專利名稱：豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞體外培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞(Skeletal Muscle Satellite Cell, SMSC)體外培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞(Skeletal Muscle Satellite Cell, SMSC)體外培養(yǎng)，目前主要 在小鼠、大鼠、兔等上進(jìn)行。豬在解剖結(jié)構(gòu)，器官大小和生命周期與人類高度相似，是最接近 人類的模式動(dòng)物，對(duì)其研究越來(lái)越受到廣大學(xué)者的青睞。豬SMSC分離培養(yǎng)方法多采用胰 酶、膠原酶分步或者鏈酶蛋白酶一步消化，這些方法分離培養(yǎng)的SMSC主要是增殖能力低下 的成肌細(xì)胞和非成肌細(xì)胞(成纖維細(xì)胞)，純度低，不能滿足SMSC介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，阻礙了 對(duì)肌肉組織再生和發(fā)育機(jī)理的研究，同時(shí)也無(wú)法滿足細(xì)胞移植治療肌相關(guān)疾病的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是建立簡(jiǎn)單易行、高純度的豬SMSC體外培養(yǎng)方法，為 SMSC介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，肌肉組織再生和發(fā)育機(jī)理研究提供材料，同時(shí)為骨骼肌單根肌纖維 或SMSC移植治療肌相關(guān)疾病奠定基礎(chǔ)。采用如下技術(shù)方案一種豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，包括以下步驟(1)樣品采集用含0.5%的新潔爾滅清洗大白豬0. ，電擊處死；然后在無(wú)菌操作臺(tái)上，在肌 肉組織兩端肌腱上操作，小心、完整剝離趾長(zhǎng)伸肌，進(jìn)一步剝離為四小塊，以利于酶充分消 化；(2)培養(yǎng)皿的預(yù)處理用基質(zhì)膠涂布培養(yǎng)板，并將其置于37°C、5% 0)2培養(yǎng)箱中4h以上；臨用時(shí)，紫外燈 照射30min后，用PBS洗滌備用；(3)骨骼肌纖維的移植將采集的趾長(zhǎng)伸肌樣品用PBS清洗2遍，加入等體積的I型膠原酶，放入37°C水浴 鍋預(yù)消化60-90min后，轉(zhuǎn)移至用馬血清涂漬的玻璃皿中，用廣口巴斯德吸管充分吹打，若 吹打不開(kāi)，則繼續(xù)返回消化，直至有大量的單根肌纖維游離出來(lái)，選擇完整未受損且呈光亮 的單根肌纖維，用細(xì)口彎頭吸管移入培養(yǎng)皿中清洗3次，以1根/孔的密度接種于M孔板 中央，5min后，加入培養(yǎng)基，于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，重復(fù)以上步驟，直至獲得足夠量 的單根肌纖維為止；(4)單根肌纖維的移除培養(yǎng)3d后，用細(xì)口巴斯德吸管小心的將單根肌纖維吸出，以去除視野中的雜質(zhì)；(5) SMSC的傳代培養(yǎng)當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%左右時(shí)，用0. 25%的胰酶于37°C，5% C02的培養(yǎng)箱中消化5min,然后用等體積的培養(yǎng)基終止消化，1500g離心7min，棄去上清液，重懸，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)器 計(jì)數(shù)后，重新接種培養(yǎng)；(6) SMSC 的鑒定；(7) SMSC 純度檢測(cè)；其中所用培養(yǎng)基采用如下培養(yǎng)基NaHCO3 2. 3g/LHEPES 2. 6g/LGibco胎牛血清20% (體積百分比)Gibco馬血清10% (體積百分比)雞胚提取物青霉素5X10 /!連霉素5X10 /!三蒸水80% (體積百分比)PH 7. 2-7. 4。建立一種簡(jiǎn)單易行、高純度的豬SMSC體外培養(yǎng)方法，為SMSC介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，肌 肉組織再生和發(fā)育機(jī)理研究提供材料，同時(shí)為骨骼肌單根肌纖維或SMSC移植治療肌相關(guān)
疾病奠定基礎(chǔ)。


圖1 SMSC的形態(tài)學(xué)變化；A 將分離得到的單根肌纖維置于培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h，倒 置顯微鏡下觀察，肌纖維上有許多凸起，同時(shí)有少量的細(xì)胞從肌纖維上遷移出來(lái)。B 培養(yǎng) 7 后，可見(jiàn)有細(xì)胞從單根肌纖維上遷出，逐漸開(kāi)始貼壁，并由圓形變?yōu)樗笮位蚣忓N形。C: 連續(xù)培養(yǎng)4d，移除單根肌纖維后的細(xì)胞。D 傳代培養(yǎng)2d的細(xì)胞，可見(jiàn)細(xì)胞密度適中且分布均一。圖2細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)SMSC早期特異表達(dá)的標(biāo)記蛋白(Pax7)及成肌標(biāo)記蛋 白(MyoD, Myogenin) ；A、B和C :Pax7呈陽(yáng)性表達(dá)；D、E和F =MyoD呈陽(yáng)性表達(dá)；G、H和I Myogenin免疫染色呈陽(yáng)性，且僅表達(dá)于細(xì)胞核。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物1-3日齡的健康大白豬，由西北農(nóng)林科技大學(xué)畜禽生態(tài)養(yǎng)殖場(chǎng)提供。2、樣品采集用含0. 5%的新潔爾滅清洗大白豬0. 5h，電擊處死。然后在無(wú)菌操作臺(tái)上，在兩端 肌腱上操作，小心、完整剝離趾長(zhǎng)伸肌(Extensor Digitorum Longus，EDL)，同時(shí)根據(jù)其特 殊的組成機(jī)構(gòu)，由肌腱處，進(jìn)一步剝離為四小塊，以利于酶充分消化。3、培養(yǎng)皿的預(yù)處理用基質(zhì)膠涂布培養(yǎng)板，并將其置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中4h以上。臨用時(shí)，紫外 燈照射30min后，用PBS洗滌備用。
4、骨骼肌纖維的移植將采集的EDL樣品用PBS清洗2遍，加入等體積的I型膠原酶，放入37°C水浴鍋 預(yù)消化60-90min后，轉(zhuǎn)移至用馬血清涂漬的玻璃皿中，用廣口巴斯德吸管充分吹打，若吹 打不開(kāi)，則繼續(xù)返回消化，直至有大量的單根肌纖維游離出來(lái)，選擇完整未受損且呈光亮的 單根肌纖維，最好是有時(shí)候還能觀察到其跳動(dòng)，用細(xì)口彎頭吸管移入培養(yǎng)皿中清洗3次，以 1根/孔的密度接種于M孔板中央，5min后，加入培養(yǎng)基，于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 重復(fù)以上步驟，直至獲得足夠量的單根肌纖維為止(圖IA和1B)。5、單根肌纖維的移除培養(yǎng)3d后，用細(xì)口巴斯德吸管小心的將單根肌纖維吸出，以去除視野中的雜質(zhì) (圖 1C)。6、SMSC的傳代培養(yǎng)當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%左右時(shí)，用0. 25%的胰酶于37°C，5% CO2的培養(yǎng)箱中消化 5min,然后用等體積的培養(yǎng)基終止消化，1500g離心7min，棄去上清液，重懸，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)器 計(jì)數(shù)后，重新接種培養(yǎng)(圖1D)。7、SMSC 的鑒定為確定分離得到的細(xì)胞SMSC，對(duì)其早期特異性表達(dá)的1^x7進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié) 果顯示fax7呈陽(yáng)性表達(dá)(圖2A)，且與藍(lán)色的Hochest細(xì)胞核染(圖2B)疊加后，完全重 疊(圖2C)，表明分離的細(xì)胞為SMSC。對(duì)培養(yǎng)4d的SMSC免疫熒光染色結(jié)果顯示，MyoD呈陽(yáng) 性表達(dá)(圖2D、2E和2F)，且表達(dá)于有絲分裂細(xì)胞的胞質(zhì)中。繼續(xù)培養(yǎng)至第6d時(shí)，Myogenin 免疫染色也呈陽(yáng)性，但是僅表達(dá)于細(xì)胞核(圖2G、2H和21)。結(jié)果表明分離得到的細(xì)胞確實(shí) 為SMSC，且具有成肌分化特性。8、SMSC純度檢測(cè)通過(guò)計(jì)算1^x7呈陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)(圖2A)與核染數(shù)(總細(xì)胞數(shù))(圖2B)的比 值計(jì)算SMSC的純度，結(jié)果得出，分離得到的SMSC純度為90%以上(圖2C)。上述各培養(yǎng)基成分如下NaHCO3 2. 3g/LHEPES 2. 6g/LGibco胎牛血清20% (體積百分比)Gibco馬血清10% (體積百分比)雞胚提取物青霉素5X10 /!連霉素5X10 /!三蒸水80% (體積百分比)PH 7. 2-7. 4采用本發(fā)明的方法，首先，通過(guò)肌腱繼續(xù)將EDL剝離為四小塊，解決了大動(dòng)物整塊 完整的肌肉組織消化難的問(wèn)題，同時(shí)滿足了單根肌纖維的培養(yǎng)要求；其次，由于豬的年齡， 品種等差異，消化時(shí)間難于抓握，所以選擇了消化強(qiáng)度柔和的I型膠原酶消化，同時(shí)提前取 出吹打并觀察，保證消化時(shí)間的最優(yōu)化；最后，由于SMSC的培養(yǎng)是一個(gè)高耗能的過(guò)程，所以 我們?cè)谂囵B(yǎng)基的配備中，選擇了優(yōu)質(zhì)的，高濃度的胎牛血清，并添加了雞胚提取物或FGF，以使其快速分裂增殖。由于在消化，吹打過(guò)程中，難免會(huì)將附著于單根肌纖維的SMSC消化下來(lái)，所以在 挑取完足夠量的單根肌纖維后，還可以將其余的肌肉組織用等體積的培養(yǎng)基終止消化，而 后用400目，200目篩網(wǎng)過(guò)濾，離心，重懸后接種培養(yǎng)SMSC。應(yīng)當(dāng)理解的是，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可以根據(jù)上述說(shuō)明加以改進(jìn)或變換， 而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1. 一種豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，包括以下步驟(1)樣品采集用含0. 5%的新潔爾滅清洗大白豬0. 5h，電擊處死；然后在無(wú)菌操作臺(tái)上，在兩端肌腱 上操作，小心、完整剝離趾長(zhǎng)伸肌，進(jìn)一步剝離為四小塊，以利于酶充分消化；(2)培養(yǎng)皿的預(yù)處理用基質(zhì)膠涂布培養(yǎng)板，并將其置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中4h以上；臨用時(shí)，紫外燈照射 30min后，用PBS洗滌備用；(3)骨骼肌纖維的移植將采集的趾長(zhǎng)伸肌樣品用PBS清洗2遍，加入等體積的I型膠原酶，放入37°C水浴鍋 消化60-90min后，轉(zhuǎn)移至用馬血清涂漬的玻璃皿中，用廣口巴斯德吸管充分吹打，若吹打 不開(kāi)，則繼續(xù)返回消化，直至有大量的單根肌纖維游離出來(lái)，選擇完整未受損且呈光亮的單 根肌纖維，用細(xì)口彎頭吸管移入培養(yǎng)皿中清洗3次，以1根/孔的密度接種于M孔板中央， 5min后，加入培養(yǎng)基，于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，重復(fù)以上步驟，直至獲得足夠量的單 根肌纖維為止；(4)單根肌纖維的移除培養(yǎng)3d后，用細(xì)口巴斯德吸管小心的將單根肌纖維吸出，以去除視野中的雜質(zhì)；(5)SMSC的傳代培養(yǎng)當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%左右時(shí)，用0. 25%的胰酶于37°C，5% CO2的培養(yǎng)箱中消化5min， 然后用等體積的培養(yǎng)基終止消化，1500g離心7min，棄去上清液，重懸，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù) 后，重新接種培養(yǎng)；(6)SMSC的鑒定；(7)SMSC純度檢測(cè)；其中所用培養(yǎng)基采用如下培養(yǎng)基 NaHCO3 2. 3g/L HEPES 2.6g/LGibco胎牛血清20% (體積百分比)Gibco馬血清10% (體積百分比)雞胚提取物青霉素5X10 /L連霉素5X10 /L三蒸水80% (體積百分比)PH 7. 2-7. 4。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞(Skeletal Muscle Satellite Cell，SMSC)體外培養(yǎng)方法，包括以下步驟樣品采集；培養(yǎng)皿的預(yù)處理；骨骼肌纖維的移植；單根肌纖維的移除；SMSC的傳代培養(yǎng)；SMSC的鑒定；SMSC純度檢測(cè)；建立了一種簡(jiǎn)單易行、高純度的豬SMSC體外培養(yǎng)方法，為SMSC介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，肌肉組織再生和發(fā)育機(jī)理研究提供材料，同時(shí)為骨骼肌單根肌纖維或SMSC移植治療肌相關(guān)疾病奠定基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N5/077GK102140438SQ20111000234
公開(kāi)日2011年8月3日 申請(qǐng)日期2011年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月7日
發(fā)明者劉月光, 史新娥, 楊公社, 楊秋梅, 沈清武, 陳宗正, 高曉娟 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)