專利名稱：一種來源于人肺腺癌的細(xì)胞株及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人肺癌細(xì)胞株及其制備方法，尤其是一種來源于人肺腺癌的細(xì)胞株及其制備方法。
背景技術(shù)：
腫瘤是嚴(yán)重危害人類健康的主要疾病之一，世界衛(wèi)生組織發(fā)表的一項研究報告表明，全球癌癥狀況將日益嚴(yán)重，因此，深入研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的分子機制，尋找更為有效的腫瘤治療方案，成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)研究的前沿課題。隨著腫瘤生物學(xué)研究的不斷深入，腫瘤的早期診斷及預(yù)防水平有了較大的提高，但是腫瘤治療后的高轉(zhuǎn)移及高復(fù)發(fā)仍是腫瘤臨床治療中一個亟待解決的難題。近年來，“腫瘤干細(xì)胞”學(xué)說的提出及其研究進展，從一個全新的角度去認(rèn)識腫瘤。該學(xué)說認(rèn)為，腫瘤中存在一部分獨特的具有自我更新和分化功能的干細(xì)胞樣亞群并將之稱為腫瘤干細(xì)胞，這一亞群細(xì)胞正是腫瘤的起源細(xì)胞并維持腫瘤的生長。因此，腫瘤細(xì)胞株是研究細(xì)胞癌變機理、腫瘤轉(zhuǎn)移、腫瘤放療和化療敏感性分子基礎(chǔ)等生物醫(yī)學(xué)問題的重要材料，建立和鑒定不同的腫瘤細(xì)胞株是一項很有意義的工作。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種來源于人肺腺癌的細(xì)胞株，所述細(xì)胞株具有典型的腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性；同時，還提供一種所述細(xì)胞株的制備方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為一種來源于人肺腺癌的細(xì)胞株，命名為人肺癌細(xì)胞株0907，保藏號為CCTCC NO :C201031。所述細(xì)胞株在倒置光學(xué)相差顯微鏡下觀察，可見細(xì)胞體積大，核大，胞漿豐富，細(xì)胞間連接緊密，與平皿之間貼附生長。所述細(xì)胞株的體外倍增時間為60. 32證。所述細(xì)胞株的蛋白表達特征為VEGF表達陽性。0907的免疫組織化學(xué)染色顯示其與來源的轉(zhuǎn)移灶腫瘤組織有著相似的蛋白表達，其突出的表達特征為VEGF陽性表達。這是一個血管內(nèi)皮生長因子，其陽性表達對腫瘤血管的形成和腫瘤生長有著明顯的促進作用， 0907可以用來作為一個研究以VEGF作為靶標(biāo)的靶向藥物研究的有力的工具細(xì)胞。人肺癌細(xì)胞株0907是一株中國南方人肺腺癌細(xì)胞系，來源于一位60歲男性肺癌病人的左上肺癌病灶。病人在接受手術(shù)前未接受任何化療，放療及靶向治療等治療。所述來源于人肺腺癌的細(xì)胞株，是從病理類型為未分化癌的肺癌病人肺部腫塊切除物中培養(yǎng)所得，經(jīng)病理鑒定為肺未分化癌，為多邊形上皮細(xì)胞，具有典型的腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性，它能在體外連續(xù)長期傳代，在體外制備一年，傳100多代，細(xì)胞仍然生長增殖活躍。一種來源于人肺腺癌的細(xì)胞株的制備方法，包括以下步驟(1)組織塊機械解離將切除的人肺腺癌組織解離，清洗去除雜質(zhì)，分離肺癌實質(zhì)組織，去除正常肺泡及支氣管組織和間質(zhì)組織后，得到剩余的組織；(2)膠原酶消化將步驟(1)得到的剩余的組織切成組織片，清洗，然后向組織片加入膠原酶，孵育，過濾，然后收集腫瘤細(xì)胞，進行接種培養(yǎng)，得到存活細(xì)胞；(3)對步驟( 得到的存活細(xì)胞進行純化，去除纖維細(xì)胞等雜質(zhì)，純化后的肺癌細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)并傳代大于12個月，即得細(xì)胞株。作為本發(fā)明所述制備方法的優(yōu)選實施方式，所述制備方法包括以下步驟(1)組織塊機械解離將切除的人肺腺癌組織解離，清洗去除粘液和紅細(xì)胞等雜質(zhì)，分離肺癌實質(zhì)組織，去除正常肺泡及支氣管組織和間質(zhì)組織后，得到剩余的組織；(2)膠原酶消化將步驟(1)得到的剩余的組織切成Imm3的組織片，清洗組織片， 讓組織片沉淀，去除上清液，把剩余組織再細(xì)切，清洗組織碎片，然后向組織片加入膠原酶， 在37°C下孵育4-18小時；過濾，然后收集腫瘤細(xì)胞，在含20%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞，進行接種培養(yǎng)，得到存活細(xì)胞；(3)對步驟( 得到的存活細(xì)胞進行純化，去除纖維細(xì)胞等雜質(zhì)，純化后的肺癌細(xì)胞在含20%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)并傳代大于12個月，即得細(xì)胞株。作為本發(fā)明所述制備方法的優(yōu)選實施方式，所述步驟(1)為將切除的人肺腺癌組織解離成0. 5cm3，用100%的青-鏈霉素雙抗溶液浸泡移至生物安全柜，用消毒的PBS緩沖液反復(fù)清洗組織去除粘液和紅細(xì)胞等雜質(zhì)，再浸泡于培養(yǎng)基中移至解剖顯微鏡下，用兩個10號注射器針頭分離肺癌實質(zhì)組織，并去除正常肺泡及支氣管組織和間質(zhì)組織后，得到剩余的組織。作為本發(fā)明所述制備方法的優(yōu)選實施方式，步驟O)為使用無菌的解剖刀和剪子把步驟(1)得到的剩余的組織切成Imm3的組織片，用PBS緩沖液清洗組織片，讓組織片沉淀，去除上清液，用無菌解剖刀和剪子把剩余組織再細(xì)切，用PBS清洗組織碎片數(shù)次，然后加入膠原酶(50-200單位/ml，溶解在PBS中)，在37°C下孵育4_18小時，通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，然后收集腫瘤細(xì)胞，在含20%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞，進行接種培養(yǎng)，得到存活細(xì)胞。更優(yōu)選地，步驟( 中，加入膠原酶的同時還加入有3mM的CaCl2。加入CaCl2可提高膠原酶對組織的解離效率。作為本發(fā)明所述制備方法的優(yōu)選實施方式，步驟(3)中純化后的肺癌細(xì)胞的培養(yǎng)溫度為37°C，氣體環(huán)境為5% C02/95%空氣，濕度為飽和濕度，每3天更換一次培養(yǎng)液，每5 天傳代一次。


圖1為本發(fā)明所述細(xì)胞株倒置光學(xué)相差顯微鏡GOO倍放大)下生長的活細(xì)胞像；圖2為本發(fā)明所述細(xì)胞株種植在NOD-SCID鼠肩胛部皮下移植瘤組織的形態(tài)圖。
具體實施例方式為更好的說明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點，下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步描述。實施例1本發(fā)明一種來源于人肺腺癌的細(xì)胞株，按照以下制備方法所得(1)組織塊機械解離將手術(shù)切除的肺癌組織以消毒小剪刀迅速解離到0. 5cm3大小，用100%青-鏈霉素雙抗溶液浸泡移至生物安全柜，消毒PBS緩沖液反復(fù)清洗組織去除粘液和紅細(xì)胞等雜質(zhì)，再浸泡于培養(yǎng)基中移至解剖顯微鏡下，用兩個10號注射器針頭細(xì)心分離肺癌實質(zhì)組織，盡量去除正常肺泡及支氣管組織和間質(zhì)組織后，得到剩余的組織；(2)膠原酶消化在解剖顯微鏡下去除肺癌標(biāo)本中的間質(zhì)組織后，使用無菌的解剖刀和剪子把步驟(1)所得的剩余的組織切成Imm3組織片，用PBS緩沖液清洗組織片。讓組織片沉淀，去除上清液，用無菌解剖刀和剪子把剩余組織再細(xì)切，用PBS清洗組織碎片數(shù)次，然后加入膠原酶(50-200單位/ml，溶解在PBS中)，在37°C孵育4_18小時后。在膠乳膠原酶的同時可加入3mM CaCl2,以提高膠原酶對組織的解離效率。通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，以分離分散細(xì)胞、組織碎片和較大的碎片；對較大的組織碎片可以加入新鮮的膠原酶進行進一步的解離。消化完全后，收集腫瘤細(xì)胞，在含20%胎牛血清的高糖 DMEM培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞，進行接種培養(yǎng)，得到存活細(xì)胞；(3)對步驟( 所得存活細(xì)胞進行純化，去除纖維細(xì)胞等雜質(zhì)細(xì)胞，純化后的肺癌細(xì)胞在含20%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C，氣體環(huán)境為5% C02/95%空氣，濕度為飽和濕度，每3天更換一次培養(yǎng)液，每5天傳代一次，連續(xù)培養(yǎng)并傳代超過12個月，得細(xì)胞株0907。0907是一株中國南方人肺腺癌細(xì)胞系，來源于一位60歲男性肺癌病人的左上肺癌病灶。病人在接受手術(shù)前未接受任何化療，放療及靶向治療等治療。所述步驟(3)中得到的細(xì)胞株，于2010年4月1日送達中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC NO :C201031，命名為人肺癌細(xì)胞株0907。實施例2本發(fā)明所述人肺癌細(xì)胞株0907的檢測鑒定UG6PD同工酶檢測物種來源(由中國典型制備物保藏中心檢測)。本發(fā)明所述人肺癌細(xì)胞株0907是一株中國南方人肺腺癌細(xì)胞系，來源于一位60 歲男性肺癌病人的左上肺癌病灶。病人在接受手術(shù)前未接受任何化療，放療及靶向治療等治療。2、形態(tài)觀察主要觀察細(xì)胞的一般形態(tài)，如大體形態(tài)、核漿比例、染色質(zhì)和核仁大小、多少等，以及細(xì)胞骨架微絲微管的排列狀態(tài)等。2. 1倒置光學(xué)顯微鏡觀察主要在正常生長狀態(tài)下觀察細(xì)胞的一般形態(tài)，如大體形態(tài)、核漿比例、粘附特性寸。倒置光學(xué)相差顯微鏡下觀察本發(fā)明所述人肺癌細(xì)胞株0907，可見細(xì)胞體積大，核大，胞漿豐富，細(xì)胞間連接緊密，與平皿之間貼附生長。如圖1所示。2. 2免疫組化檢測細(xì)胞標(biāo)記蛋白采用S-P法進行免疫組化染色，免疫組化染色S-P試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。所用的抗體為CK7、TTF-I、vimentin、EGFR、VEGF和NSE。具體步驟為(1)待檢測細(xì)胞株提前M小時爬片于消毒載玻片上，24小時后，用PBS緩沖液沖洗2次，冷丙酮固定15分鐘，浸泡于PBS中備用；(2)取所需玻片加1滴或50 μ 1過氧化物酶阻斷溶液(試劑Α)室溫下孵育10分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性；PBS沖洗三次，每次3分鐘；(3)除去PBS液，每張切片加1滴或50 μ 1正常非免疫動物血清(試劑B)，室溫下孵育10分鐘；(4)除去血清，每張切片加1滴或50 μ 1的第一抗體，室溫下孵育60分鐘；(5) PBS沖洗三次，每次3-5分鐘；除去PBS液，每張切片加一滴或50 μ 1生物素標(biāo)記的第二抗體(試劑C)，室溫下孵育10分鐘；PBS沖洗三次，每次3分鐘；(6)除去PBS液，每張切片加1滴或50 μ 1鏈霉菌抗生物素過氧化酶溶液(試劑 D)，室溫下孵育10分鐘；PBS沖洗三次，每次3分鐘；(7)除去PBS液，每張切片加2滴或100 μ 1新鮮配制的DAB或AEC溶液，顯微鏡下觀察3-10分鐘；(8)自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，PBS或自來水沖洗返藍；(9)DAB顯色，切片經(jīng)過梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。免疫組化檢測結(jié)果判斷方法按細(xì)胞著色評分棕褐色3分；棕黃色2分；淡黃色 1分；無著色0分。同樣物鏡下計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，按陽性細(xì)胞的數(shù)量評分一個視野內(nèi)著色細(xì)胞> 70%為4分；51% -75%為3分；11% -50%為2分；-10%為1分；陰性為0分。 兩項得分相乘，滿3分為“ + ” ；4分為“++” ；5分以上為“+++”。“+ +++”為陽性表達。本發(fā)明所述人肺癌細(xì)胞株0907的免疫組織化學(xué)染色顯示，其與來源的轉(zhuǎn)移灶腫瘤組織有著相似的蛋白表達，其突出的表達特征為VEGF陽性表達。這是一個血管內(nèi)皮生長因子，其陽性表達對腫瘤血管的形成和腫瘤生長有著明顯的促進作用，0907可以用來作為一個研究以VEGF作為靶標(biāo)的靶向藥物研究的有力的工具細(xì)胞。3、細(xì)胞生長增殖檢測細(xì)胞生長曲線、細(xì)胞分裂指數(shù)、倍增時間、細(xì)胞周期時間。3. IMTT法測定細(xì)胞生長增殖和對藥物的敏感性(1)取96孔細(xì)胞制備板，每孔中加0. Iml含2 X IO4 10 X IO4靶細(xì)胞的制備液(含 10%小牛血清的DMEM制備液)，在37°C 5% C02的飽和水汽二氧化碳制備箱中制備2_3小時，讓細(xì)胞貼壁；(2)用DMEM制備液0. 1 100倍遞次配置藥物，每孔加0. Iml稀釋的藥物和待檢細(xì)胞，每個稀釋度3個重復(fù)孔。對照孔9個3個陽性對照孔，每孔加0. Iml含1000倍藥物的DMEM制備液和細(xì)胞，3個陰性對照孔，每孔加不含藥物的0. Iml DMEM制備液和細(xì)胞，3個空白對照孔，每孔加0. Iml DMEM制備液，不加細(xì)胞。在37°C 5% CO2的飽和水汽二氧化碳制備箱中制備M 48小時或預(yù)定的時間；(3)吸去制備液，用PBS洗滌一次(如為懸浮細(xì)胞，應(yīng)在吸去上清液前離心制備板)；(4)每孔加0. Iml PBS和10 μ 1 MTT染液，在37°C 5% CO2的飽和水汽二氧化碳制備箱中制備4 6小時；(5)每孔加0. Iml酸化異丙醇，也可用含10% SDS的lOmmol/L HCl代替酸化異丙醇，在振蕩器上振蕩混勻，讓還原產(chǎn)物充分溶解。置酶聯(lián)檢測儀上測定光密度(OD)值，檢測波長570nm，參考波長630nm。以O(shè)D值對樣品稀釋度作圖，比較標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測樣品曲線即可求得待測樣品中細(xì)胞因子的含量。
3. 2細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期與凋亡流式細(xì)胞儀是美國BECKMAN_COULTER(貝克曼-庫爾特)公司生產(chǎn)。機器型號 ELITE，激光波長488nm，功率15麗。取IO6已固定的細(xì)胞，用PBS洗兩遍，去上清后加入 300 μ 1 DNA染液(內(nèi)含碘化丙啶100 μ g/ml和RNase 20單位/ml)，室溫30min。上機激光管預(yù)熱30min后用熒光微球(美國BECKMAN-COULTER公司)調(diào)整儀器，使各放大器接收的信號的HCV值< 2%，收集12000個細(xì)胞，DNA周期分析用美國ΡΗΕ0ΝΙΧ公司的MULTYCYCLE 軟件，最后計算出細(xì)胞各期的百分?jǐn)?shù)。另外，細(xì)胞凋亡是用儀器自帶軟件處理，直接得出細(xì)胞的凋亡率。本發(fā)明所述人肺癌細(xì)胞株09070907的體外倍增時間為60. 32 ！。5、異體動物接種向異體動物體內(nèi)接種細(xì)胞懸液，觀察成瘤能力。采用皮下注射的方法，注射時用左手拇指及食指輕輕捏起皮膚，右手持注射器將針頭刺入，固定后在小鼠背部或前肢腋下進行注射。IO6個本發(fā)明所述人肺癌細(xì)胞0907種植在5只4周齡的NOD-SCID鼠肩胛部皮下， 第3周種植部位均出現(xiàn)直徑約2mm的移植瘤，2個月后瘤體增大到1. 2cm,麻醉后處死動物， 移植瘤組織經(jīng)包埋切片HE染色形態(tài)如圖2所示，細(xì)胞體積大，核大，核仁明顯，與來源的病人組織相似。最后所應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。
權(quán)利要求
1.一種來源于人肺腺癌的細(xì)胞株，其特征在于，命名為人肺癌細(xì)胞株0907，保藏號為 CCTCC NO :C201031。
2.如權(quán)利要求1所述的來源于人肺腺癌的細(xì)胞株，其特征在于，所述細(xì)胞株在倒置光學(xué)相差顯微鏡下觀察，可見細(xì)胞體積大，核大，胞漿豐富，細(xì)胞間連接緊密，與平皿之間貼附生長。
3.如權(quán)利要求1所述的來源于人肺腺癌的細(xì)胞株，其特征在于，所述細(xì)胞株的體外倍增時間為60. 325h0
4.如權(quán)利要求1所述的來源于人肺腺癌的細(xì)胞株，其特征在于，所述細(xì)胞株的蛋白表達特征為VEGF表達陽性。
5.一種來源于人肺腺癌的細(xì)胞株的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)組織塊機械解離將切除的人肺腺癌組織解離，清洗去除雜質(zhì)，分離肺癌實質(zhì)組織，去除正常肺泡及支氣管組織和間質(zhì)組織后，得到剩余的組織；(2)膠原酶消化將步驟(1)得到的剩余的組織切成組織片，清洗，然后向組織片加入膠原酶，孵育，過濾，然后收集腫瘤細(xì)胞，進行接種培養(yǎng)，得到存活細(xì)胞；(3)對步驟( 得到的存活細(xì)胞進行純化，去除纖維細(xì)胞等雜質(zhì)，純化后的肺癌細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)并傳代大于12個月，即得細(xì)胞株。
全文摘要
本發(fā)明公開一種來源于人肺腺癌的細(xì)胞株，所述細(xì)胞株命名為人肺癌細(xì)胞株0907，保藏號為CCTCC NOC201031。同時，本發(fā)明還公開了所述細(xì)胞株的制備方法。
文檔編號C12N5/09GK102424817SQ20111046108
公開日2012年4月25日 申請日期2011年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月31日
發(fā)明者何建行, 李慧靈, 黃麗燕, 黃 俊 申請人:何建行, 廣州呼吸疾病研究所, 李慧靈