專利名稱：一種基于西班牙鹽盒菌和pyrF基因的遺傳操作系統(tǒng)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于西班牙鹽盒菌和pyrF基因的遺傳操作系統(tǒng)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1977年，美國(guó)人Woese發(fā)現(xiàn)了地球上的第三種生命形式-古菌，才導(dǎo)致了生命三域?qū)W說的提出，即認(rèn)為生命是由古菌域(Archaea)、細(xì)菌域(Bacteria)和真核生物域(Eucarya)所組成。古菌域包括泉古菌門(Crenarchaeota)、廣古菌門(Euryarchaeota)JlI古菌門(Korarchaeota)和納古菌門(Nanoarchaeota)。
古菌在遺傳信息的傳遞方面(如DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等)與真核生物相似；而在中心代謝(如產(chǎn)能)方面則與細(xì)菌接近。因此，研究古菌不僅對(duì)于闡明生命運(yùn)動(dòng)的基本規(guī)律、揭示生命起源和物種進(jìn)化等方面具有重大意義，而且有助于了解更為復(fù)雜的真核生物中的一些重要生物學(xué)過程。從生物技術(shù)的角度看，通常生長(zhǎng)在極端環(huán)境條件下的古菌所產(chǎn)生的極端酶比普通酶更能耐受嚴(yán)酷條件(如高溫、酸堿、有機(jī)溶劑等)，因而古菌在許多領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。極端嗜鹽古菌在系統(tǒng)進(jìn)化樹中位于古菌域的一個(gè)分支-廣古菌門，它能生長(zhǎng)在含有約2-5M NaCl的近飽和鹽濃度(如曬鹽場(chǎng)、鹽湖和死海等)的環(huán)境中，且具有古菌的特質(zhì)，極端嗜鹽古菌日益引起生物學(xué)家的關(guān)注。另外，極端嗜鹽古菌極具開發(fā)前景，如在這類微生物中存在大量可供開發(fā)的極端酶類、生物活性物質(zhì)、可生物降解的塑料PHA和可作為納米生物材料用于構(gòu)造生物分子器件的紫膜等。近年雖然在分子遺傳學(xué)方面有些進(jìn)展，比如Polyethylene glycol (PEG,聚乙二醇)介導(dǎo)的極端嗜鹽古菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法的建立、基因敲除，基因互補(bǔ)和定點(diǎn)突變等技術(shù)在極端嗜鹽古菌中的應(yīng)用，但僅局限在某些種屬中，不具有普遍適用性，從而限制了對(duì)其他菌株的深入研究。另外，一般用于極端嗜鹽古菌抗性選擇的主要是新生霉素、茴香霉素、莫維諾林和硫鏈絲菌素等，但這些抗性選擇標(biāo)記基因多來源于菌體自身基因突變后克隆得到的，應(yīng)用于整合質(zhì)粒載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)化后，易發(fā)生與菌體相應(yīng)的內(nèi)源基因發(fā)生高頻同源重組，導(dǎo)致假陽性轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)生。且這些抗生素的選擇壓力較弱，常常得不到轉(zhuǎn)化子。這種情況，極大地阻礙了對(duì)嗜鹽古菌的深入系統(tǒng)的理論研究和基因工程開發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種重組嗜鹽古菌。本發(fā)明所提供的重組嗜鹽古菌，按照包括如下步驟的方法制備得到使含有SEQID NO :1所示蛋白的編碼基因的出發(fā)嗜鹽古菌中的SEQ ID NO :1所示蛋白的編碼基因的功能喪失，得到的重組菌為所述重組嗜鹽古菌。上述任一所述重組嗜鹽古菌中，所述含有SEQ ID NO 1所示蛋白的編碼基因的出發(fā)嗜鹽古菌為西班牙鹽盒菌(Haloarcula hispanica)。
上述任一所述重組嗜鹽古菌中，所述西班牙鹽盒菌(Haloarcula hispanica)為保藏編號(hào)為CGMCC1. 2049的西班牙鹽盒菌(Haloarcula hispanica)。上述任一所述重組嗜鹽古菌中，所述使含有SEQ ID NO :1所示蛋白的編碼基因的出發(fā)嗜鹽古菌中的SEQ ID NO :1所示蛋白的編碼基因的功能喪失為敲除所述出發(fā)嗜鹽古菌中的SEQ ID NO : I所示蛋白的編碼基因；上述任一所述重組嗜鹽古菌中，所述敲除是通過同源重組實(shí)現(xiàn)的；上述任一所述重組嗜鹽古菌中，所述同源重組通過如下同源重組載體實(shí)現(xiàn)所述同源重組載體按照包括如下步驟的方法構(gòu)建將SEQ ID NO :2中第1-585位核苷酸所示DNA沿著從PstI至BamHI的方向插在載體pUBP的PstI和BamHI位點(diǎn)間，得到的重組載體記作中間重組載體；將SEQ ID NO 2中第1395-1942位核苷酸所示DNA沿著從BamHI至KpnI的方向插在載體PUBP的BamHI和KpnI位點(diǎn)間，得到的重組載體即為所述同源重組載體；上述任一所述重組嗜鹽古菌中，所述SEQ ID NO :1所示蛋白的編碼基因?yàn)槿缦翴)或2)或3)或4)所示I)其核苷酸序列是SEQ ID NO :2中自Y末端第597-1430位核苷酸所示DNA分子;2)其核苷酸序列是SEQ ID NO :2中自5'末端第477-1430位核苷酸所示DNA分子;3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；4)與I)或2)限定的DNA序列具有90 %以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種試劑盒。本發(fā)明所提供的試劑盒，包括上述任一所述的重組嗜鹽古菌和如下重組質(zhì)粒載體；所述重組質(zhì)粒載體中至少含有供外源基因插入的多克隆位點(diǎn)和如下其它三個(gè)元件在大腸桿菌中復(fù)制所需的復(fù)制原點(diǎn)、用于篩選大腸桿菌轉(zhuǎn)化子的抗性選擇標(biāo)記基因的表達(dá)盒、SEQ ID NO :1所示蛋白的編碼基因的表達(dá)盒、供外源基因插入的多克隆位點(diǎn)；所述供外源基因插入的多克隆位點(diǎn)不與所述其它三個(gè)元件重疊。上述試劑盒中的重組質(zhì)粒載體中既含有大腸桿菌質(zhì)粒復(fù)制子(即在大腸桿菌中復(fù)制所需的復(fù)制原點(diǎn))又含有用于篩選大腸桿菌轉(zhuǎn)化子的抗性選擇標(biāo)記基因的表達(dá)盒，方便在大腸桿菌中進(jìn)行基因操作及在嗜鹽古菌中進(jìn)行遺傳操作。上述任一所述試劑盒中，所述重組質(zhì)粒載體優(yōu)選如下所述重組質(zhì)粒載體中的各個(gè)元件之間的排列順序沒有要求，但各個(gè)元件之間不相互重疊。上述任一所述試劑盒中，所述重組質(zhì)粒載體按照包括如下步驟的方法制備得到將SEQ ID NO 2中第477-1430位核苷酸所示基因插在載體pUBP的多克隆位點(diǎn)間，得到的重組載體即為所述重組質(zhì)粒載體。上述任一所述試劑盒中，所述重組載體具體按照包括如下步驟的方法制備得到 將SEQ ID NO 2中第477-1430位核苷酸所示基因沿著從EcoRI至KpnI的方向插在載體PUBP的EcoRI和KpnI位點(diǎn)間，得到的重組載體即為所述重組質(zhì)粒載體。該質(zhì)粒的物理圖譜如圖I所示，其多克隆位點(diǎn)包括的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)有SphI，PstI, BamHI, KpnI和EcoRI等酶切位點(diǎn)各一個(gè)，兩個(gè)HindIII酶切位點(diǎn)。這些內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)可以方便的進(jìn)行外源片段的克隆及其衍生載體的構(gòu)建。上述任一所述試劑盒中，所述試劑盒中包括篩選培養(yǎng)基I和/或篩選培養(yǎng)基II ；每I升所述篩選培養(yǎng)基I由酸水解酪素、谷氨酸鈉、檸檬酸鈉、NaCUMgSO4 · 7H20、KC1、FeSO4 · 7H20、MnCl2 · 4H20、尿嘧啶、5-F0A和水組成，其中各組分在所述篩選培養(yǎng)基I中的濃度為酸水解酪素5. Og/L、谷氨酸鈉1.0g/L、檸檬酸鈉3. Og/L、NaCl 200g/L、MgSO4 ·7Η20 20g/L、KCl 2. Og/L、FeSO4 ·7Η20 0. 36g/L、MnCl2 ·4Η20 0. 36mg/L、尿嘧啶 50mg/L、5-F0A 150mg/L ;所述篩選培養(yǎng)基I的pH值為7· 1-7. 2 ；(此為篩選雙交換菌株的培養(yǎng)基)每I升所述篩選培養(yǎng)基II由酸水解酪素、谷氨酸鈉、檸檬酸鈉、NaCUMgSO4 ·7Η20、KCUFeSO4 · 7Η20,MnCl2 · 4Η20和水組成，其中各組分在所述篩選培養(yǎng)基II中的濃度為酸水解酪素 5. Og/L、谷氨酸鈉 I. 0g/L、檸檬酸鈉 3. 0g/L、NaCl 200g/L、MgSO4 · 7H20 20g/L、
KCl 2. 0g/L、FeSO4 · 7H20 0. 36g/L、MnCl2 · 4H20 0. 36mg/L ;所述篩選培養(yǎng)基 II 的 pH 值為
7.1-7. 2。(此為篩選單交換菌株的培養(yǎng)基)上述任一所述試劑盒在如下I)或2)或3)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍I)敲除上述任一所述重組嗜鹽古菌的基因組中目的基因；2)在上述任一所述重組嗜鹽古菌中過表達(dá)外源基因；3)研究菌(Haloarcula hispanica)的基因組中待測(cè)基因的功能。 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種蛋白及其編碼基因。本發(fā)明所提供的蛋白，是如下a)或b)的蛋白質(zhì)a)由SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)將SEQ ID NO :I所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有乳清酸核苷-5'-單磷酸脫羧酶活性的由a)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明所提供的蛋白的編碼基因?yàn)槿缦翴)或2)或3)或4)所示I)其核苷酸序列是SEQ ID NO :2中自Y末端第597-1430位核苷酸所示DNA分子;2)其核苷酸序列是SEQ ID NO :2中自Y末端第477-1430位核苷酸所示DNA分子;3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；4)與I)或2)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。含有上述任一所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組病毒或表達(dá)盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；SEQ ID NO :1所示蛋白的編碼基因在基因工程中作為選擇標(biāo)記的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述基因工程是與含有SEQ ID NO :1所示蛋白的編碼基因的極端嗜鹽古菌相關(guān)的基因工程。所述SEQ ID NO 1所示蛋白的編碼基因?yàn)槿缦翴)或2)或3)或4)所示I)其核苷酸序列是SEQ ID NO :2中自Y末端第597-1430位核苷酸所示DNA分子;2)其核苷酸序列是SEQ ID NO :2中自Y末端第477-1430位核苷酸所示DNA分子;3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；4)與I)或2)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。本發(fā)明的遺傳操作系統(tǒng)，包含2個(gè)組分，一部分為整合質(zhì)粒載體pHAR，另一部分為Har. hispanica ApyrF尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型宿主菌。該遺傳操作系統(tǒng)可作為一個(gè)高效的基因敲除系統(tǒng)，可以對(duì)Har. hispanica進(jìn)行廣泛的基因功能研究和代謝途徑闡明。實(shí)驗(yàn)證明，用本發(fā)明系統(tǒng)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化獲得陽性重組子的頻率大大提高。本發(fā)明豐富了嗜鹽古菌中的選 擇標(biāo)記基因，增加選擇的壓力，易于陽性轉(zhuǎn)化子的篩選，利于對(duì)嗜鹽古菌展開系統(tǒng)的大規(guī)模的功能基因組學(xué)分析，并從中發(fā)現(xiàn)嗜鹽古菌這個(gè)群體中共性和個(gè)性的遺傳代謝、進(jìn)化生態(tài)、物種起源等的機(jī)理。本發(fā)明為極端嗜鹽古菌的研究和開發(fā)提供了重要工具，將在極端嗜鹽古菌的研究和開發(fā)中發(fā)揮重要作用。


圖I為整合質(zhì)粒載體pHAR構(gòu)建過程示意2為PyrF蛋白氨基酸序列與Halobacterium sal inarum Ura3蛋白(NCBI編號(hào)AF187997)多序列比對(duì)示意圖 圖3為pyrF基因RT-PCR的瓊脂糖凝膠電泳圖譜圖4為利用pHAR整合質(zhì)粒載體敲除目的基因原理不意5為pyrF基因上下游結(jié)構(gòu)圖與Har. hispanica ApyrF突變體PCR鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖及Southern blot驗(yàn)證結(jié)果圖6為crtB基因上下游結(jié)構(gòu)圖與Har. hispanica A pyrF A crtB突變體PCR鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖及Southern blot驗(yàn)證結(jié)果
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。西班牙鹽盒菌(Haloarcula hispanica) CGMCC I. 2049購自中國(guó)普通微生物菌種保藏中心(CGMCC)。pUCm-T載體購自Beyotime，產(chǎn)品目錄號(hào)為D2006。載體pUBP 在文獻(xiàn)“Han, J. , Q. Lu, et al. (2007). " Molecular characterizationof the phaEC(Hm), genes, required for biosynthesis of poly(3-hydroxybutyrate)in the extremely halophilic Archaeon Haloarcula marismortui " Applied andEnvironmental MicrobioloRY 73(19) :6058-6065. ”中公開過,公眾可從中國(guó)科學(xué)院微生物研究所獲得。實(shí)施例I、乳清酸核苷-5'-單磷酸脫羧酶PyrF及其編碼基因的獲得對(duì)西班牙鹽盒菌(Haloarcula hispanica)CGMCC I. 2049進(jìn)行基因組測(cè)序,研究其結(jié)構(gòu)，結(jié)果該基因組中有一個(gè)orf被注釋為pyrF。設(shè)計(jì)一對(duì)引物P1/P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增pyrF編碼基因及其啟動(dòng)子序列，引物序列如下
Pl 5f TATGAATTCGAGCGGGCTTCTACCTGC3' (EcoRI)P2:5' GGCGGTACCTTAGCGGAACTGATTCAG3' (KpnI)以西班牙鹽盒菌(Haloarcula hispanica) CGMCC I. 2049的基因組為模板,用引物對(duì)Pl和P2為上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到954bp長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物。上述PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C 3min預(yù)變性；然后94°C 30s、57°C 30s,72°C 60s進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72°C再延伸7min。擴(kuò)增體系為25 yl。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段連接到pUCm-T載體上進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明在pUCm_T載體中插入的基因序列如SEQ ID NO :2中自5'端第477-1430位核苷酸所示，其中SEQ IDNO :2第477-596位核苷酸為基因PyrF的啟動(dòng)子區(qū)域，第597-1430位核苷酸為基因PyrF的 編碼框，第567-573位核苷酸序列為啟動(dòng)子核心序列；基因PyrF編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示(記作PyrF蛋白)。表明引物對(duì)P1/P2擴(kuò)增得到了 954bp的序列，正確。實(shí)施例2、pyrF基因功能鑒定每升AS-168培養(yǎng)基按照如下方法制備將5. Og酸水解酪素(casamino acids),
5.Og 酵母提取物(yeast extract), I. Og 谷氨酸鈉(sodium glutamate), 3. Og 朽1 檬酸鈉，200g NaCl，20g MgSO4 7H20, 2. Og KCl，0. 36g FeSO4 7H20 和 0. 36mg MnCl2 4H20 溶于蒸餾水中，用蒸餾水定容至I升，pH 7. 1-7. 2。酸水解酪素購自Bacto Difco，產(chǎn)品目錄號(hào)為223120。酵母提取物購自0X0ID，產(chǎn)品目錄號(hào)為L(zhǎng)P0021。I. RT-PCR 檢測(cè) Har. hispanica CGMCC I. 2049 中 pyrF 基因的轉(zhuǎn)錄情況。I)培養(yǎng)條件挑取 Har. hispanica CGMCC I. 2049 單菌落于 AS-168 培養(yǎng)基 37°C搖床，200rpm，培養(yǎng)4天。2) RNA 提取取滅菌的 I. 5ml EP 管收集 I. 5ml 菌液，4°C，12000rpm，離心 lmin，用移液槍吸盡上清。加入Iml TRIzol試劑(invitrogen)裂解菌體,有機(jī)溶劑抽提去除細(xì)胞碎片、脂類和蛋白，得到總RNA，溶解于20-30 ill DEPC水中。取1.5iil RNA溶液加入到300 u I TE溶液中，用Beckman DU800測(cè)定其濃度，對(duì)照為300 yl TE加入1.5iil DEPC水。測(cè)得0D260/280為2. 02，說明RNA的純度符合下一步的實(shí)驗(yàn)要求。計(jì)算得到RNA的濃度為
6.28 u g/U I。取總 RNA 15 u g用 RNase-free RQl DNase (Promega)處理，50 U L 體系(DNasebuffer 5 u I, DNase 5u 1,15u g RNA, DEPC 水補(bǔ)足至 50 y I)，37°C 反應(yīng) 4_5h ;70°C，IOmin失活DNase，以此作為RT模板。3) RT-PCR 檢測(cè)根據(jù)pyrF的核苷酸序列，設(shè)計(jì)一對(duì)RT-PCR引物pyrFRTF/pyrFRTR,引物序列如下pyrFRTF :5' AGTTCAACCGCCGCATCAT3'pyrFRTR 5' GGAGAAACGGCTCCAACGAG3'以DNase消化后的RNA為模板，利用OneStep RT-PCR試劑盒(Qiagen公司)，根據(jù)說明書步驟進(jìn)行RT-PCR。程序分為兩步第一步，利用RT-PCR后引物pyrFRTR，以總RNA為模板，將目的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA ;第二步，利用引物對(duì)pyrFRTF/pyrFRTR，以上步的cDNA為模板，進(jìn)行PCR。以未經(jīng)Dnase消化的總RNA作陰性對(duì)照。結(jié)果如圖3所示泳道I為RT-PCR條帶279bp ;泳道2為未經(jīng)Dnase消化的總RNA模板陰性對(duì)照；泳道M為IOObpDNAladdermarker。從圖3可以看出pyrF基因是活躍轉(zhuǎn)錄的。另外,通過檢索基因組注釋，發(fā)現(xiàn)該基因在基因組中僅有一個(gè)拷貝，有利于后續(xù)基因的敲除、互補(bǔ)和營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的獲得。2.敲除pyrF基因，以獲得尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型宿主I)敲除pyrF基因的同源重組整合質(zhì)粒載體pUBP A pyrF的構(gòu)建<1>用于敲除pyrF的同源重組雙交換臂的PCR擴(kuò)增根據(jù)SEQ ID NO 2中pyrF基因編碼序列及其上下游核苷酸序列，設(shè)計(jì)了兩對(duì)雙交換臂的擴(kuò)增引物 pyrFFl/pyrFRl 和 pyrFF2/pyrFR2 pyrFFl :5' ATACTGCAGCGACTCGGCTCGGCAATA3' (PstI)
pyrFRl :5' AATGGATCCCGGCTGGCAGCGATACAA3' (BamHI)pyrFF2 :5' GCGGGATCCAAACAGCTCAAACAGCGACTG3' (BamHI)pyrFR2 :5' GCTGGTACCCCAGCATTCCGAGTATCCA3' (KpnI)以Har. hispanica CGMCC I. 2049 的基因組 DNA 為模板，用引物對(duì) pyrFFl/pyrFRl擴(kuò)增破壞PyrF的雙交換左臂585bp，如圖5A所示。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C 3min預(yù)變性；94°C 30s,57°C 30s,72°C 40s 進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 7min。擴(kuò)增體系為 25 y I。將 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段連接到PUCm-T載體上進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明引物對(duì)pyrFFl/pyrFRl擴(kuò)增得到了 585bp的序列，具有SEQ ID NO :2的自5'端第1-585位核苷酸序列；以Har. hispanica CGMCC I. 2049 的基因組 DNA 為模板，用引物對(duì) pyrFF2/pyrFR2擴(kuò)增敲除PyrF的雙交換右臂548bp，如圖5A所示。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C 3min預(yù)變性；94°C 30s,57°C 30s,72°C 40s 進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 7min。擴(kuò)增體系為 25 y I。將 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段連接到PUCm-T載體上進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明引物對(duì)pyrFF2/pyrFR2擴(kuò)增得到了 548bp的序列，具有SEQ ID NO 2的自5'端第1395-1941位核苷酸序列。<2>敲除pyrF的整合質(zhì)粒載體pUBP A pyrF的構(gòu)建將經(jīng)限制性內(nèi)切酶PstI和BamHI雙酶切的載體pUBP和PCR產(chǎn)物左臂585bp，T4DNA ligase 16°C連接過夜，然后熱激轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)，在含有氨芐青霉素抗性的平板上進(jìn)行篩選，將獲得的陽性克隆進(jìn)行測(cè)序；測(cè)序結(jié)果表明片段585bp (其核苷酸序列為序列表中序列2的自5'末端第1-585位核苷酸序列)已經(jīng)正確插入載體pUBP的PstI和BamHI位點(diǎn)間(沿著從PstI至BamHI的方向)，將其命名為重組載體PUBP585。將經(jīng)BamHI和KpnI雙酶切的重組載體pUBP585和PCR產(chǎn)物右臂548bp，連接酶T4 DNA ligase 16°C連接過夜，然后熱激轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)，在含有氨芐青霉素抗性的平板上進(jìn)行篩選，將獲得的陽性克隆進(jìn)行測(cè)序；結(jié)果表明片段548bp (其核苷酸序列為序列表中序列2的自5'末端第1395-1942位核苷酸序列)已經(jīng)正確插入載體PUBP585的BamHI和KpnI位點(diǎn)間(沿著從BamHI至KpnI的方向)，得到含有左臂585bp和右臂548bp的雙交換整合質(zhì)粒載體，并將其命名為pUBP A pyrF。該質(zhì)粒中左臂585bp和右臂548bp連在一起構(gòu)成的片段記作A pyrF。2)構(gòu)建pyrF缺失營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株Har. hispanica A pyrF利用pUBP ApyrF的雙交換臂與Har. hispanica基因組中的pyrF進(jìn)行同源重組，敲除pyrF基因，具體步驟如下所述<1> 整合質(zhì)粒載體 pUBP A pyrF 轉(zhuǎn)化 Har. hispanica米用文獻(xiàn)(Cline,S. W. , W. L. Lam, et al. (1989). " Transformation methods forhalophilic archaebacteria. " Can I Microbiol 35(1) :148-152.)所述PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，將pUBP A pyrF轉(zhuǎn)化Har. hispanica CGMCC I. 2049，轉(zhuǎn)化后在含有5mg/L莫維諾林的AS-168 (AS-168培養(yǎng)基+5mg/L莫維諾林)固體平板上篩選轉(zhuǎn)化子，能在含有5mg/L莫維諾林的AS-168上生長(zhǎng)的克隆即為成功轉(zhuǎn)入pUBP A pyrF的重組菌。<2>篩選和驗(yàn)證pUBP A pyrF發(fā)生整合的單交換菌株對(duì)步驟〈I >得到的轉(zhuǎn)化子分別進(jìn)行PCR驗(yàn)證抽取總DNA，以引物對(duì)pyrFFI/ pyrFR2 進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?4°C 3min 預(yù)變性；94°C 30s,57°C 30s,72°C 60s 進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72°C延伸7min。擴(kuò)增體系為25 yl。產(chǎn)生1942bp和1133bp條帶的菌為目的
單交換菌株。單交換篩選原理發(fā)生單交換時(shí)，pUBP A pyrF質(zhì)粒整合入Har. hispanica基因組同源區(qū)域，在單交換菌株中存在一個(gè)拷貝的完整的pyrF基因和一個(gè)拷貝的ApyrF，以引物對(duì)pyrFFl/pyrFR2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以完整的pyrF基因?yàn)槟０?，擴(kuò)增得到1942bp，以ApyrF為模板，擴(kuò)增得到1133bp，因此，以單交換菌株的基因組為模板可擴(kuò)增出大小分別為1942bp和1133bp的兩條帶。PCR鑒定結(jié)果如圖5B所示泳道I為單交換菌；泳道3為pUBP ApyrF質(zhì)粒陽性對(duì)照；泳道4為Har. hispanica CGMCC I. 2049野生型陰性對(duì)照。從圖中看出，陰性對(duì)照的的PCR產(chǎn)物大小1942bp，陽性對(duì)照的PCR產(chǎn)物大小1133bp，泳道I的PCR產(chǎn)物大小分別為1942bp和1133bp,說明對(duì)應(yīng)的菌株為pUBP A pyrF質(zhì)粒發(fā)生單交換整合入Har. hispanica基因組同源區(qū)域的重組菌株。以其基因組為模板可擴(kuò)增出大小分別為1942bp和1133bp的兩條帶，表明得到正確的發(fā)生單交換整合的Har. hispanica重組菌株。<3> 雙交換菌株 Har. hispanica A pyrF 的篩選將步驟〈2>篩選到的pyrF單交換菌株在不含莫維諾林的液體AS-168培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)50代，重復(fù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)4次后將傳代培養(yǎng)的培養(yǎng)液稀釋IO7涂布固體AS-168培養(yǎng)基 平板，培養(yǎng)一周左右。挑取單克隆同時(shí)在AS-168固體平板上及含5mg/L莫維諾林的AS-168的固體培養(yǎng)基上劃線。一周后，挑取在抗性平板(含5mg/L莫維諾林的AS-168的固體培養(yǎng)基)上不生長(zhǎng)但在非抗性平板(AS-168固體平板)上生長(zhǎng)的單菌落，即為目的雙交換菌株，記作重組菌 Har. hispanica A pyrF。PCR驗(yàn)證抽提重組菌Har. hispanica A pyrF的基因組DNA作為模板，同樣以引物對(duì)pyrFFl/pyrFR2進(jìn)行PCR驗(yàn)證，反應(yīng)體系和條件與篩選單交換菌株相同。擴(kuò)增只得到1133bp —條帶的菌株為目的雙交換菌株。Southern blot 驗(yàn)證參照 DIG-High Prime DNA Labeling and DetectionStarter Kit I (Roche)說明書進(jìn)行,先提取重組菌Har. hispanica A pyrF的基因組DNA及對(duì)照菌株Har. hispanica野生型的基因組DNA，用限制性內(nèi)切酶PstI進(jìn)行消化，消化后的 產(chǎn)物用于雜交(圖5A)。Southern blot中使用的探針為上述pyrF的雙交換右臂585bp片段，并用地高辛標(biāo)記。雜交得到2473bp條帶的菌株為雙交換菌株，雜交得到3282bp條帶的菌株為Har. hispanica野生型菌株。
PCR鑒定結(jié)果如圖5B所示泳道2為雙交換菌株。泳道2中顯示PCR產(chǎn)物大小為1133bp,說明對(duì)應(yīng)的菌株為發(fā)生雙交換導(dǎo)致pyrF基因缺失的Har. hispanica。Southernblot鑒定結(jié)果,見圖5C。泳道I為野生型,泳道2為雙交換菌株。Southern blot結(jié)果顯不雙交換菌株僅含有2473bp小片段，野生型對(duì)照菌株含有3282bp大片段，表明得到的目的雙交換菌株正確。整合質(zhì)粒載體pUBP A pyrF中的SEQ ID NO 2中第1-585位核苷酸所示DNA和SEQID NO 2中第1395-1942位核苷酸所示DNA與Har. hispanica中的完整基因pyrF發(fā)生同源重組，使缺失突變株Har. hispanica ApyrF中缺失了基因pyrF中的SEQ ID NO :2中第586-1394位核苷酸。<4>Har. hispanica A pyrF 對(duì) 5_ 氟乳清酸(5-F0A)抗性檢測(cè)每升AS-168SY培養(yǎng)基按照如下方法制備將5. Og酸水解酪素，I. Og谷氨酸鈉，3. Og 檸檬酸鈉，200g NaCl，20g MgSO4 7H20, 2. Og KCl，0. 36g FeSO4 7H20 和 0. 36mg MnCl2 4H20溶于蒸餾水，用蒸餾水容至I升，得到的混合物即為AS-168SY培養(yǎng)基，用IOMNaOH 手動(dòng)調(diào)節(jié) pH 7. 1-7. 2。將Har. hispanica A pyrF 和 Har. hispanica CGMCC I. 2049 野生型分別劃線于添加終濃度為50 ii g/ml尿嘧啶(UraciI)和終濃度為150 y g/ml 5-氟乳清酸(5-Fluoroorotic acid，5_F0A)的AS-168SY培養(yǎng)基，于37°C培養(yǎng)，一周后觀察菌的生長(zhǎng)情況。結(jié)果Har. hispanica A pyrF突變體獲得了 5-F0A抗性，為尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，而野生型菌株受到抑制，不能長(zhǎng)出單菌落，為尿卩密唳原養(yǎng)型。這是因?yàn)椋琀ar. hispanicaCGMCC I. 2049體內(nèi)存在從頭合成尿嘧啶核苷酸的途徑，因而能以5-F0A(5_fIuorooroticacid)為底物代謝產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞有毒性的5-氟尿嘧啶(5-FU，5-f Iuorouraci I)，因此野生型菌株在含有5-F0A的培養(yǎng)基中不能存活；而基因pyrF(0rotidine 5 ' -phosphatedecarboxylase)正是尿卩密唳核苷酸合成途徑最后一步的關(guān)鍵酶，Har. hispanica A pyrF中缺失了 PyrF基因，失去了尿嘧啶核苷酸合成能力，并失去了催化5-F0A產(chǎn)生細(xì)胞毒性化合物5-FU能力，因而Har. hispanica A pyrF能在有5-F0A的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，并且培養(yǎng)基中需要含有尿嘧啶。pUBP這個(gè)質(zhì)粒不具備在Har. hispanica CGMCC I. 2049中復(fù)制的復(fù)制子，因而不能單獨(dú)轉(zhuǎn)，只能在克隆入同源片段后靠同源重組才能整合進(jìn)基因組。上述實(shí)驗(yàn)只是提供了一個(gè)間接證據(jù)，證明該基因pyrF確實(shí)在尿嘧啶核苷酸合成途徑中起作用，而圖2的蛋白多序列比對(duì)結(jié)果顯示，PyrF蛋白序列與已報(bào)道的Hbt.Salinarum中的Ura3有69%的序列相似性,可以證明該基因確實(shí)編碼乳清苷-5'-單磷酸脫羧酶。pyrF基因功能的闡明，有助于后續(xù)敲除和表達(dá)載體的構(gòu)建，可以作為一個(gè)十分有效地選擇標(biāo)記基因應(yīng)用于其他遺傳操作系統(tǒng)。實(shí)施例3、構(gòu)建基于pyrF基因的整合質(zhì)粒載體pHAR將實(shí)施例I中PUCm-PyrF (含pyrF全長(zhǎng)且含自身啟動(dòng)子)用限制性內(nèi)切酶EcoRI和KpnI雙酶切并切膠回收目的基因pyrF片段；將載體pUBP用限制性內(nèi)切酶EcoRI和KpnI雙酶切，回收載體大片段，將載體大片段與目的基因pyrF片段用T4 DNA ligase 16°C連接過夜，構(gòu)建過程如圖I所示。然后熱激轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)，在含有氨芐青霉素抗性的平板上進(jìn)行篩選，將獲得的陽性克隆快抽檢測(cè)，并提質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果在載體PUBP的EcoRI和KpnI位點(diǎn)間沿著從EcoRI至KpnI的方向插入了 SEQ ID NO 2中第477-1430位核苷酸所示基因，表明構(gòu)建的重組載體正確，將陽性重組載體記作pHAR。載體pHAR中含有如下四個(gè)元件在大腸桿菌中復(fù)制所需的復(fù)制原點(diǎn)，即大腸桿菌質(zhì)粒復(fù)制子E. coii ori ;用于篩選大腸桿菌轉(zhuǎn)化子的抗性選擇標(biāo)記基因AmpK(氨芐青霉素抗性基因)的表達(dá)盒；乳清苷-5'-單磷酸脫羧酶的編碼基因pyrF的表達(dá)盒；供外源基因插入的多克隆位點(diǎn)。上述四個(gè)元件均不相互重疊，各個(gè)元件之間的排列順序沒有特別要求。該載體pHAR的物理圖譜如圖I所示，其多克隆位點(diǎn)包括的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)有SphI，PstI，BamHI，KpnI和EcoRI等酶切位點(diǎn)各一個(gè)，兩個(gè)HindIII酶切位點(diǎn)；這些內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)可以方便的進(jìn)行外源片段的克隆及其衍生載體的構(gòu)建。多克隆位點(diǎn)在基因pyrF的表達(dá)盒的上游，不與大腸桿菌中復(fù)制所需的復(fù)制原點(diǎn)、抗性選擇標(biāo)記基因AmpK(氨芐青霉素抗性基因)的表達(dá)盒和乳清苷-5'-單磷酸脫羧酶的編碼基因pyrF的表達(dá)盒重疊。載體pHAR中，既含有大腸桿菌質(zhì)粒復(fù)制子(即在大腸桿菌中復(fù)制所需的復(fù)制原 點(diǎn))又含有用于篩選大腸桿菌轉(zhuǎn)化子的抗性選擇標(biāo)記基因的表達(dá)盒)，方便在大腸桿菌中進(jìn)行基因操作及在嗜鹽古菌中進(jìn)行遺傳操作。載體pHAR中不具備在Har. hispanica CGMCC I. 2049中復(fù)制的復(fù)制子，但可以在克隆入同源片段后靠同源重組整合入Har. hispanica的基因組。該載體中pyrF基因可以賦予Har. hispanica A pyrF尿卩密唳核苷酸從頭合成能力，因而能在尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基AS-168SY上生長(zhǎng)，因而達(dá)到正向選擇轉(zhuǎn)化子的目的。至此,整合質(zhì)粒載體pHAR結(jié)合實(shí)施例2中敲除得到的Har. hispanica A pyrF尿喃唳營(yíng)養(yǎng)缺陷型宿主菌組成了一個(gè)高效的基因敲除系統(tǒng)，可以對(duì)Har. hispanica進(jìn)行廣泛的基因功能研究和代謝途徑闡明。Har. hispanica A pyrF和載體pHAR組成遺傳操作系統(tǒng)的原理Har. hispanica內(nèi)存在從頭合成尿嘧啶核苷酸的途徑，因而能以5-F0A(5-fluOrOOrOtiC acid)為底物代謝產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞有毒性的5-氟尿嘧啶(5-FU，5-fIuorouraciI)。而pyrF(Orotidine5' -phosphate decarboxylase)正是尿卩密唳核苷酸合成途徑最后一步的關(guān)鍵酶,該基因缺失突變后的菌將失去尿嘧啶核苷酸合成能力和失去催化5-F0A產(chǎn)生細(xì)胞毒性化合物5-FU能力，從而Har. hispanica ApyrF能在含有5-F0A的培養(yǎng)基上生長(zhǎng),野生型卻不能。將含有外源基因的待整合質(zhì)粒載體pHAR轉(zhuǎn)化Har. hispanica A pyrF后，首先質(zhì)粒載體pHAR與Har. hispanica ApyrF發(fā)生單交換,然后再發(fā)生雙交換,最后實(shí)現(xiàn)目的基因的敲除。實(shí)施例4、系統(tǒng)的應(yīng)用-敲除八氫番茄紅素合成酶crtB基因利用Har. hispanica A pyrF 和 pHARAcrtB 敲除 Har. hispanica A pyrF 中的 crtB基因，具體步驟如下I、敲除crtB的整合質(zhì)粒載體pHAR A crtB的構(gòu)建I)用于敲除crtB的同源重組雙交換臂的PCR擴(kuò)增根據(jù)SEQ ID NO :3中crtB基因編碼序列及其上下游核苷酸序列，設(shè)計(jì)了兩對(duì)雙交換臂的擴(kuò)增引物 crtBFl/crtBRl 和 crtBF2/crtBR2 crtBFl:5' ATTGGTACCAAGCGTGGTCGAGCAGGTCC3' (KpnI)crtBRl :5' TTAGGATCCCGTCGCGCACTTGTCGGCAG3' (BamHI)
crtBF2 5f AATGGATCCCAGCCACGCACCGGGTATCG3' (BamHI)crtBR2:5' ATACTGCAGCGCCGACGGTCCGCCACTCC3' (PstI)以Har. hispanica CGMCC I. 2049 的 DNA 為模板，用引物對(duì) crtBFl/crtBRl 擴(kuò)增破壞crtB的雙交換左臂517bp，如圖6A所示。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C 3min預(yù)變性；94°C 30s、57 °C 30s、72 °C 30s進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72°C延伸7min。擴(kuò)增體系為25 yl。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段連接到PUCm-T載體上進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié) 果表明引物對(duì)crtBFl/crtBRl擴(kuò)增得到了 504bp的序列，具有SEQ ID NO 3的自5'端第1-517位核苷酸序列；以Har. hispanica CGMCC I. 2049 的 DNA 為模板，用引物對(duì) crtBF2/crtBR2 擴(kuò)增敲除crtB的雙交換右臂528bp，如圖6A所示。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C 3min預(yù)變性；94°C 30s、57 °C 30s, 72 °C 30s進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72°C延伸7min。擴(kuò)增體系為25 yl。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段連接到PUCm-T載體上進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明引物對(duì)crtBF2/crtBR2擴(kuò)增得到了 562bp的序列，具有SEQ ID NO 3的自5'端第1524-2085位核苷酸序列。2)敲除crtB的整合質(zhì)粒載體pHAR A crtB的構(gòu)建將經(jīng)限制性內(nèi)切酶KpnI和BamHI雙酶切的載體pHAR和PCR產(chǎn)物左臂517bp，T4DNA ligase 16°C連接過夜，然后熱激轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)，在含有氨芐青霉素抗性的平板上進(jìn)行篩選，將獲得的陽性克隆進(jìn)行測(cè)序；測(cè)序結(jié)果表明片段517bp (其核苷酸序列為序列表中序列3的自5'末端第1-517位核苷酸序列)已經(jīng)正確插入載體pHAR的KpnI和BamHI位點(diǎn)間(沿著從KpnI和BamHI的方向)，將其命名為重組載體PHAR517。將經(jīng)BamHI和PstI雙酶切的重組載體pHAR517和PCR產(chǎn)物右臂562bp，連接酶T4 DNA ligase 16°C連接過夜，然后熱激轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)，在含有氨芐青霉素抗性的平板上進(jìn)行篩選，將獲得的陽性克隆進(jìn)行測(cè)序；結(jié)果表明片段528bp (其核苷酸序列為序列表中序列3的自5'末端第1524-2085位核苷酸序列)已經(jīng)正確插入載體PHAR517的BamHI和PstI位點(diǎn)間(沿著從BamHI至PstI的方向)，得到含有左臂517bp和右臂562bp的雙交換整合質(zhì)粒載體，并將其命名為pHAR A crtB。左臂517bp和右臂562bp —起構(gòu)成重組片段,記作A crtB。2、敲除 Har. hispanica A pyrF 中的 crtB利用pHARAcrtB的雙交換臂與Har. hispanica A pyrF基因組中的crtB進(jìn)行同源重組以敲除crtB基因(原理示意圖見圖4)，構(gòu)建crtB缺失突變株Har.hispanica A pyrF A crtB,具體步驟如下I)單交換菌株的構(gòu)建、篩選及驗(yàn)證方法米用文獻(xiàn)(Cline,S. W. , W. L. Lam, et al. (1989). " Transformation methods forhalophilic archaebacteria. " Can .I Microbiol 35(1) :148-152.)所述PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，將pHAR A crtB轉(zhuǎn)化Har. hispanica A pyrF,轉(zhuǎn)化后涂布篩選培養(yǎng)基II固體平板,在該固體平板上能正常生長(zhǎng)的菌為發(fā)生單交換的菌。每I升所述篩選培養(yǎng)基II由酸水解酪素、谷氨酸鈉、檸檬酸鈉、NaCl、MgS04 *7H20、KCUFeSO4 7H20,MnCl2 4H20和水組成，其中各組分在所述篩選培養(yǎng)基II中的濃度為酸水解酪素 5. 0g/L、谷氨酸鈉 I. 0g/L、檸檬酸鈉 3. 0g/L、NaCl 200g/L、MgS04 7H2020g/L、KCl2. 0g/L、FeSO4 7H20 0. 36g/L、MnCl2 4H20 0. 36mg/L ;所述篩選培養(yǎng)基 II 的 pH 值為 7. I。(此為篩選單交換菌株的培養(yǎng)基)單交換菌株驗(yàn)證進(jìn)行PCR驗(yàn)證抽取單交換菌株的總DNA，以引物對(duì)crtBFl/crtBR2 進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?MV 3min 預(yù)變性；94°C 30s,57°C 30s、72°C 60s 進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72°C延伸7min。擴(kuò)增體系為25iU。以發(fā)生單交換的菌的基因組為模板，擴(kuò)增出大小分別為1032bp和2061bp的兩條帶的為目的單交換菌株。單交換篩選的原理因?yàn)榘l(fā)生crtB單交換時(shí)，載體pHARAcrtB通過雙交換左臂或雙交換右臂全部整合到Har. hispanica ApyrF的基因組上。一方面,為了區(qū)分單交換菌株與未轉(zhuǎn)化的Har. hispanica ApyrF，篩選培養(yǎng)基II中不含有尿嘧啶；單交換菌株中含有了pyrF基因，菌自身便可以合成尿嘧啶，因此單交換菌在不含有尿嘧啶的AS-168SY固體平板便能生長(zhǎng)；而未轉(zhuǎn)化的Har. hispanica ApyrF ApyrF中不含有pyrF基因，不能自身合成尿嘧啶，不能在不含有尿嘧啶的固體平板上生長(zhǎng)。另一方面，crtBFl/crtBR2擴(kuò)增出大小分別為1079bp和2085bp的兩條帶的菌為目的單交換菌株；發(fā)生單交換的菌中含有一個(gè)拷貝的完整的crtB基因，還含有另一個(gè)拷貝的A crtB，以發(fā)生單交換的菌的基因組為模板用引物 crtBFl/crtBR2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可擴(kuò)增出大小分別為1079bp和2085bp的兩條帶，1079bp是對(duì)A crtB的擴(kuò)增結(jié)果，2085bp是對(duì)完整的crtB基因的擴(kuò)增結(jié)果。2)雙交換菌株的構(gòu)建、篩選及驗(yàn)證方法將步驟I)篩選到的crtB單交換菌株在液體AS-168SY(添加終濃度50 y g/mlUracil)培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)50代，將傳代培養(yǎng)的培養(yǎng)液稀釋IO7涂布于篩選培養(yǎng)基I的平板，37°C培養(yǎng)一周左右。挑取單克隆劃線于篩選培養(yǎng)基I的平板，能在篩選培養(yǎng)基I的平板上生長(zhǎng)的菌落為發(fā)生雙交換的菌，記作Har. hispanica A pyrF A crtB。每I升所述篩選培養(yǎng)基I由酸水解酪素、谷氨酸鈉、檸檬酸鈉、NaCUMgSO4 7H20、KC1、FeSO4 7H20、MnCl2 4H20、尿嘧啶、5-F0A和水組成，其中各組分在所述篩選培養(yǎng)基I中的濃度為酸水解酪素5. Og/L、谷氨酸鈉1.0g/L、檸檬酸鈉3. Og/L、NaCl 200g/L、MgSO4 *7H20 20g/L、KCl 2. Og/L、FeSO4.7H20 0. 36g/L,MnCl2 *4H20 0. 36mg/L、尿嘧啶 50mg/L、5-F0A 150mg/L ;所述篩選培養(yǎng)基I的pH值為7. 1-7. 2 ；雙交換菌株驗(yàn)證PCR驗(yàn)證以Har. hispanica A pyrF A crtB的基因組DNA作為模板，以引物對(duì)crtBFl/crtBR2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系和條件與單交換菌株驗(yàn)證相同。擴(kuò)增結(jié)果為1079bp條帶的應(yīng)為目的雙交換菌株。Southern blot 驗(yàn)證方法參照 DIG-High Prime DNA Labeling and DetectionStarter Kit I (Roche)說明書進(jìn)行，具體為先提取 Har. hispanica A pyrF A crtB 的基因組DNA及對(duì)照菌Har. hispanica A pyrF的基因組DNA，用限制性內(nèi)切酶Pstl/Kpnl進(jìn)行消化，消化后的產(chǎn)物用于雜交(圖6A)。Southern blot中使用的探針為上述crtB的雙交換右臂517p片段，并用地高辛標(biāo)記。雜交結(jié)果為2473bp條帶的為目的雙交換菌株，雜交結(jié)果為3282bp條帶的為對(duì)照菌Har. hispanica A pyrF,該條帶由圖6A所示的Pstl/Kpnl雙酶切位點(diǎn)之間的片段產(chǎn)生。雙交換菌株篩選驗(yàn)證原理發(fā)生雙交換后，單交換菌中的完整的crtB基因被替換，質(zhì)粒pHAR A crtB從單交換菌的基因組中脫離，因此雙交換菌株中只含有一個(gè)拷貝的A crtB且不再含有完整的crtB基因和pyrF基因。一方面，篩選培養(yǎng)基I需含有尿嘧啶和5-F0A ;因?yàn)殡p交換菌中不含有pyrF基因，自身不能合成尿嘧啶，且不能以5-F0A為底物代謝產(chǎn)生細(xì)胞毒性物質(zhì)5-氟尿嘧啶，因此能在含有5-F0A的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；而單交換菌株中含有PyrF基因，能以5-F0A為底物代謝產(chǎn)生細(xì)胞毒性物質(zhì)5-氟尿嘧啶，因此不能在含有5-F0A的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；所以篩選培養(yǎng)基I中需含有尿嘧啶和5-F0A。另一方面，用引物crtBFl/crtBR2對(duì)雙交換菌株基因組進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，只得到一條得到1079bp的條帶的菌為目的雙交換菌株；因?yàn)殡p交換菌株中含有AcrtB，當(dāng)用引物crtBFl/crtBR2對(duì)雙交換菌株基因組進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，其實(shí)是對(duì)A crtB的擴(kuò)增結(jié)果，因此只得到一條得到1079bp的條帶。整合質(zhì)粒載體pHAR A crtB中的SEQ ID NO 3中第1-517位核苷酸所示DNA和SEQ ID NO 3中第1524-2085位核苷酸所示DNA與Har. hispanica A pyrF中的完整基因crtB發(fā)生同源重組，使缺失突變株Har. hispanica A pyrF A crtB中缺失了基因crtB中的SEQ ID NO :3中第518-1523位核苷酸。3)單交換菌株與雙交換菌株驗(yàn)證PCR鑒定結(jié)果如圖6B所示泳道I為單交換菌株擴(kuò)增結(jié)果，泳道2為雙交換菌株擴(kuò)增結(jié)果，泳道3為pHAR A crtB質(zhì)粒陽性對(duì)照，泳道4為Har. hispanica A pyrF陰性對(duì)照。從圖中看出，陰性對(duì)照的PCR產(chǎn)物大小2085bp，陽性對(duì)照的PCR產(chǎn)物大小1079bp，泳道I的PCR產(chǎn)物大小分別為1079bp和2085bp，說明單交換菌株鑒定正確，單交換菌株為pHAR △ crtB質(zhì)粒發(fā)生單交換整合入Har. hispanica A pyrF基因組同源區(qū)域的重組菌株。泳道2的PCR產(chǎn)物大小為1079bp，說明雙交換菌株鑒定正確。Southern blot鑒定結(jié)果,見圖6C。泳道I為單交換菌株雜交結(jié)果,泳道2為雙交換菌株雜交結(jié)果。泳道I的雜交條帶為3282bp bp，泳道2的雜交條帶為2473bp ;對(duì)照菌株Har. hispanica A pyrF得到3282bp大片段。表明得到的單交換菌株和雙交換菌株均正確。實(shí)施例5、效果驗(yàn)證 實(shí)驗(yàn)組J^pHARAcrtBRKHar. hispanica A pyrF,篩選單交換菌株,得到的發(fā)生單交換的重組菌為目的重組子。轉(zhuǎn)化方法及篩選方法與實(shí)施例4中所述一致。具體實(shí)驗(yàn)條件及結(jié)果如表I所示。對(duì)照組將pUBP A pyrF 轉(zhuǎn)化西班牙鹽盒菌(Haloarcula hispanica) CGMCCI. 2049，篩選單交換菌株，得到的發(fā)生單交換的重組菌為目的重組子。轉(zhuǎn)化方法及篩選方法與實(shí)施例2中所述一致。具體實(shí)驗(yàn)條件及結(jié)果如表I所示。以上實(shí)驗(yàn)均設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均值土標(biāo)準(zhǔn)差。重組率計(jì)算公式重組率=每板重組子數(shù)/轉(zhuǎn)化所用質(zhì)粒量。表I
IT~質(zhì)粒量涂布體積每板重組I 一，十I耗時(shí)
菌株質(zhì)粒重組率
(嗎)(HL)子數(shù)(d)
Har.hispanicapUBPA/^rT7 2600152.7土 14.7 76.460
Har. hispcmicahpyrF pHARAcr 出 2600592.3 ±52.3 296.230實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組的陽性重組率明顯高于對(duì)照組，是對(duì)照組的3. 9倍，說明實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比陽性轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)生率要低1-2個(gè)數(shù)量級(jí)，實(shí)驗(yàn)組所用系統(tǒng)更容易得到真正的陽性轉(zhuǎn)化子。且實(shí)驗(yàn)組整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程耗時(shí)縮短了一半，提高了工作 效率。
權(quán)利要求
1.ー種重組嗜鹽古菌，按照包括如下步驟的方法制備得到使含有SEQ ID N0:1所示蛋白的編碼基因的出發(fā)嗜鹽古菌中的SEQ ID NO :1所示蛋白的編碼基因的功能喪失，得到的重組菌為所述重組嗜鹽古菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組嗜鹽古菌，其特征在干所述含有SEQID N0:1所示蛋白的編碼基因的出發(fā)嗜鹽古菌為西班牙鹽盒菌(Haloarcula hispanica)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的重組嗜鹽古菌，其特征在于所述使含有SEQID NO 1所示蛋白的編碼基因的出發(fā)嗜鹽古菌中的SEQ ID NO :1所示蛋白的編碼基因的功能喪失為敲除所述出發(fā)嗜鹽古菌中的SEQ ID NO 1所示蛋白的編碼基因； 和/或，所述敲除是通過同源重組實(shí)現(xiàn)的； 和/或，所述同源重組通過如下同源重組載體實(shí)現(xiàn)所述同源重組載體按照包括如下步驟的方法構(gòu)建將SEQ ID NO 2中第1-585位核苷酸所示DNA沿著從PstI至BamHI的方向插在載體PUBP的PstI和BamHI位點(diǎn)間，得到的重組載體記作中間重組載體；將SEQID NO 2中第1395-1942位核苷酸所示DNA沿著從BamHI至KpnI的方向插在載體pUBP的BamHI和KpnI位點(diǎn)間，得到的重組載體即為所述同源重組載體； 和/或，所述SEQ ID NO 1所示蛋白的編碼基因?yàn)槿缦翴)或2)或3)或4)所示 1)其核苷酸序列是SEQID NO :2中自5'末端第597-1430位核苷酸所示DNA分子； 2)其核苷酸序列是SEQID NO :2中自5'末端第477-1430位核苷酸所示DNA分子； 3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子； 4)與I)或2)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。
4.ー種試劑盒，包括權(quán)利要求1-3中任一所述的重組嗜鹽古菌和如下重組質(zhì)粒載體；所述重組質(zhì)粒載體中至少含有供外源基因插入的多克隆位點(diǎn)和如下其它三個(gè)元件在大腸桿菌中復(fù)制所需的復(fù)制原點(diǎn)、用于篩選大腸桿菌轉(zhuǎn)化子的抗性選擇標(biāo)記基因的表達(dá)盒、SEQID NO 1所示蛋白的編碼基因的表達(dá)盒、供外源基因插入的多克隆位點(diǎn)； 所述供外源基因插入的多克隆位點(diǎn)不與所述其它三個(gè)元件重疊。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述重組質(zhì)粒載體按照包括如下步驟的方法制備得到將SEQ ID NO 2中第477-1430位核苷酸所示基因插在載體pUBP的多克隆位點(diǎn)間，得到的重組載體即為所述重組質(zhì)粒載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包括篩選培養(yǎng)基I和/或篩選培養(yǎng)基II ; 每I升所述篩選培養(yǎng)基I由酸水解酪素、谷氨酸鈉、檸檬酸鈉、NaCl、MgSO4 · 7H20、KC1、FeSO4 · 7H20,MnCl2 · 4H20、尿嘧啶、5-F0A和水組成，其中各組分在所述篩選培養(yǎng)基I中的濃度為酸水解酪素5. Og/L、谷氨酸鈉I. Og/L、檸檬酸鈉3. Og/L、NaCl 200g/L、MgSO4 · 7H2020g/L、KCl 2. Og/L、FeSO4 · 7H20 0. 36g/L、MnCl2 · 4H20 0. 36mg/L、尿嘧啶 50mg/L、5_F0A150mg/L ;所述篩選培養(yǎng)基I的pH值為7· 1-7. 2 ； 每I升所述篩選培養(yǎng)基II由酸水解酪素、谷氨酸鈉、檸檬酸鈉、NaCl、MgS04 ·7Η20、Κ(1、FeSO4 ·7Η20、Μη(12 ·4Η20和水組成，其中各組分在所述篩選培養(yǎng)基II中的濃度為酸水解酪素 5.(^/し谷氨酸鈉1.(^/し檸檬酸鈉3.(^/し似(1 200g/L、MgS04*7H20 20g/L、KCl 2. Og/L、FeSO4 · 7H20 0. 36g/L、MnCl2 · 4H20 0. 36mg/L ;所述篩選培養(yǎng)基 II 的 pH 值為 7. 1-7. 2。
7.權(quán)利要求4-6中任一所述試劑盒在如下I)或2)或3)中的應(yīng)用1)敲除權(quán)利要求1-3中任一所述重組嗜鹽古菌的基因組中目的基因； 2)在權(quán)利要求1-3中任一所述重組嗜鹽古菌中過表達(dá)外源基因； 3)研究菌(Haloarculahispanica)的基因組中待測(cè)基因的功能。
8.ー種蛋白，是如下a)或b)的蛋白質(zhì) a)由SEQID NO 1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； b)將SEQID NO : I所示的氨基 酸序列經(jīng)過ー個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有乳清酸核苷-5'-單磷酸脫羧酶活性的由a)衍生的蛋白質(zhì)。
9.權(quán)利要求8所述蛋白的編碼基因； 和/或，所述編碼基因?yàn)槿缦翴)或2)或3)或4)所示1)其核苷酸序列是SEQID NO :2中自5'末端第597-1430位核苷酸所示DNA分子；2)其核苷酸序列是SEQID NO :2中自5'末端第477-1430位核苷酸所示DNA分子； 3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子； 4)與I)或2)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。
10.含有權(quán)利要求9所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組病毒或表達(dá)盒； 和/或，SEQ ID NO :I所示蛋白的編碼基因在基因工程中作為選擇標(biāo)記的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于西班牙鹽盒菌和pyrF基因的遺傳操作系統(tǒng)及其應(yīng)用。該遺傳操作系統(tǒng)包括重組嗜鹽古菌和重組質(zhì)粒載體；重組嗜鹽古菌按照包括如下步驟的方法制備得到使含有SEQ ID NO1所示蛋白的編碼基因的出發(fā)嗜鹽古菌中的SEQ ID NO1所示蛋白的編碼基因的功能喪失，得到的重組菌為所述重組嗜鹽古菌；重組質(zhì)粒載體中至少含有如下元件在大腸桿菌中復(fù)制所需的復(fù)制原點(diǎn)、用于篩選大腸桿菌轉(zhuǎn)化子的抗性選擇標(biāo)記基因的表達(dá)盒、SEQ ID NO1所示蛋白的編碼基因的表達(dá)盒、供外源基因插入的多克隆位點(diǎn)。該遺傳操作系統(tǒng)可作為一個(gè)高效的基因敲除系統(tǒng)，可以對(duì)Haloarcula hispanica進(jìn)行廣泛的基因功能研究和代謝途徑闡明。實(shí)驗(yàn)證明，用本發(fā)明系統(tǒng)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化獲得陽性重組子的頻率大大提高。
文檔編號(hào)C12N9/88GK102676414SQ201110054379
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2011年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月8日
發(fā)明者劉海龍, 向華 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所