在于翻譯起始密碼子(5')上游的全部加工過(guò)的mRNA中。翻譯前導(dǎo)序列可以影響初級(jí)轉(zhuǎn)錄物加工成mRNA、mRNA的穩(wěn)定性或翻譯效率。 “載體”被定義為除了其他之外還包括雙股或單股、線形或環(huán)形的任ー質(zhì)粒、黏粒、噬菌體或農(nóng)桿菌ニ元載體，它們可以進(jìn)行或不能進(jìn)行自我傳送或移動(dòng)，并且它們可以通過(guò)整合到細(xì)胞基因組中或存在于染色體外而轉(zhuǎn)化原核或真核生物的宿主(例如，具有ー個(gè)復(fù)制起點(diǎn)的自主復(fù)制質(zhì)粒)。尤其包括的是穿梭載體，提及“穿梭載體”是指ー種DNA運(yùn)載體，它能夠自然地或通過(guò)設(shè)計(jì)在兩個(gè)不同宿主生物中復(fù)制，這些宿主生物可以選自放線菌以及相關(guān)物種、細(xì)菌和真核生物(例如，高等植物、哺乳動(dòng)物、酵母或真菌細(xì)胞)?！翱梢?jiàn)標(biāo)記”指ー種基因，該基因的表達(dá)不會(huì)為轉(zhuǎn)化細(xì)胞提供優(yōu)勢(shì)，但可以被檢測(cè)到或看到?？梢?jiàn)標(biāo)記的實(shí)例包括但不限干￠-葡萄糖醛酸酶(⑶S)、螢光素酶(LUC)以及綠色熒光蛋白(GFP)。“野生型”是指在自然界中發(fā)現(xiàn)的沒(méi)有任何已知突變的正?；?、病毒或生物。發(fā)明詳細(xì)說(shuō)明根特異性基因、啟動(dòng)子以及同源物的鑒定在很多情況下，希望的是對(duì)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)進(jìn)行空間調(diào)節(jié)，以便使其僅在植物根組 織中表達(dá)。能夠以特異性或偏好性的方式指導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子可以最快完成這種空間調(diào)節(jié)。本發(fā)明提供了分離的核酸分子，這些分子具有一個(gè)在根部指導(dǎo)特異性轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列。根特異性啟動(dòng)子的分離方式是通過(guò)識(shí)別在目標(biāo)植物的根組織中特異性表達(dá)的基因，并且接著分離這些基因的調(diào)節(jié)序列。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員還應(yīng)當(dāng)清楚的是，使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法可以將ー個(gè)或多個(gè)核苷酸的突變、插入、缺失和/或置換引入核苷酸序列SEQ ID N0:1。此外，將本發(fā)明的序列重組可以提供新的以及變化的核苷酸序列。為了測(cè)試根據(jù)本發(fā)明的變體DNA序列的功能，例如SEQ ID NO: I的缺失片段，將感興趣的序列可操作地連接到ー個(gè)選擇標(biāo)記基因或可見(jiàn)標(biāo)記基因，并且在使用分離的根組織或細(xì)胞的瞬時(shí)表達(dá)測(cè)定中或通過(guò)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化到植物中測(cè)試該標(biāo)記基因的表達(dá)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解，能夠促進(jìn)ー種相關(guān)編碼序列表達(dá)的DNA序列是以ー種模塊方式建造的。因此，較短DNA片段的表達(dá)水平與最長(zhǎng)片段的表達(dá)水平可能是不同的，并且彼此之間可以是不同的。例如，缺失ー個(gè)下調(diào)上游元件將導(dǎo)致相關(guān)編碼序列的表達(dá)水平増加，而缺失一個(gè)上調(diào)元件會(huì)降低相關(guān)編碼序列的表達(dá)水平。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員還應(yīng)當(dāng)了解，發(fā)育特異性或組織特異性元件的缺失將產(chǎn)生ー種在時(shí)間或空間上改變的相關(guān)編碼序列表達(dá)譜。在本發(fā)明的另ー個(gè)實(shí)施方案中，與SEQ ID NO: I同源的DNA和基因組DNA序列可以使用本領(lǐng)域內(nèi)熟知的雜交或PCR技術(shù)從其他玉米種質(zhì)中分離。。這些分離的序列與SEQID NO: I可以是一致的或它們與SEQ ID N0:1可以是基本一致的。獲自其他玉米種質(zhì)的序列沒(méi)有必要包含相同的核苷酸序列以便與在此披露的這些序列功能一致。一些核苷酸的缺失、加入以及置換可以對(duì)基因表達(dá)沒(méi)有影響或影響很小。根據(jù)本發(fā)明，一方面是ー種分離的核酸分子，該分子包括一個(gè)核苷酸序列，該序列具有與SEQ ID NO: I中給出的核苷酸序列至少70%的一致性。另ー方面是ー種分離的核酸分子，該分子包括一個(gè)核苷酸序列，該序列具有與SEQ ID NO: I中給出的核苷酸序列至少80%的一致性。另ー方面是ー種分離的核酸分子，該分子包括一個(gè)核苷酸序列，該序列具有與SEQ ID NO: I中給出的核苷酸序列之任意一個(gè)至少90%的一致性。另ー方面是ー種分離的核酸分子，該分子包括一個(gè)核苷酸序列，該序列具有與SEQ ID NO: I中給出的核苷酸序列至少95%的一致性。另ー方面是ー種分離的核酸分子，該分子包括一個(gè)核苷酸序列，該序列具有與SEQ ID NO: I中給出的核苷酸序列至少99%的一致性。另ー方面是ー種分離的核酸分子，該分子包括在SEQ ID NO: I中給出的核苷酸序列之任意ー個(gè)。在本發(fā)明的另ー個(gè)實(shí)施方案中，cDNA和基因組DNA的序列可以從其他植物克隆，這些植物代表著根特異性玉米基因和啟動(dòng)子的同源物。這些同源物允許獲得對(duì)根部多個(gè)基因調(diào)節(jié)有用的其他根特異性啟動(dòng)子。使用這些玉米cDNA以及基因組的序列或它們的部分進(jìn)行雜交，用于篩選其他植物基因組中的同源物或基本一致的序列。這些序列可以?xún)H包括核苷酸SEQ ID N0S: 1-2的ー個(gè)子集。同源性的優(yōu)選長(zhǎng)度是20個(gè)堿基對(duì)(bp)，更優(yōu)選長(zhǎng)度為50bp，并且最優(yōu)選至少lOObp。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)雜交探針是從SEQ IDN0S: 1-2中任意一個(gè)或它的部分制備的。此類(lèi)序列的雜交可以在高嚴(yán)格條件下進(jìn)行?？商娲?，可以使用低嚴(yán)格或中嚴(yán)格條件以允許序列中出現(xiàn)ー些錯(cuò)配，以便檢測(cè)到更低程度的相似性(異源探査)。一般，一個(gè)探針的長(zhǎng)度低于大約1000個(gè)核苷酸，優(yōu)選長(zhǎng)度低于500個(gè)核苷酸。在本發(fā)明的另ー個(gè)實(shí)施方案中，CDNA和基因組的序列是通過(guò)制備包括SEQ IDN0S: 1-2中任意ー個(gè)的序列的引物而分離。這些引物可以用于ー個(gè)PCR反應(yīng)，該反應(yīng)使用來(lái)自植物的cDNA或基因組DNA，以便獲得同源序列或與SEQ ID N0S: 1_2中的任意ー個(gè)基本一致的序列。表達(dá)盒的構(gòu)建所構(gòu)建的表達(dá)盒包括根特異性基因組克隆的5’側(cè)翼序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，每個(gè)表達(dá)盒所利用的啟動(dòng)子區(qū)域包括5’側(cè)翼區(qū)域，直到并且包括翻譯起始。翻譯的起始是由在該cDNA和同源基因組序列中發(fā)現(xiàn)的開(kāi)放閱讀框(ORF)的第一個(gè)ATG來(lái)表示的。因此，該啟動(dòng)子區(qū)域可以包括5’非翻譯前導(dǎo)序列以及轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、核心啟動(dòng)子以及其他調(diào)節(jié)元件。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所構(gòu)建的表達(dá)盒包括根特異性基因組克隆的5’側(cè)翼序列，直到并且包括該轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)可以通過(guò)獲得的最長(zhǎng)cDNA克隆的第一個(gè)核苷酸來(lái)定義。此外，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)可以進(jìn)ー步通過(guò)使用本領(lǐng)域內(nèi)熟知的技術(shù)來(lái)定義，包括RACE PCR, RNase保護(hù)作圖以及引物延伸分析。這些表達(dá)盒可以進(jìn)一歩包括該啟動(dòng)子下游(3’)的一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止子。可以獲得多種轉(zhuǎn)錄終止子用于表達(dá)盒。該轉(zhuǎn)錄終止子負(fù)責(zé)在該轉(zhuǎn)基因之外終止轉(zhuǎn)錄，以及使mRNA轉(zhuǎn)錄物正確進(jìn)行mRNA多聚腺苷酸化。適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄終止子是已知在植物中發(fā)揮作用的那些終止子，并且包括CaMV 35S終止子、tml終止子、胭脂堿合成酶終止子、豌豆rbcSE9終止子以及ZmRCPl終止子。這些終止子可以在單子葉植物和雙子葉植物中使用。此外，可以使用一種基因的原生轉(zhuǎn)錄終止子。例如，可以使用ー個(gè)3’側(cè)翼序列，該序列包含位于ー個(gè)區(qū)域的
3‘端的基因組序列，該區(qū)域與ー個(gè)根特異性cDNA克隆同源。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，ー個(gè)異源編碼序列(例如殺蟲(chóng)編碼序列、可見(jiàn)標(biāo)記編碼序列或選擇標(biāo)記編碼序列)是在本發(fā)明的一個(gè)啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄終止子之間克隆的，由此該異源編碼序列是可操作地連接到該啟動(dòng)子，并且該轉(zhuǎn)錄終止子是可操作地連接到該異源編碼序列。對(duì)于本發(fā)明有用的可見(jiàn)標(biāo)記的實(shí)例包括但不限于P -葡萄糖醛酸酶(GUS)、氯霉 素こ酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、螢光素酶(LUC)以及具有熒光特性的蛋白質(zhì)例如來(lái)自維多利亞多管發(fā)光水母(Aequora victoria)綠色突光蛋白(GFP)。原則上,很多其他蛋白適合用于此目的，條件是蛋白不會(huì)干擾重要的植物發(fā)揮作用。對(duì)于本發(fā)明有用的異源編碼序列的其他實(shí) 例包括但不限干抗生素抗性、病毒抗性、抗蟲(chóng)性、抗病性，或者對(duì)其他害蟲(chóng)的抗性、除草劑耐受性、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值改進(jìn)、エ業(yè)性能改進(jìn)或者繁殖能力改變。在本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方案的ー個(gè)方面，對(duì)以這些植物的根為食的昆蟲(chóng)的抗性進(jìn)行編碼的基因是在該啟動(dòng)子和終止子之間克隆的。在本發(fā)明的另ー個(gè)實(shí)施方案中，編碼了功能RNA (例如反義RNA，ー種用于正義抑制的正義RNA、或一種雙鏈RNA)還可以在該啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子之間克隆的。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，該啟動(dòng)子可以通過(guò)ー種轉(zhuǎn)基因途徑用于改進(jìn)根發(fā)育、水與營(yíng)養(yǎng)物的吸收和利用，并因此改進(jìn)脅迫耐受性。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多序列增強(qiáng)了來(lái)自轉(zhuǎn)錄単位之內(nèi)的基因表達(dá)，并且這些序列可以與本發(fā)明的啟動(dòng)子結(jié)合使用以增加它們?cè)谵D(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)。不同的內(nèi)含子序列已顯示增強(qiáng)了表達(dá)，特別是在單子葉植物的細(xì)胞中。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)玉米AdhI基因的內(nèi)含子當(dāng)引入玉米細(xì)胞中時(shí)，顯著地增強(qiáng)了野生型基因在其同源啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)下表達(dá)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子I是特別有效的，并且增強(qiáng)了具有氯霉素こ酰轉(zhuǎn)移酶基因的融合構(gòu)建體中的表達(dá)(Callis etal. , Genes Develop. 1:1183-1200 (1987))。在相同的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，來(lái)自玉米bronze I基因 的內(nèi)含子在增強(qiáng)表達(dá)方面具有相似的效果。內(nèi)含子序列已經(jīng)被常規(guī)地結(jié)合到植物轉(zhuǎn)化載體中，典型地在非翻譯前導(dǎo)序列中。還已知許多源自病毒的未翻譯前導(dǎo)序列增強(qiáng)了表達(dá)，并且這些序列在雙子葉植物的細(xì)胞中是特別有效的。確切地說(shuō)，來(lái)自煙草花葉病毒(TMV，“W-序列”)、玉米褪綠斑駁病毒(MCMV)、以及苜?；ㄈ~病毒(AMV)的前導(dǎo)序列已顯示出在增強(qiáng)表達(dá)方面是有效的(例如，Gallie et al. Nucl. Acids Res. 15:8693-8711 (1987) ; Skuzeskiet al. Plant Molec. Biol. 15:65-79 (1990))。本領(lǐng)域中已知的其他前導(dǎo)序列包括但不限于細(xì)小核糖核酸病毒前導(dǎo)序列，例如，EMCV前導(dǎo)序列(腦心肌炎5'非編碼區(qū))(Elroy-Stein, 0. , Fuerst, T. R. , and Moss, B. PNAS USA 86:6126-6130(1989);馬鈴薯 Y病毒屬前導(dǎo)序列，例如TEV前導(dǎo)序列(煙草蝕紋病毒)(Allison等人，1986) ；MDMV前導(dǎo)序列(玉米矮花葉病毒);Virology 154:9-20 ;人免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(BiP)前導(dǎo)序列(Mace jak, D. G. , and Sarnow, P. , Nature 353:90-94 (1991));來(lái)自首猜花葉病韋的外殼蛋白 mRNA 的未翻譯的前導(dǎo)序列(AMV RNA 4) (Jobling, S. A. , and Gehrke, L. , Nature325:622-625 (1987));煙草花葉病毒前導(dǎo)序列(TMV) (Gallie, D. R. et al.，MolecularBiology of RNA, pages 237-256 (1989));以及玉米萎黃病斑點(diǎn)病毒前導(dǎo)序列(MCMV)(LommeI, S. A. et al. , Virology 81:382-385 (1991))。還參見(jiàn)Della-Cioppa et al. , PlantPhysiology 84:965-968(1987)。對(duì)于本發(fā)明有用的植物轉(zhuǎn)化方法可用于植物轉(zhuǎn)化的多種轉(zhuǎn)化載體對(duì)于植物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言是已知的，并且本發(fā)明的核酸分子可以與任何此類(lèi)載體結(jié)合使用。載體的選擇將取決于優(yōu)選的轉(zhuǎn)化技術(shù)以及用于轉(zhuǎn)化的目標(biāo)植物種類(lèi)。對(duì)于某些目標(biāo)種類(lèi)，可以?xún)?yōu)選不同的抗生素或除草劑選擇標(biāo)記。在轉(zhuǎn)化時(shí)常規(guī)使用的選擇標(biāo)記物包括nptll基因，它賦予了對(duì)卡那霉素及相關(guān)抗生素的抗性(Messing&Vierra. Gene 19:259-268 (1982) ; Bevan et al. , Nature304:184-187(1983)) ;bar基因，它賦予了對(duì)于除草劑草丁膦的抗性(White et al. , Nucl.Acids Res 18:1062(1990), Spencer et al. Theor. Appl.Genet 79:625-631 (1990))；hph基因，它賦予了對(duì)抗生素潮霉素的抗性(Blochinger & Diggelmann, Mol Cell Biol4:2929-2931);以及dhfr基因，它賦予了對(duì)于甲氨蝶呤的抗性(Bourouis et al. , EMBOJ. 2(7) :1099-1104(1983)) ;EPSPS基因，它賦予了對(duì)草甘膦的抗性(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，940, 935和5，188，642)；以及甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因，它提供了使甘露糖代謝的能力(美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 5，767，378 和 5，994，629)。適合于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的載體很多載體可供用于使用根瘤農(nóng)桿菌進(jìn)行的轉(zhuǎn)化。這些載體典型地?cái)y帯至少ー個(gè)T-DNA邊界序列，并且包括例如pBIN19 (Bevan, Nucl. Acids Res. (1984))。以下說(shuō)明了適合于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的ー種典型的載體的構(gòu)建。適合于非農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的載體
沒(méi)有使用根瘤農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化避免了在經(jīng)選擇的轉(zhuǎn)化載體中對(duì)于T-DNA序列的要求，并且因此除了諸如以上說(shuō)明包含T-DNA序列的載體以外，還可以利用缺乏這些序列的載體。不依賴(lài)農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化技術(shù)包括經(jīng)由粒子轟擊、原生質(zhì)體攝入(例如PEG和電穿孔)和顯微注射的轉(zhuǎn)化。載體的選擇很大程度上取決于對(duì)于正在轉(zhuǎn)化的種類(lèi)的優(yōu)先選擇。對(duì)于本發(fā)明有用的轉(zhuǎn)化方法本發(fā)明的ー種核酸分子一旦已經(jīng)被克隆到ー個(gè)表達(dá)盒中，則該分子即被轉(zhuǎn)化到一種植物細(xì)胞中。本發(fā)明的受體和目標(biāo)表達(dá)盒可以采用本領(lǐng)域公認(rèn)的多種方式引入到植物細(xì)胞中。用于植物再生的方法在本領(lǐng)域中也是熟知的。例如，Ti質(zhì)粒載體已用于遞送外來(lái)DNA、連同直接DNA攝取，脂質(zhì)體，電穿孔，顯微注射、以及微粒轟擊。此外，可以利用來(lái)自農(nóng)桿菌屬的細(xì)菌來(lái)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。以下是用于轉(zhuǎn)化雙子葉和單子葉植物的代表性技術(shù)連同一種代表性質(zhì)體(plastid)轉(zhuǎn)化技術(shù)的說(shuō)明。根據(jù)本發(fā)明所轉(zhuǎn)化的植物可以是單子葉或雙子葉植物，并且包括但不限于玉米、小麥、大麥、黒麥、甘薯、豆、豌豆、菊苣、萵苣、甘藍(lán)、花椰菜、西蘭花、蕪菁、蘿卜、菠菜、蘆筍、洋蔥、蒜、胡椒、芹菜、倭瓜、南瓜、大麻、西葫蘆、蘋(píng)果、梨、榲梓、甜瓜、李子、櫻桃、桃、蜜桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、菠蘿、鱷梨、番木瓜、芒果、香蕉、大豆、番U、高梁、甘鹿、甜菜、向日葵、油菜籽、三葉草、煙草、胡蘿卜、棉花、苜蓿、水稻、馬鈴薯、茄子、黃瓜、擬南芥以及木本植物，例如針葉樹(shù)和落葉樹(shù)，特別是玉米、小麥或水稻。ー種表達(dá)盒一旦已經(jīng)被轉(zhuǎn)化到ー種特定的植物物種中，使用傳統(tǒng)的育種技術(shù)可以將該表達(dá)盒在該物種中繁殖或?qū)⑵滢D(zhuǎn)移到相同物種的其它品種中，特別包括商業(yè)品種。雙子葉植物的轉(zhuǎn)化用于雙子葉植物的轉(zhuǎn)化技術(shù)在本領(lǐng)域也是熟知的，并且包括基于農(nóng)桿菌的技術(shù)以及基于非農(nóng)桿菌的技術(shù)這兩者。非農(nóng)桿菌技術(shù)涉及直接通過(guò)原生質(zhì)體或細(xì)胞來(lái)攝取外源基因材料。這可以通過(guò)粒子轟擊介導(dǎo)的遞送、顯微注射或PEG或電穿孔介導(dǎo)的攝入實(shí)現(xiàn)。Paszkowski et al. , EMBO J 3:2717-2722 (1984), Potrykus et al. , Mol. Gen.Genet.199:169-177(1985)，Reich et al. , Biotechnology 4:1001-1004(1986)，以及Klein et al. , Nature 327:70-73 (1987)說(shuō)明了這些技術(shù)的實(shí)例。在每種情況下，使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將這些轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生為完整的植物。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化是雙子葉植物轉(zhuǎn)化的ー種優(yōu)選技術(shù)，因?yàn)樗霓D(zhuǎn)化效率高并且它廣泛應(yīng)用于許多不同的種類(lèi)。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化典型地涉及將攜帯感興趣的外源DNA的ニ元載體(例如，PCIB200或pCIB2001)轉(zhuǎn)移到一個(gè)適當(dāng)?shù)霓r(nóng)桿菌菌株中，它可以依賴(lài)于由宿主農(nóng)桿菌菌株在ー個(gè)共駐留Ti質(zhì)粒上或在染色體上攜帯的vir基因的互補(bǔ)物(例如用于PCIB200 以及 pCIB2001 的 CIB542 菌株(Uknes et al. Plant Cell 5:159-169(1993))。該重組ニ元載體轉(zhuǎn)移到農(nóng)桿菌中是通過(guò)三親本雜交步驟實(shí)現(xiàn)的，該步驟使用了攜帯該重組ニ元載體的大腸桿菌、攜帶一種質(zhì)粒(例如PRK2013)并且能夠?qū)⒃撝亟Mニ元載體移動(dòng)到目標(biāo)農(nóng)桿菌菌株中的輔助大腸桿菌菌株?？商娲兀撝亟Mニ元載體可以通過(guò)DNA轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)移到農(nóng)桿菌中(H6fgen& ffillmitzer, Nucl. Acids Res. 16:9877(1988))。通過(guò)重組農(nóng)桿菌將目標(biāo)植物物種轉(zhuǎn)化通常涉及將該農(nóng)桿菌與來(lái)自該植物的外植體共培養(yǎng)，并且遵循本領(lǐng)域中熟知的科學(xué)試驗(yàn)計(jì)劃。將轉(zhuǎn)化的組織在選擇培養(yǎng)基上再生，這些培養(yǎng)基攜帯了存在于ニ元質(zhì)粒T-DNA邊界之間的抗生素或除草劑抗性標(biāo)記。另ー種用基因轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法涉及在植物組織和細(xì)胞上推入惰性粒子或生物學(xué)活性粒子。這種技術(shù)披露于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，945，050、5，036，006、以及5，100, 792 (均授予Sanford等人)。通常，該步驟涉及在細(xì)胞上、在有效穿透該細(xì)胞的外表面并提供摻入到其內(nèi)部中的條件下推入惰性粒子或生物學(xué)活性粒子。當(dāng)使用惰性粒子時(shí)，該載體可以通過(guò)用含有所希望的基因的載體包被這些粒子而引入到細(xì)胞中。可替代地，該載體可以圍繞著該目標(biāo)細(xì)胞，使得該載體通過(guò)該粒子的激發(fā)被帶入該細(xì)胞中。也可將生物學(xué)活性粒子(例如， 干酵母細(xì)胞、干細(xì)菌或噬菌體，各自均含有被試圖引入的DNA)推入到植物細(xì)胞組織中。單子葉植物的轉(zhuǎn)化多數(shù)單子葉植物種類(lèi)的轉(zhuǎn)化目前也已成為常規(guī)操作。優(yōu)選的技術(shù)包括使用PEG或電穿孔技術(shù)、經(jīng)由農(nóng)桿菌直接將基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入未成熟的胚胎、原生質(zhì)體，以及粒子轟擊進(jìn)入愈傷組織?？梢杂脝我?DNA種類(lèi)或多種DNA種類(lèi)(即，共轉(zhuǎn)化)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并且這兩種技術(shù)均適用于本發(fā)明。共轉(zhuǎn)化可能具有避免完全載體構(gòu)建、以及生成對(duì)于感興趣的基因與選擇標(biāo)記具有非伴性基因座的轉(zhuǎn)基因植物的優(yōu)點(diǎn)，使得能夠在隨后幾代中去除該選擇標(biāo)記(如果這被認(rèn)為是所希望的話)。然而，使用共轉(zhuǎn)化的ー個(gè)缺點(diǎn)是所分離的DNA種類(lèi)被整合到基因組中的頻率小于 100% (Schocher et al. Biotechnology 4:1093-1096(1986))。專(zhuān)利申請(qǐng)EP 0292435、EP 0392225、以及WO 93/07278說(shuō)明了用于從良種近交系玉米制備愈傷組織和原生質(zhì)體、使用PEG或電穿孔轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體、以及從已轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體再生玉米植物的技術(shù)。Gordon-Kamm等人(Plant Cell 2:603-618 (1990))和Fromm等人(Biotechnology 8:833-839 (1990))已經(jīng)公開(kāi)了使用粒子轟擊來(lái)轉(zhuǎn)化A188來(lái)源的玉米系的技術(shù)。此外，WO 93/07278 和 Koziel 等人(Biotechnology 11:194-200 (1993))說(shuō)明了通過(guò)粒子轟擊用于轉(zhuǎn)化良種近交系玉米的技木。這種技術(shù)利用了授粉后14天-15天從玉米穗切除的I. 5mm-2. 5mm長(zhǎng)的未成熟玉米胚，以及用于轟擊的F1DS-IOOOHe Biolistics裝置。水稻的轉(zhuǎn)化也可以利用原生質(zhì)體或粒子轟擊、通過(guò)直接基因轉(zhuǎn)移技術(shù)來(lái)進(jìn)行。原生質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化已經(jīng)對(duì)粳型水稻和秈型水稻進(jìn)行了說(shuō)明(Zhang et al. PlantCell Rep 7:379-384(1988);Shimamoto et al. Nature 338:274-277(1989);Datta etal. Biotechnology 8:736-740(1990))。使用粒子轟擊也可常規(guī)地轉(zhuǎn)化這兩種類(lèi)型(Christou et al. Biotechnology 9:957-962(1991))。此外，WO 93/21335 說(shuō)明了經(jīng)由電穿孔轉(zhuǎn)化水稻的技木。專(zhuān)利申請(qǐng)EP 0 332 581說(shuō)明了用于產(chǎn)生、轉(zhuǎn)化以及再生早熟禾亞科原生質(zhì)體的技木。這些技術(shù)允許轉(zhuǎn)化鴨茅屬植物和小麥。此外，小麥的轉(zhuǎn)化通過(guò)以下方式說(shuō)明如下Vasil等人(Biotechnology 10:667-674(1992))使用粒子轟擊進(jìn)入C型長(zhǎng)期可再生愈傷組織的細(xì)胞，以及 Vasil 等人(Biotechnology 11:1553-1558 (1993))和 Weeks 等人(PlantPhysiol. 102:1077-1084(1993))使用離子轟擊未成熟胚和未成熟胚來(lái)源的愈傷組織。用于小麥轉(zhuǎn)化的ー種技術(shù)涉及通過(guò)離子轟擊未成熟胚來(lái)轉(zhuǎn)化小麥，并且在基因送遞之前包括ー個(gè)高蔗糖步驟或高麥芽糖步驟。在轟擊之前，將長(zhǎng)度為0. 75mm-lmm的胚在MS培養(yǎng)基上進(jìn)行鋪板用于誘導(dǎo)體細(xì)胞胚，該培養(yǎng)基具有3%鹿糖(Murashiga & Skoog, PhysiologiaPlantarum 15:473-497 (1962))以及3mg/l 2，4-D，這ー步驟允許在黑暗中進(jìn)行。在選擇進(jìn)行轟擊的那天，將胚從誘導(dǎo)培養(yǎng)基中取出并且放置在滲壓劑上(即，以希望的濃度(典型地是15%)添加含有蔗糖或麥芽糖的誘導(dǎo)培養(yǎng)基)。允許這些胚質(zhì)壁分離2-3小吋，然后進(jìn)行轟擊。每個(gè)目標(biāo)板中二十個(gè)胚是典型的，盡管這不是關(guān)鍵性的。使用標(biāo)準(zhǔn)步驟將ー種適當(dāng)?shù)臄y帶基因的質(zhì)粒(如PCIB3064或pSG35)沉淀在微米大小的金顆粒上。使用約IOOOpsi的爆破壓力，使用標(biāo)準(zhǔn)的80目網(wǎng)篩，用D uPont Biolistics⑧氦裝置射擊每個(gè)板的胚。轟擊之后，將這些胚放回到黑暗中恢復(fù)約24小時(shí)(仍在滲壓劑上)。24小時(shí)后，將這些胚從滲壓劑上取出，并將其放回到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在再生之前將它們?cè)谠撆囵B(yǎng)基上放置約I個(gè)月。約ー個(gè)月之后，將開(kāi)始胚胎發(fā)生的愈傷組織的胚外植體轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基中(MS+lmg/升NAA、5mg/升GA)，該再生培養(yǎng)基進(jìn)ー步包含適當(dāng)?shù)倪x擇劑(在pCIB3064的情況下是10mg/l的basta,而在pS0G35的情況下是2mg/l的甲氨蝶呤)。約I個(gè)月之后，將發(fā)育的嫩枝轉(zhuǎn)移到更大的被稱(chēng)為“GA7”的滅菌容器中，這些容器包含半濃度的MS、2%的蔗糖、以及相同濃度的選擇劑。使用農(nóng)桿菌的單子葉植物的轉(zhuǎn)化還說(shuō)明于WO 94/00977以及美國(guó)專(zhuān)利號(hào)
5,591, 616中，這兩者均通過(guò)引用結(jié)合在此。一種優(yōu)選的玉米轉(zhuǎn)化方法說(shuō)明于Negrotto等人的文章中(Plant Cell Reports 19:798-803 (2000))，通過(guò)引用結(jié)合在此。啟動(dòng)子活力分析有ー些方法可供使用以便評(píng)估啟動(dòng)子的活力。如以上所述，構(gòu)建含有ー種可見(jiàn)標(biāo)記的表達(dá)盒。使用瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法評(píng)估啟動(dòng)子的活力。使用諸如微粒轟擊、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化或原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化等轉(zhuǎn)化方法，將表達(dá)盒遞送到植物細(xì)胞或組織。轉(zhuǎn)化后隨時(shí)間變化(例如，使用本領(lǐng)域內(nèi)熟知的方法在遞送DNA后2小時(shí)，5小時(shí)，8小時(shí)，16小時(shí)，24小時(shí)，36小時(shí)，48小時(shí)和72小吋)監(jiān)測(cè)報(bào)告基因活力，例如P -葡萄糖醛酸酶活力、熒光素酶活力或GFP熒光。通過(guò)酶活力、通過(guò)用由該報(bào)告基因編碼的酶的底物對(duì)細(xì)胞或組織染色、或通過(guò)在ー個(gè)合適光波長(zhǎng)下直接用肉眼觀測(cè)來(lái)監(jiān)測(cè)報(bào)告基因的活力?？梢詫?duì)全長(zhǎng)啟動(dòng)子序列、啟動(dòng)子序列的缺失或突變進(jìn)行測(cè)定，并且比較它們的表達(dá)水平。此外，使用本領(lǐng)域內(nèi)熟知的方法(例如RNA印跡法、競(jìng)爭(zhēng)性逆轉(zhuǎn)錄PCR以及RNA酶保護(hù)測(cè)定)來(lái)測(cè)量RNA的水平。這些測(cè)定通過(guò)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)的已轉(zhuǎn)錄報(bào)告mRNA的“穩(wěn)定態(tài)”濃度，測(cè)量了一個(gè)報(bào)告基因的表達(dá)水平。該測(cè)量是間接的，因?yàn)樵搱?bào)告mRNA的濃度不僅依賴(lài)于其合成率，還依賴(lài)于該mRNA的降解率。所以，這種穩(wěn)定態(tài)水平是合成率和降解率的產(chǎn)物。然而，當(dāng)這些轉(zhuǎn)錄的序列一致時(shí)，該降解率可以被認(rèn)為是以ー個(gè)固定速率進(jìn)行的，并且因此這數(shù)值可以用作合成率的ー個(gè)測(cè)量值。啟動(dòng)子活力的進(jìn)ー步確定是通過(guò)將ー個(gè)表達(dá)盒中的啟動(dòng)子穩(wěn)定轉(zhuǎn)化到如以上所述的ー種植物而獲得的，該表達(dá)盒包括一種可見(jiàn)標(biāo)記或感興趣的基因。使用以上說(shuō)明的各種方法例如酶活力測(cè)定、RNA分析以及如之前所說(shuō)明的蛋白質(zhì)測(cè)定，啟動(dòng)子的活力可隨發(fā)育進(jìn)行監(jiān)測(cè)，并且額外地通過(guò)監(jiān)測(cè)初代轉(zhuǎn)化物的不同組織中的表達(dá)以及通過(guò)轉(zhuǎn)基因植物的后代來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。
實(shí)例本發(fā)明將通過(guò)參考以下具體實(shí)例進(jìn)ー步說(shuō)明。這些實(shí)例僅僅作為說(shuō)明性的目的而提供，并且并非g在進(jìn)行限制，除非另外說(shuō)明。在此所使用的標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA以及分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域所熟知的，并且由Ausubel編輯，《現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)方案》，約翰威立公司(John Wiley and Sons, Inc. ) (1994) ;J. Sambrook等人，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè) 》(第三版，冷泉港，紐約冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，普萊恩維爾，紐約)(2001) ;WlT.J.Silhavy，M.L. Berman 以及 L. W. Enquist《基因融合實(shí)驗(yàn)》(Experiments with Gene Fusions)冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約(1984)進(jìn)行了說(shuō)明。實(shí)例I :根冠特異性表達(dá)盒的構(gòu)建入門(mén)載體表達(dá)盒構(gòu)建的第一歩驟是將該啟動(dòng)子克隆進(jìn)入ー種入門(mén)載體。設(shè)計(jì)PCR引物，以 便將來(lái)自玉米株系B73的啟動(dòng)子和終止子擴(kuò)增。將這些分離的核酸序列進(jìn)行T0P0克隆并測(cè)序。將與該序列對(duì)應(yīng)的啟動(dòng)子命名為玉米根冠特異性I啟動(dòng)子或ZmRCPl-I啟動(dòng)子。將與該序列對(duì)應(yīng)的終止子命名為玉米根冠特異性I終止子或ZmRCPl-終止子。將ZmRCPl-I啟動(dòng)子在50 ii L Extensor (AB基因公司)DNA聚合酶反應(yīng)中以玉米基因組DNA(B73)為模板擴(kuò)增，該反應(yīng)包含IOii g gDNA、5iiL 10X Extensor緩沖液I、2. 0 y LIOmM dNTP混合物、I. Oii L的20iiM prRCP正向-SEQ ID N0:9(5' GCTAGCCTCGAGGGACCCAACMTTTGCCACAAACTGG-3' )，I. 0 y L 的 20 y M RCP P2 反向-SEQ ID NO :10(5' -GCTAGCGGATCCGGCGCCGCCGGGATAGMGTCGCACAC-3' ), 10. 0 u L 5x Q 溶液以及 I ii L Extensor DNA 聚合酶。該熱循環(huán)程序是95°C持續(xù)2分鐘，隨后是40個(gè)循環(huán)的95°C持續(xù)30秒、50V持續(xù)60秒、以及68°C持續(xù)5分鐘。最后的延伸步驟是68°C持續(xù)15分鐘。將I. 5kb反應(yīng)產(chǎn)物在1%TBE瓊脂糖上凝膠純化，并且使用Qiapr印DNA提取方法提取DNA。將DNA克隆到pCR4-Blunt_T0P0載體中。ZmRCPl-I啟動(dòng)子在一系列QuikChange反應(yīng)中進(jìn)行修飾，以便將STOP密碼子添加到開(kāi)放閱讀框(ORF)中并且修正在使用斯崔塔基因公司的QuikChange多位點(diǎn)突變?cè)噭┖羞M(jìn)行擴(kuò)增時(shí)所產(chǎn)生的點(diǎn)突變。25 ii L反應(yīng)包含IiiL pCR4-Blunt-T0P0-prZmRCP、2. 5u L IOXQuikChange 緩沖液、I u L QuikChange dNTP 混合物、0. 75 u L Quik 溶液、I u LQuikChange DNA聚合酶以及I ii L的20 y M以下寡核苷酸中的至少ー項(xiàng)SEQ ID N0:13prRCP mutl(5' -GCGGCGGCGGCGTAGTTGCAACCCGCATC-3')，SEQ ID N0:14prRCP mut2(5/ -GCAGTGTGCGACTTGAATCCCGGCGGCGCC-3')，SEQ ID N0:15prRCP mut3(5/ -CTACTCCATGCTAAAGCTGTAGAGCCGAG-3')，SEQ ID N0:16prRCP mut4(5/ -CCTTTATCAATTTGCCTCGATCTCCATAG-3')，SEQ ID N0:17prRCP mut5(5/ -GAAACTTGTTTGTTGTTATTAATTTTCAAC-3')，以及SEQ ID N0:18prRCP mut6(5/ -GCACCAACATCAAGAGCAACAAGACCACC-3')。該熱循環(huán)程序是95°C持續(xù)I分鐘，隨后是35個(gè)循環(huán)的95°C持續(xù)I分鐘、55°C持續(xù)I分鐘以及65°C持續(xù)15分鐘。將產(chǎn)物按照制造商(斯崔塔基因公司)的說(shuō)明進(jìn)行處理，并且進(jìn)行全測(cè)序?？梢詫⑿拚^(guò)的ZmRCPl-I啟動(dòng)子通過(guò)XhoI/BamHI從T0P0載體切除，并且連接到類(lèi)似切 ロ PN0V6901 (SEQ ID NO: 5)。
ZmRCP終止子在50 ii L Expand (羅氏公司)DNA聚合酶反應(yīng)中以玉米基因組DNA(B73)為模板進(jìn)行擴(kuò)增，該反應(yīng)包含IOiig gDNA、5iiL IOX含有MgCl2的Expand HighFidelity 緩沖液、LOyL IOmM dNTP 混合物、2. 0 y I 的 2%DMS0、2. 0 y L 的 20 y tRCP 正向-SEQ ID NO:19(5' -GCGCCCGCGGCGCCATAACAAAGGACACGTCGTACGC-3' )，2. 0 y L 的 20 y MtRCP 反向-SEQ ID NO :20(5' -GCGCCCCGGGCGGTCCGCTAAAAAAAACTGTTTTCTCTTGTTG-3')，以IiiL Expand DNA聚合酶。將礦物油覆蓋在這些反應(yīng)上，并且該熱循環(huán)程序是95°C持續(xù)5分鐘，隨后是12個(gè)循環(huán)的95°C持續(xù)30秒、66°C至60°C (每個(gè)循環(huán)降0. 5°C )持續(xù)I分鐘以及70°C持續(xù)2. 5分鐘，隨后是25個(gè)循環(huán)的95°C持續(xù)30秒、60°C持續(xù)30秒以及70°C持續(xù)
2.5分鐘。最后的延伸步驟是70°C持續(xù)7分鐘。將500kb反應(yīng)產(chǎn)物在1%TBE瓊脂糖上凝膠純化，并且使用Qiapr印DNA提取法提取DNA。將DNA克隆入pCR-Bluntll-TOPO載體中，并且完整測(cè)序。目的載體
將ZmRCP末端從TOPO載體上切除(SacII/Xmal)，并且連接到類(lèi)似切ロ pN0V6901載體(SEQ ID N0:5)o所產(chǎn)生的這種pSYN15861包含ー個(gè)ZmRCP-GUS組裝。核苷酸序列PSYN15861表示為SEQ ID NO :7。將完整的ZmRCP-GUS表達(dá)盒移動(dòng)到ニ元載體pSYN15605(SEQ ID N0:6)中，該載體已被RsrII消化，隨后作為SanDI/RsrII片段用小牛堿性磷酸酶進(jìn)行處理。構(gòu)建體PSYN15888包含ー個(gè)prZmRCP-GUS-prUBIl-PMI。pSYN15888的核苷酸序列表示為SEQ ID NO :8。實(shí)例2 :根冠特異性表達(dá)盒的構(gòu)建入門(mén)載體表達(dá)盒構(gòu)建的第一歩驟是將該啟動(dòng)子克隆到ー種入門(mén)載體中。設(shè)計(jì)PCR引物，以便擴(kuò)增來(lái)自玉米株系B73的啟動(dòng)子。將這些分離的核酸序列進(jìn)行TOPO克隆并測(cè)序。將與該序列對(duì)應(yīng)的啟動(dòng)子命名為玉米根冠特異性1-2啟動(dòng)子或ZmRCPl-2啟動(dòng)子。該載體是PCR4-Topo，它含有一個(gè)假定的玉米根冠特異性啟動(dòng)子prZmRCPI_2。prZmRCPl-2是由玉米B73的基因組DNA通過(guò)PCR擴(kuò)增而得，使用引物AG971f_SEQ ID NO: Il(CTCGAGGGACCCAACAATTTGCCACAAACTGG)以及AG972r_SEQ ID NO: 12 (GGATCCTGTAGACTGCTCTGGCTTAA)，然后被克隆到PCR4-Topo中并進(jìn)行測(cè)序。所產(chǎn)生的載體是pSYN15670 (SEQ IDN0:21)。實(shí)例3 由根特異性啟動(dòng)子指導(dǎo)的在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的玉米中的GUS的表達(dá)用一種農(nóng)桿菌載體對(duì)玉米植物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，該載體包括本發(fā)明的ZmRCPl啟動(dòng)子和終止子，它可以操作地連接到GUS編碼序列。該農(nóng)桿菌載體進(jìn)ー步包括泛素啟動(dòng)子以及NOS終止子，它可以操作地連接到PMI (磷酸甘露糖異構(gòu)酶)編碼序列。通過(guò)視覺(jué)測(cè)定來(lái)測(cè)量穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的玉米中的GUS活力。GUS活力的特征為高(+++)、中(++)、低( + )、或無(wú)(-)，并且將每個(gè)啟動(dòng)子構(gòu)建體的25株低拷貝轉(zhuǎn)基因玉米植物的數(shù)據(jù)進(jìn)行平均。表I中顯示的結(jié)果證明，轉(zhuǎn)基因植物中的⑶S活力被特異性地限定于根部，這些轉(zhuǎn)基因植物包括ー種表達(dá)盒，該表達(dá)盒包括本發(fā)明的一種啟動(dòng)子。這種表達(dá)被進(jìn)一步定義為隔離到根冠。表I.從轉(zhuǎn)基因(TO)玉米植物切去的組織中的總結(jié)性的⑶S表達(dá)
權(quán)利要求
1.一種能夠在植物細(xì)胞中指導(dǎo)表達(dá)的分離的核酸分子，其中所述核酸分子包括一種在SEQ ID NO: I中給出的啟動(dòng)子。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分離的核酸分子，其中所述啟動(dòng)子能夠促進(jìn)一個(gè)可操作地連接的核苷酸序列的根冠特異性表達(dá)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分離的核酸分子，其中所述核酸分子從一個(gè)目標(biāo)植物物種的根組織中分離。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離的核酸分子，其中所述目標(biāo)植物物種是玉米。
5.一個(gè)表達(dá)盒，在序列方面包括如權(quán)利要求I所述的可操作地連接至一個(gè)異源編碼序列的核酸分子，該核酸分子可操作地連接至一個(gè)3’ -非翻譯區(qū)域，該區(qū)域包括一個(gè)聚腺苷酸信號(hào)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達(dá)盒，其中所述異源編碼序列是選自下組，該構(gòu)成為殺蟲(chóng)編碼序列、殺線蟲(chóng)編碼序列、除草劑耐受編碼序列、抗微生物編碼序列、抗真菌編碼序列、抗病毒編碼序列、非生物脅迫耐受編碼序列、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)編碼序列、可見(jiàn)標(biāo)記編碼序列以及選擇標(biāo)記編碼序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達(dá)盒，其中所述殺蟲(chóng)編碼序列編碼一種有效抵抗鞘翅目害蟲(chóng)的毒素。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的表達(dá)盒，其中所述鞘翅目害蟲(chóng)是根螢葉甲屬的一個(gè)物種。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體，其中所述可見(jiàn)標(biāo)記是β-葡萄糖醛酸酶。
10.一個(gè)重組載體，包括如權(quán)利要求6所述的表達(dá)盒。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的重組載體，其中所述載體是一種質(zhì)粒。
12.—種轉(zhuǎn)基因的非人類(lèi)宿主細(xì)胞，包括如權(quán)利要求6所述的表達(dá)盒。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的轉(zhuǎn)基因的非人類(lèi)宿主細(xì)胞，它是一種轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。
14.一種轉(zhuǎn)基因植物，包括如權(quán)利要求13所述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是選自下組，其構(gòu)成為高粱、小麥、向日葵、番茄、甘藍(lán)類(lèi)蔬菜、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、煙草、大麥、油菜以及玉米。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是一種玉米植物。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是一種水稻植物。
18.來(lái)自如權(quán)利要求15所述的轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因種子。
19.來(lái)自如權(quán)利要求16所述的玉米植物的轉(zhuǎn)基因種子。
20.來(lái)自如權(quán)利要求17所述的水稻植物的轉(zhuǎn)基因種子。
21.在轉(zhuǎn)基因植物根中特異性地表達(dá)一個(gè)異源編碼序列的一種方法，包括 (a)將帶有一種載體的植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化,其中所述載體包括如權(quán)利要求5所述的表達(dá)盒。
(b)使轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞生長(zhǎng)，這些細(xì)胞包括所述表達(dá)盒，并且 (c)從所述已轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物，其中該異源編碼序列在所述核酸分子的控制下特異性地表達(dá)于植物的根部。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中這些轉(zhuǎn)基因植物根是玉米根或水稻根。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述異源編碼序列是選自下組，其構(gòu)成為殺蟲(chóng)編碼序列、殺線蟲(chóng)編碼序列、除草劑耐受編碼序列、抗微生物編碼序列、抗真菌編碼序列、抗病毒編碼序列、非生物脅迫耐受編碼序列、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)編碼序列、可見(jiàn)標(biāo)記編碼序列以及選擇標(biāo)記編碼序列。
24.根據(jù)權(quán)利要求21所述方法所生產(chǎn)的一種轉(zhuǎn)基因植物。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是一種單子葉植物。
26.如權(quán)利要求25所述的植物，其中所述單子葉植物是玉米。
27.如權(quán)利要求25所述的植物，其中所述單子葉植物是水稻。
全文摘要
本發(fā)明針對(duì)一種從玉米中分離的啟動(dòng)子。本發(fā)明的啟動(dòng)子在促進(jìn)異源基因的根偏好性表達(dá)、特別是根冠表達(dá)方面具有特定用途，這些異源基因給予一種給定的轉(zhuǎn)基因植物增強(qiáng)的農(nóng)藝的、園藝的和/或殺蟲(chóng)的性狀。本發(fā)明還涉及包括本發(fā)明的啟動(dòng)子的DNA分子，以及包含DNA分子的已轉(zhuǎn)化的植物組織，這些DNA分子包括本發(fā)明的可操作地連接至一個(gè)或多個(gè)異源基因的啟動(dòng)子，以及這些植物組織的種子。
文檔編號(hào)C12P21/06GK102656178SQ201080056937
公開(kāi)日2012年9月5日 申請(qǐng)日期2010年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月17日
發(fā)明者A·T·里克蒙德, T·朱, V·C·克拉默 申請(qǐng)人:先正達(dá)參股股份有限公司