專利名稱：沙冬青抗寒基因AmGS的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種我國西北荒漠地區(qū)的源于遠(yuǎn)古第三紀(jì)的國家ニ級(jí)瀕危保護(hù)植物， 也是至今在亞洲中部荒漠地帶唯一保留下來的常綠闊葉木本植物沙冬青的抗寒基因AmGS 的分子克隆和遺傳轉(zhuǎn)化。通過低溫誘導(dǎo)和差異表達(dá)分析，獲得了低溫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的沙冬青抗凍基因的EST片段，然后通過RACE擴(kuò)增獲得了沙冬青抗寒基因AmGS的全長cDNA序列， 在基因庫中進(jìn)行了注冊(cè)，注冊(cè)為DQ519359。AmGS含有完整的ORF區(qū)域，ORF全長987個(gè)核苷酸，編碼3 個(gè)氨基酸和一個(gè)終止密碼子(TAA)。隨后構(gòu)建了沙冬青抗寒基因AmGS的真核表達(dá)載體pCAMBIA2300-AmGS，用于轉(zhuǎn)化擬南芥和林木，獲得的轉(zhuǎn)基因植株抗寒性有所提高。AmGS是國際上克隆并完成轉(zhuǎn)化木本植物的第一個(gè)木本植物抗寒基因，我們擁有完全獨(dú)立自主的知識(shí)產(chǎn)權(quán)。它的克隆和成功轉(zhuǎn)化對(duì)于木本植物抗寒基因研究和遺傳育種具有重要
眉、O
ニ背景技術(shù)：
低溫是限制植物的生長，發(fā)育和分布的重要因素，2007-2008年在我國南方大面積發(fā)生的那場(chǎng)凍害，我們還記憶猶新，其中對(duì)木本植物造成的危害最重，而且其影響將持續(xù)在其后十幾年。木本植物抗寒基因的研究落后于草本植物，更落后于原核生物及魚類和昆蟲。 但從另ー個(gè)角度來看，由于木本植物具有相同的多年生的特性，具有木質(zhì)化構(gòu)造，冬季能夠發(fā)展出較強(qiáng)的抗寒性，所以從木本植物中應(yīng)該更容易分離到有較強(qiáng)抗寒效果的基因。把這樣的基因轉(zhuǎn)化到需要的木本植物中可能會(huì)比轉(zhuǎn)化來自于其它生物的抗寒基因更為有效。所以從木本植物中克隆抗寒基因并研究它們的表達(dá)和功能，具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。植物抗寒基因工程與其它抗性基因工程相比起步晚，發(fā)展慢，直到八十年代末，才報(bào)道了抗寒基因工程方面的研究成果。至今，植物抗寒基因工程主要通過以下五個(gè)途徑進(jìn)行①魚類及昆蟲抗凍基因途徑；②脂肪酸去飽和代謝關(guān)鍵酶基因途徑；③超氧物岐化酶 (SOD)基因途徑；④糖類基因途徑；⑤本草植物抗凍基因途徑。其中用的最早的是魚類抗凍基因途徑，魚類抗凍蛋白(AFP)吸附于凍晶上，使極地魚類有抗冰晶化作用，保護(hù)極地魚。 1989年，Cutler用極地魚黃蓋鰈抗凍蛋白處理植物組織，明顯改善了馬鈴薯、草菁和擬南芥屬葉子的抗寒性能。George把人工合成的黃蓋鰈AFP基因，通過電激法成功導(dǎo)入玉米原生質(zhì)體，得到表達(dá)。Mllis以農(nóng)桿菌介導(dǎo)，把合成的PHA-AFP (PHF 植物凝集素)融合基因轉(zhuǎn)入到馬鈴薯中，馬鈴薯的抗凍與耐凍能力提高了。近年來植物抗凍基因的研究有了較好的進(jìn)展，美國和中國的科學(xué)家分別克隆了擬南芥的抗凍基因并導(dǎo)入番茄，得到良好的表達(dá)， 獲得了抗寒性提高的轉(zhuǎn)基因植株。美國DNA植物技術(shù)公司把抗凍基因?qū)氲睫阎校嘤瞿秃?，并且認(rèn)為抗凍蛋白有可能應(yīng)用于所有蔬菜品種的改良。但木本植物抗寒基因的克隆和轉(zhuǎn)化方面迄今尚未見成功報(bào)道。本研究結(jié)果正是希望在這個(gè)領(lǐng)域打開突破口而開展起來的。
發(fā)明內(nèi)容
本研究用我國西北荒漠地區(qū)一種常綠闊葉的豆科灌木沙冬青為材料，進(jìn)行了木本植物冷誘導(dǎo)基因的克隆和功能分析研究。通過低溫誘導(dǎo)處理和差異表達(dá)分析，獲得了低溫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的沙冬青抗凍基因的EST序列十三個(gè)(包括八個(gè)全長基因和五個(gè)cDNAs的部分序列)。其中的ー個(gè)(基因庫注冊(cè)號(hào)DQ519359)包含沙冬青抗寒基因AmGS (coding sequence of gaiactinol synthase in Ammopiptanthus mongolicus)的全長 cDNA 序夕IJ, 其ORF區(qū)域長987個(gè)核苷酸，編碼3 個(gè)氨基酸和一個(gè)終止密碼子(TAA)(圖1)。隨后克隆了相應(yīng)的核DNA序列，結(jié)構(gòu)分析表明，AmGS基因核DNA序列含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子。我們用雙元克隆載體pCAMBIA2300 (購自公司澳大利亞Cambia公司，其結(jié)構(gòu)見附圖2)，構(gòu)建了 AmGS基因的植物表達(dá)載體。在構(gòu)建目的基因AmGS的表達(dá)載體時(shí)，將分子克隆得到的AmGS基因片段在)(ba I和Ml I雙酶切位點(diǎn)插入到載體pCAMBIA2300中，建成的表達(dá)載體被命名為pCAMBIA2300-AmGS (圖幻。所用的標(biāo)記基因是廣泛應(yīng)用的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(NPTII)，它編碼的產(chǎn)物對(duì)氨基葡糖苷類抗生素如卡那霉素等具有抗性。在構(gòu)建本表達(dá)載體時(shí)考慮到融合基因太大會(huì)影響表達(dá)，因此沒包含報(bào)告基因GUS.該基因轉(zhuǎn)化到植物體內(nèi)后可以抑制冰晶生長及新冰晶的形成，從而保護(hù)細(xì)胞免受損傷，提高植物的耐寒性。由于AmGS基因來源于木本植物，轉(zhuǎn)化后在木本植物宿主體內(nèi)更容易表達(dá)，轉(zhuǎn)化的植物對(duì)環(huán)境沒有任何影響。
具體實(shí)施例方式(一 )以木本植物的離體再生體系作為轉(zhuǎn)化材料，利用農(nóng)桿菌浸染、花粉管通道、 基因槍等方法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。( ニ )轉(zhuǎn)化操作步驟1.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(1)通過三親株雜交法將pCAMBIA2300-AmGS表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌LBA4404 中，用于農(nóng)桿菌浸染轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。(2)菌液制備1)用接種環(huán)刮拭含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌株凍結(jié)的培養(yǎng)物表面，劃線于含有相應(yīng)抗生素的上述YEP平板上，置于觀で恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2天，待平板上有菌落長出來的時(shí)候， 即可用于液體培養(yǎng)。長出菌落的平板置于4°C冰箱保存。一個(gè)月后轉(zhuǎn)接到新的YEP平板上， 以保持菌的活性。2)從平板上挑取單菌落，接種于含IOml附加相應(yīng)抗生素的YEP液體培養(yǎng)基 (pH7. 0)中，在恒溫?fù)u床上，于觀で，180-200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。3)次日早晨，當(dāng)菌液OD6tltl = 0.5-0. 6吋，可用于轉(zhuǎn)化。(經(jīng)驗(yàn)上一般為頭天下午5 點(diǎn)左右進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，次日早晨8點(diǎn)左右菌液濃度可達(dá)到標(biāo)準(zhǔn))備注培養(yǎng)基中加入抗生素的時(shí)候，一定要等到培養(yǎng)基冷卻但未凝固時(shí)(即人手所能忍耐的溫度)加入，否則抗生素在高溫下會(huì)失效。(3)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化1)預(yù)培養(yǎng)將無菌離體再生組織橫向切割2-3個(gè)切ロ，后接種在分化培養(yǎng)基上進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)1-2天。
2)共培養(yǎng)用無菌水將農(nóng)桿菌菌液稀釋5-20倍，將經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的離體再生組織浸泡在稀釋液中10-20分鐘，取出莖段，用無菌濾紙吸干后，轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)2-4天， 對(duì)照處理是將剪傷的離體再生組織在無菌水中浸10-20分鐘，其它處理與實(shí)驗(yàn)材料一祥。3)選擇培養(yǎng)離體再生組織與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后，即可看到離體再生組織邊緣有乳白色的農(nóng)桿菌菌落出現(xiàn)，用無菌水沖洗莖段，然后用無菌濾紙吸干。將離體再生組織轉(zhuǎn)移到加有選擇壓的脫菌分化培養(yǎng)基上，在光照4000-100001x，25°C條件下進(jìn)行選擇培養(yǎng)。4)繼代選擇培養(yǎng)選擇培養(yǎng)3-4周后，離體再生組織的轉(zhuǎn)化細(xì)胞將分化出抗性不定芽，將這些抗性材料轉(zhuǎn)入相應(yīng)的加大選擇壓的脫菌選擇培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。5)生根培養(yǎng)待不定芽長到2厘米以上吋，切下并插入含有選擇壓的脫菌生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，兩周左右長出不定根，獲得轉(zhuǎn)化植株。2、花粉管通道、基因槍等轉(zhuǎn)化法(1)從含有pCAMBIA2300-AmGS的根癌農(nóng)桿菌LBA4404菌液中，提取基因質(zhì)粒DNA， 配制不同濃度，在植物開花初期利用利用花粉管通道法將目的基因?qū)胧荏w植株中，獲得轉(zhuǎn)基因植株。(2)從含有pCAMBIA2300-AmGS的根癌農(nóng)桿菌LBA4404菌液中，提取質(zhì)粒DNA，利用基因槍法將目的基因?qū)胧荏w植株中，獲得轉(zhuǎn)基因植株。(三)PCR分子檢測(cè)1、植物總DNA的提取(采用CTAB法)(1)稱取2克左右植物試管苗新鮮葉片，置研缽中，加入1/10植物材料體積的 PVPP,倒入液氮將植物材料研磨成細(xì)末。(2)將此粉末放入大離心管中，加入65°C預(yù)熱過的與植物材料等體積的2XCTAB 提取液，再加入1 %的β -巰基乙醇，反復(fù)顛倒混勻，65°C保溫15-20min.(3)取出，冷卻到室溫，加入等體積的氯仿，輕輕的反復(fù)顛倒約lOmin，室溫 12000rpm離心15分鐘。(4)將上清液置于另ー離心管中，重復(fù)上ー步驟1-2次。(5)加入2倍體積無水乙醇，充分混勻，用玻璃鉤撓出絮狀沉淀，置于預(yù)先放滿 70%乙醇的Eppendorf管中，洗滌DNA，12000rpm離心，倒掉乙醇。(6)加入2倍體積70 %乙醇，洗滌DNA 2次。(7)吹干，溶于適量TE(ρΗ8· 0)緩沖液中。(8)加入RNase溶液，使終濃度達(dá)到10mg/ml，35°C處理20min。然后用酚氯仿 異戊醇04 24 1)，抽提一次，上請(qǐng)液再用氯仿異戊醇04 1)，抽提一次。用兩倍體積無水乙醇沉淀出DNA。再用75%乙醇洗兩次，吹干，DNA溶于無菌水中放于-20°C備用。2、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)(1)反應(yīng)體系以質(zhì)粒DNA作為陽性對(duì)照，以未經(jīng)轉(zhuǎn)化的組培苗作為陰性對(duì)照，對(duì)轉(zhuǎn)化再生苗進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。根據(jù)AmGS基因序列設(shè)計(jì)ー對(duì)特異性引物。正向引物A12-V-1:5' -TCATGGCACCTGATATCACCACCGCT-3 ‘反向引物A12-V-2:5' -TATTAGGCAGCGGATGGGGCGGGAA-3‘
擴(kuò)增產(chǎn)物為Ikp正向引物設(shè)計(jì)在5'端載體序列上，反向引物設(shè)計(jì)在目的基因的3'端，用這對(duì)特異性引物擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為1Kb，包含是目的基因的全序列，這樣可以保證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物只能來自導(dǎo)入的AmGS基因序列，而不可能來自內(nèi)源基因序列，提高了檢測(cè)的特異性和準(zhǔn)確性。Southern雜交所用的探針是PCR擴(kuò)增出的片段，經(jīng)32P_dCTP標(biāo)記后用作Southern雜交的探針，PCR和Southern雜交檢測(cè)雙重陽性的則被認(rèn)為是轉(zhuǎn)基因植株。1)反應(yīng)液
(MH2O17μ 1
IOX PCR Buffer2. 5μ 1
dNTP2μ 1
正向引物1 μ 1
反向引物1 μ 1
模板DNA1 μ 1
iTaq 酶0. 5μ 1
總體積25 μ 1
2)反應(yīng)程序
預(yù)變性:94°C,5min
在以下條件下擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)變性，94°C 60sec ；復(fù)性，55°C 40sec ；延伸，72°C，
Imin ；最后延伸72°C，5min 4°C，保存?zhèn)溆?。?br>
附圖1. AmGS基因的編碼序列及推導(dǎo)的氨基酸序列附圖2克隆目的基因所用的雙元載體PCAMBIA2300的結(jié)構(gòu)示圖附圖3AmGS基因構(gòu)建圖
權(quán)利要求
1.本發(fā)明從我國西北荒漠地區(qū)的源于遠(yuǎn)古第三紀(jì)的國家ニ級(jí)瀕危保護(hù)植物，也是至今在亞洲中部荒漠地帶唯一保留下來的常綠闊葉木本植物沙冬青中克隆了其抗寒基因AmGS。 AmGS含有完整的ORF區(qū)域，ORF全長987個(gè)核苷酸，編碼3 個(gè)氨基酸和一個(gè)終止密碼子 (TAA)。隨后構(gòu)建了沙冬青抗寒基因AmGS的真核表達(dá)載體，用于轉(zhuǎn)化林木，獲得的轉(zhuǎn)基因林木植株抗寒性有所提高。AmGS來源于木本植物，因此轉(zhuǎn)化木本植物更容易表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植株對(duì)環(huán)境沒有不良影響。它的克隆和對(duì)林木遺傳轉(zhuǎn)化的成功對(duì)木本植物抗寒研究和遺傳育種具有重要意義。
2.克隆的沙冬青抗寒基因AmGS的編碼序列全長987個(gè)核苷酸，它編碼3 個(gè)氨基酸和一個(gè)終止密碼子(TAA)。用pCAMBIA2300為載體構(gòu)建了 AmGS的的表達(dá)載體 pCAMBIA2300-AmGS，在建成的表達(dá)載體中CaMV35S啟動(dòng)子、目的基因、終止子OCS和標(biāo)記基因NPTII整合在一起構(gòu)建成嵌合基因，有利于轉(zhuǎn)化和表達(dá)。
3.所用的標(biāo)記基因是廣泛應(yīng)用的來源于細(xì)菌的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(NPTII)，它編碼的產(chǎn)物對(duì)氨基葡糖苷類抗生素如卡那霉素等具有抗性，本表達(dá)載體不含報(bào)告基因GUS.
4.根據(jù)AmGS基因序列設(shè)計(jì)ー對(duì)特異性引物。正向引物A12-V-1 5' -TCATGGCACCTGATATCACCACCGCT-3 ‘反向引物A12-V-2 5' -TATTAGGCAGCGGATGGGGCGGGAA-3‘?dāng)U增產(chǎn)物為Ikp正向引物設(shè)計(jì)在5'端載體序列上，反向引物設(shè)計(jì)在目的基因的3'端，用這對(duì)特異性引物擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為1Kb，包含是目的基因的全序列，這樣可以保證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物只能來自導(dǎo)入的AmGS基因序列，而不可能來自內(nèi)源基因序列，提高了檢測(cè)的特異性和準(zhǔn)確性。1)反應(yīng)液ddH2017μ1IOX PCR Buffer2.5 μdNTP2μ 1正向引物Ιμ 反向引物1 μ 模板DNAΙμ Taq酶0.5 μ總體積25 μ 12)反應(yīng)程序預(yù)變性94°C，5min在以下條件下擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)變性，94°C 60sec ；復(fù)性，55°C 40sec ；延伸，72°C，Imin ； 最后延伸:72°C,5min 4°C，保存?zhèn)溆谩?br> 全文摘要
沙冬青抗寒基因AmGS涉及一種我國西北荒漠地區(qū)的源于遠(yuǎn)古第三紀(jì)的國家二級(jí)瀕危保護(hù)的常綠闊葉木本植物。該基因的分子克隆，通過低溫誘導(dǎo)和差異表達(dá)分析獲得了低溫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的沙冬青抗凍基因的EST片段，然后通過RACE擴(kuò)增獲得了該基因全長cDNA序列。AmGS含有完整的ORF區(qū)域，ORF全長987個(gè)核苷酸，編碼328個(gè)氨基酸和一個(gè)終止密碼子(TAA)；構(gòu)建了AmGS基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-AmGS，用pCAMBIA2300-AmGS轉(zhuǎn)化紅葉石楠，杏樹等木本植物都獲得了抗寒性有所提高的轉(zhuǎn)基因植株。
文檔編號(hào)C12N15/82GK102586269SQ201110008899
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2011年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月6日
發(fā)明者馮殿齊, 劉靜, 宋鍵, 曹鵬秀, 王斌, 羅磊, 翁曼麗 申請(qǐng)人:泰安市泰山林業(yè)科學(xué)研究院, 王斌