專利名稱：沙冬青抗旱基因的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因的篩選方法，尤其涉及一種沙冬青抗旱基因的篩選方法。
背景技術(shù)：
非生物脅迫是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的嚴重危害，特別是干旱，成為影響農(nóng)業(yè)的最重要的因素之一。近年來，由于我國工業(yè)發(fā)展迅速，環(huán)境遭到污染，溫室效應(yīng)日趨嚴重。隨著溫度的不斷升高及沙漠化擴大的影響，我國農(nóng)業(yè)受到了干旱的嚴重的影響。目前我國有超過50%的可耕種農(nóng)地受到干旱影響，有20%的可耕種農(nóng)地的旱情嚴重。即使是在降水量較多的華中及其華南地區(qū)，由于降水量分布不均勻，這些地區(qū)的農(nóng)作物比如水稻幾乎每年都在揚花的關(guān)鍵時期受到干旱影響，從而直接影響產(chǎn)量，旱情嚴重的甚至顆粒無收；而我國北方大部分地區(qū)，本來降水量就偏低，再加上日趨嚴重的旱情，農(nóng)業(yè)的發(fā)展狀況更是不容樂觀。我國作 為農(nóng)業(yè)大國，供養(yǎng)著接近世界人口的四分之一的人口，因此農(nóng)業(yè)對于我國乃至全世界都是重中之重。對于抗旱，世界各種的植物學(xué)研究工作者們一直將其作為重點研究課題，為此做了大量的工作，也取得了長足的進步。目前，對于植物抗旱，一般傾向于篩選抗旱基因，然后采用抗旱基因進行抗旱植株育種的方式得到抗旱性好的植株，因而通過篩選，獲得良好的抗旱基因就成為抗旱育種的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述不足，提供一種沙冬青抗旱基因的篩選方法，它能夠迅速有效地篩選出沙冬青的抗旱基因。為了達到上述技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種沙冬青抗旱基因的篩選方法，其中，包括以下步驟I)取干旱處理的沙冬青2)采用2 X CTAB的方法提取RNA3) RNA 純化4)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA5)高通量測序6)獲取差異表達序列7)檢索及軟件分析獲得抗旱基因。沙冬青具有很低的水勢和蒸騰強度，而束縛水含量很高，沙冬青不但水勢低，吸水能力很強，而且從葉到莖都具有抑制蒸騰失水的旱生結(jié)構(gòu)?？梢娚扯嗫购敌詢?yōu)秀，選用沙冬青來篩選抗旱基因，能夠獲得優(yōu)良的抗旱基因。上述沙冬青抗旱基因的篩選方法，其中，所述沙冬青的種子使用70%體積比的乙醇浸泡，然后用10%質(zhì)量比的次氯酸鈣消毒后，使用無菌水沖洗。上述沙冬青抗旱基因的篩選方法，其中，步驟2)提取RNA經(jīng)過以下流程
(I)將沙冬青真葉或莖段于-20°C研磨成粉，加入預(yù)熱65°C的緩沖液，震蕩，于65°C水浴(2)加入苯酚/氯仿/異戊醇，于4°C離心，取上清(3)加入 LiCl，-20°C放置(4)棄上清，70 %體積比乙醇漂洗沉淀(5)除去乙醇，加入無水乙醇_20°C放置(6)于4°C離心，采用DEPC處理的水溶解沉淀(7)瓊脂糖凝膠電泳，電壓檢測，-70°C貯藏。上述沙冬青抗旱基因的篩選方法，其中，所述步驟(2)、(3)重復(fù)兩次。上述沙冬青抗旱基因的篩選方法，其中，所述步驟5)測序后進行污染分析，隨機選取若干條讀長組裝后，于NCBI NR數(shù)據(jù)庫進行比對。上述沙冬青抗旱基因的篩選方法，其中，所述步驟5)測序后使用DNASTARNGEN軟件將測序結(jié)果和野生型測序結(jié)果進行組合組裝。上述沙冬青抗旱基因的篩選方法，其中，所述步驟6)中將獲得差異表達基因進行初步篩選，選取差異表達4倍以上的基因。上述沙冬青抗旱基因的篩選方法，其中，所述步驟6)、7)中應(yīng)用DNASTAR:ArrayStar軟件對轉(zhuǎn)錄組進行了差異表達分析。本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(I)本發(fā)明沙冬青抗旱基因的篩選方法，選用沙冬青來篩選抗旱基因，能夠獲得優(yōu)良的抗旱基因。(2)本發(fā)明沙冬青抗旱基因的篩選方法，對沙冬青的轉(zhuǎn)錄組進行分析以篩選抗旱基因，能夠全面、準確地篩選出優(yōu)良的抗旱基因。


圖I為野生型沙冬青測序結(jié)果污染鑒定2為本發(fā)明干旱處理沙冬青測序結(jié)果污染鑒定圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明進行進一步的說明本發(fā)明沙冬青抗旱基因的篩選方法較佳依次含有以下步驟I、實驗材料處理選用取自于內(nèi)蒙古阿拉善沙漠地區(qū)沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)種子作為實驗材料。沙冬青種子在不使用的情況下于4°C密封保存。對于本文中使用的實驗材料，首先將存放于4°C冰箱的沙冬青種子取出，在超凈工作臺中，使用70%的乙醇將其浸泡30s，然后用10%次氯酸鈣消毒20min后,使用無菌水沖洗3_5次,之后將其播種于MS固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)一個月，將幼苗從培養(yǎng)基中取出移栽，生長一個月后，干旱缺水一個月，然后收集它們的葉片與莖段，將其置于液氮中，然后放入_80°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?、RNA 提取RNA的提取采用2XCTAB的方法。RNA提取試劑見表I、表2。RNA提取流程如下、
(I)取0. 2g干旱處理的沙冬青真葉及莖段放入在_20°C預(yù)冷的研缽中，液氮中研磨成粉，加事先經(jīng)65°C預(yù)熱的RNA提取緩沖液800 ill。震蕩，65°C水浴5min，震蕩3次。
(2)將離心管從水浴中取出，冷卻至室溫，加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇，震蕩IOmin0 4°C, 12000rpm 離心 lOmin。(3)取上清，氯仿/異戊醇重復(fù)抽提一次。(4)取上清，加入 1/5 體積 10mmol/L 的 LiCl，_20°C放置 lh。(5) 4°C, 12000rpm 離心 20min。
(6)棄上清，吸干凈底部殘留的液體。(7) 400 u I DEPC 水溶解沉淀，再加入 1/5 體積 10mmol/L 的 LiCl，_20°C放置 lh。(8)4°C，12000rpm離心15min，棄上清，70%乙醇漂洗沉淀2-3次。(9)4°C, 12000rpm離心IOmin,除去乙醇,于室溫通風(fēng)櫥中自然風(fēng)干,約15min。(10)將溶液轉(zhuǎn)至I. 5mL的離心管中，加2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，_20°C放置3h。(11)于 4°C, 12000rpm 離心 20min。(12) 20 u L DEPC處理的水溶解沉淀。(13) I %瓊脂糖凝膠電泳，120V電壓檢測。-70°C貯藏備用。表I 2 X CTAB RNA提取緩沖液
權(quán)利要求
1.一種沙冬青抗旱基因的篩選方法，其特征在于包括以下步驟 1)取干旱處理的沙冬青 2)采用2X CTAB的方法提取RNA 3)RNA純化 4)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 5)高通量測序 6)獲取差異表達序列 7)檢索及軟件分析獲得抗旱基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述沙冬青抗旱基因的篩選方法，其特征在于所述沙冬青的種子使用70%體積比的乙醇浸泡，然后用10%質(zhì)量比的次氯酸鈣消毒后，使用無菌水沖洗。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述沙冬青抗旱基因的篩選方法，其特征在于所述步驟2)提取RNA經(jīng)過以下流程 (1)將沙冬青真葉或莖段于-20°C研磨成粉，加入預(yù)熱65°C的緩沖液，震蕩，于65°C水浴 (2)加入苯酚/氯仿/異戊醇，于4°C離心，取上清 (3)加入LiCl，-20°C放置 (4)棄上清，70%體積比乙醇漂洗沉淀 (5)除去乙醇，加入無水乙醇_20°C放置 (6)于4°C離心，采用DEPC處理的水溶解沉淀 (7)瓊脂糖凝膠電泳，電壓檢測，-70°C貯藏。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述沙冬青抗旱基因的篩選方法，其特征在于所述步驟(2)、(3)重復(fù)兩次。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項所述沙冬青抗旱基因的篩選方法，其特征在于所述步驟5)測序后進行污染分析，隨機選取若干條讀長組裝后，于NCBI NR數(shù)據(jù)庫進行比對。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項所述沙冬青抗旱基因的篩選方法，其特征在于所述步驟5)測序后使用DNASTAR NGEN軟件將測序結(jié)果和野生型測序結(jié)果進行組合組裝。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項所述沙冬青抗旱基因的篩選方法，其特征在于所述步驟6)中將獲得差異表達基因進行初步篩選，選取差異表達4倍以上的基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項所述沙冬青抗旱基因的篩選方法，其特征在于所述步驟6)、7)中應(yīng)用DNASTAR =ArrayStar軟件對轉(zhuǎn)錄組進行了差異表達分析。
全文摘要
本發(fā)明提供一種沙冬青抗旱基因的篩選方法，其包括以下步驟1)取干旱處理的沙冬青，2)采用2×CTAB的方法提取RNA，3)RNA純化，4)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，5)高通量測序，6)獲取差異表達序列，7)檢索及軟件分析獲得抗旱基因；本發(fā)明采用沙冬青進行轉(zhuǎn)錄組分析，篩選沙冬青抗旱基因，對抗旱植株育種具有重要指導(dǎo)意義。
文檔編號C12N15/10GK102732527SQ20111009351
公開日2012年10月17日 申請日期2011年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月14日
發(fā)明者夏新莉, 尹偉倫, 龐濤, 郭麗麗 申請人:北京林業(yè)大學(xué)