專利名稱：一種綿羊可誘導(dǎo)多能干細胞及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種綿羊成體細胞重編程為類似胚胎干細胞的可誘導(dǎo)多能干細胞(Induced pluripotent stem cell，簡稱iPS細胞)及其制備方法。
背景技術(shù)：
綿羊是大型偶蹄目動物，其基因組、器官大小均與人類相近，而且在畜牧、農(nóng)業(yè)方面的應(yīng)用非常廣泛，可以用于制造人類疾病模型；將其器官作為人類器官移植的供體；利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)制造藥物蛋白；改良物種等等。胚胎干細胞是來自胚泡，可無限繁殖同時能維持多能性，即可分化為三個胚層的一類祖細胞?；谂咛ジ杉毎芯康姆聪蜻z傳學手段對于遺傳學、發(fā)育生物學、基因敲除模型的建立等方面具有巨大的推動作用。從25年前小鼠胚胎干細胞獲得到現(xiàn)在，人們利用反向遺傳學手段不斷建立和完善各種小鼠模型(Demers，S. P.，et al. (2007), Cloning andstem cells,9, 512-522) 0但數(shù)十年來科學界始終沒能成功建立綿羊胚胎干細胞(ES)系。其中很重要的一個原因就是沒有尋找到適合綿羊ESC全能性維持的培養(yǎng)基。此外，綿羊的胚胎發(fā)育過程以及維持綿羊ESCs全能性的通路研究都不夠清楚；對于鑒定其干細胞特征的方法很有限，也是導(dǎo)致目前并沒有產(chǎn)生綿羊ESC細胞系的原因，也就制約了轉(zhuǎn)基因綿羊及克隆羊的應(yīng)用。經(jīng)典的建立ESC細胞系的方法是從囊胚的內(nèi)細胞團分離出ESCsdfiWg前的研究結(jié)果來看，利用經(jīng)典方法產(chǎn)生綿羊ESC細胞系是相當困難的。2006年8月，Yamanaka實驗室利用外源表達0ct4, Sox2, c_Myc，Klf4四個轉(zhuǎn)錄因子，成功誘導(dǎo)小鼠胚胎成纖維細胞為類似小鼠胚胎干細胞的“可誘導(dǎo)的多能干細胞”(inducedpluripotent stem cells，iPS)，這項實驗結(jié)果說明分化細胞可以通過幾個轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)，重編程到全能性的狀態(tài)(Takahashi, K.，and Yamanaka, S. (2006). Inductionof Pluripotent stemcells from mouse embryonic and adult fibroblast culturesby defined factors. Cell 126,663-676) ；2007 年，人類 iPS 的建立，進一步驗證了該方法的可行性(Takahashi, K. , et al. (2007). Induction of pluripotent stem cells fromadult human fibroblasts by defined factors. Celll31,861-872 ；Yu,J.,et al. (2007).Induced pluripotent stem cell lines derived from humansomatic cells.Science318，1917-1920)。但由于iPS細胞并非百分之百的ES細胞，是否能夠運用到使用傳統(tǒng)方法無法建立ES細胞的物種上還是未知的，現(xiàn)有技術(shù)中也未見報道”。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于，提供一種綿羊可誘導(dǎo)多能干細胞。本發(fā)明的第二個目的在于，提供一種綿羊可誘導(dǎo)多能干細胞的制備方法。本發(fā)明的綿羊可誘導(dǎo)多能干細胞的制備方法，包括步驟A)構(gòu)建攜帶轉(zhuǎn)錄因子的藥物誘導(dǎo)的慢病毒載體，即Tet-on系統(tǒng)。所述轉(zhuǎn)錄因子選自0ct4，Sox2, c-Myc, Klf4, Lin28, Nanog, SV40, hTERT ；
B)將步驟A所得慢病毒載體以組合形式感染綿羊成體細胞，同時加入Lv-efla-rtTA-IRES-EGFP，挑選形態(tài)類似胚胎干細胞的克隆傳代培養(yǎng)，通過篩選符合胚胎干細胞特性的細胞克隆，得到綿羊可誘導(dǎo)多能干細胞。根據(jù)本發(fā)明所述的方法，所述綿羊成體細胞為綿羊原代耳尖成纖維細胞。根據(jù)本發(fā)明所述的方法，所述慢病毒載體以組合形式攜帶的轉(zhuǎn)錄因子的組合形式包括0ct4、Sox2、c-Myc、Klf4、Nanog、Lin28、SV40、hTERT ；或 0ct4、Sox2、c_Myc、Klf4、Nanog、Lir^8、SV40。根據(jù)本發(fā)明所述的方法，所述步驟B)的傳代培養(yǎng)是將綿羊iPS克隆按1 5 40的比例傳至輻照過的小鼠胚胎成纖維細胞上。根據(jù)本發(fā)明所述的方法，所述步驟B)的篩選是篩選堿性磷酸酶染色呈陽性的細胞。根據(jù)本發(fā)明所述的方法，還包括步驟C)綿羊iPS細胞的干細胞多能性鑒定。根據(jù)本發(fā)明所述的方法，所述步驟C)綿羊iPS細胞的干細胞多能性鑒定包括檢測以下指標1)堿性磷酸酶表達呈陽性；2)干細胞表面特異標記 SSEA-I (+)、Tra-1-60 (+)、Tra-1-81 (+) Rexl (+)、CDHl(+)；3)自然分化形成胚狀體后，外胚層Fibronectin (+)、NeuroD (+)、NFH(+)，中胚層ACTC1 (+)、KDR (+)、Myf5 (+)和內(nèi)胚層 DCN (+)、AFP (+)、Foxa2 (+)；4)綿羊iPS細胞注射先天性免疫缺陷小鼠后形成畸胎瘤。根據(jù)本發(fā)明所述的方法，所述形成的畸胎瘤具有外胚層、中胚層和內(nèi)胚層。根據(jù)本發(fā)明所述的方法，所述干細胞多能性鑒定還包括檢測5)Nanog基因的啟動子區(qū)域被去甲基化。本發(fā)明有助于確立綿羊ES細胞建系的最適培養(yǎng)條件和方法；綿羊iPS細胞是綿羊基因打靶的良好載體，本發(fā)明的綿羊iPS細胞將利于揭示綿羊各基因功能和復(fù)雜的發(fā)育事件；此外，綿羊iPS是繼人、恒河猴的iPS成功誘導(dǎo)后大型哺乳動物的iPS，這對于其它模式動物iPS的誘導(dǎo)有著重大指導(dǎo)意義。


圖1是病毒載體LV-ef 1 α -EGFP-TRE結(jié)構(gòu)圖。圖2是綿羊iPS細胞形態(tài)熒光鏡檢結(jié)果，此為經(jīng)過篩選純化后得到的穩(wěn)定細胞系。圖3是綿羊iPS細胞堿性磷酸酶活性檢測。圖4A為Realtime PCR檢測綿羊iPS細胞未分化Marker表達情況的電泳圖，圖4B為內(nèi)源0ct4，Sox2和Nanog的表達差異柱形圖。使用的細胞系為綿羊耳尖成纖維細胞，綿羊 iPS 細胞系 oiPS7-3，7-12，8-3，8-18，8-60，8-64，8-108 及 8-119。圖5是免疫熒光染色檢測綿羊iPS細胞干細胞相關(guān)marker表達情況，包括SSEA-1、Tra-1-60、Tra-1-81、Rexl 和 CDHl。標尺代表 25 μ m。圖6是重亞硫酸鹽基因組測序分析綿羊iPS細胞Nanog啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的結(jié)果。使用的細胞系為綿羊耳尖成纖維細胞，綿羊iPS細胞系oiPS7-3，7-12，8-108及8-119。
圖7檢測綿羊iPS細胞在體外向三個胚層的分化能力。其中(A)為RealtimePCR檢測擬胚體中分化marker的表達，使用的細胞系為oiPS7_12，8_64，8-108及8-119與其對應(yīng)的擬胚體；(B)為免疫熒光染色檢測綿羊iPS細胞擬胚體的分化marker，標尺代表50 μ m0圖8為綿羊iPS細胞畸胎瘤形成情況，其中㈧神經(jīng)上皮(外胚層)，⑶鱗狀上皮細胞(外胚層)，(C)骨(中胚層)，⑶腸上皮以及(E)腺體(內(nèi)胚層)。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進一步說明。應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。以下實施例中，用到的培養(yǎng)基有綿羊原代耳尖成纖維細胞在原代培養(yǎng)時的培養(yǎng)基以及傳代后的培養(yǎng)基，具體組成為90%^ α-DMEM 培養(yǎng)液(購自 Invitrogen, 11965) ； 10% 的胎牛血清(購自 HyClone,SH30396. 03)。綿羊iPS細胞的培養(yǎng)基，具體組成為80%的Knockout D-MEM/F12培養(yǎng)液(購自Invitrogen, 12660) ；20%的Knockout SR(購自 Invitrogen，10828) ；ImM L-谷氨酸(購自Invitrogen, 25030) ；0. ImM 的非必須氨基酸(購自 Invitrogen, 11140050) ；0. ImM β-巰基乙醇(購自 Sigma，Μ7522)。以下實施例中所使用的慢病毒載體LV-ef 1 α -EGFP-TRE購自hvitrogen公司，其結(jié)構(gòu)如圖1所示，具有氨芐抗性。以下實施例中，通用的細胞培養(yǎng)產(chǎn)品均購自^witrogen公司。實施例1、慢病毒載體的構(gòu)建1. 1JANCBI 網(wǎng)站(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)查詢干細胞中特異表達或高表達的特定基因(0ct4, Sox2, c-Myc，Klf4，Lin28，Nanog, SV40, hTERT)的編碼區(qū)，根據(jù)編碼區(qū)序列設(shè)計引物，并引入酶切位點，引物序列如表1所示，其中F表示正向引物，R表示反向引物。表1引物序列
權(quán)利要求
1.一種綿羊可誘導(dǎo)多能干細胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟A)構(gòu)建攜帶轉(zhuǎn)錄因子的藥物誘導(dǎo)的慢病毒載體，即Tet-on系統(tǒng)，其中，所述轉(zhuǎn)錄因子選自0ct4、Sox2、c-Myc、Klf4、Lin28、Nanog、SV40、survivin, hTERT ；B)采用步驟Α)所得慢病毒載體將轉(zhuǎn)錄因子以組合形式感染綿羊成體細胞，挑選形態(tài)類似胚胎干細胞的克隆傳代培養(yǎng)，通過篩選符合胚胎干細胞特性的細胞克隆，得到綿羊可誘導(dǎo)多能干細胞。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述綿羊成體細胞包括綿羊原代耳尖成纖維細胞。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述組合形式為a)含有0ct4、Sox2、c-Myc, Klf4、Nanog、Lin28、SV40 ；或b)含有0ct4、Sox2、c-Myc、Klf4、Nanog、Lin28、SV40、hTERT。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟B)的傳代培養(yǎng)是將綿羊iPS克隆按1 5 40的比例傳至輻照過的小鼠胚胎成纖維細胞上。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟B)的篩選是篩選堿性磷酸酶染色呈陽性的細胞。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括步驟C)綿羊可誘導(dǎo)多能干細胞的干細胞多能性鑒定。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，干細胞多能性鑒定包括檢測以下指標1)堿性磷酸酶表達呈陽性；2)干細胞表面特異標記SSEA-I (+)、Tra-1-60 (+)、Tra-1-81 (+)、Rexl (+)和 CDHl (+)；3)自然分化形成胚狀體后，外胚層Fibronectin(+)、NeuroD (+)、NFH (+)，中胚層ACTC1 (+)、KDR (+)、Myf5 (+)和內(nèi)胚層 DCN (+)、AFP (+)、Foxa2 (+)；4)綿羊可誘導(dǎo)多能干細胞注射先天性免疫缺陷小鼠后形成畸胎瘤。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，畸胎瘤具有外胚層、中胚層和內(nèi)胚層。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述干細胞多能性鑒定還包括檢測以下指標5)Nanog基因的啟動子區(qū)域被去甲基化。
10.一種按權(quán)利要求1 9任一項所述的制備方法制備的綿羊可誘導(dǎo)多能干細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種綿羊可誘導(dǎo)多能干細胞及其制備方法，該制備方法包括步驟A)構(gòu)建攜帶轉(zhuǎn)錄因子的慢病毒載體，所述轉(zhuǎn)錄因子選自O(shè)ct4、Sox2、c-Myc、Klf4、Lin28、Nanog、SV40、hTERT；B)采用步驟A)所得慢病毒載體將轉(zhuǎn)錄因子以組合形式感染綿羊成體細胞，挑選形態(tài)類似胚胎干細胞的克隆傳代培養(yǎng)，通過篩選符合胚胎干細胞特性的細胞克隆，得到綿羊可誘導(dǎo)多能干細胞。本發(fā)明有助于確立綿羊ES細胞建系的最適培養(yǎng)條件和方法；綿羊可誘導(dǎo)多能干細胞是綿羊基因打靶的良好載體，同時綿羊可誘導(dǎo)多能干細胞將利于揭示綿羊各基因功能和復(fù)雜的發(fā)育事件，并可用于改良物種、促進經(jīng)濟增長。
文檔編號C12N5/071GK102586171SQ201110002460
公開日2012年7月18日 申請日期2011年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月7日
發(fā)明者何麗夏子, 肖磊, 鮑磊 申請人:中國科學院上海生命科學研究院