專利名稱：桑蠶微粒子病檢驗(yàn)試劑盒及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測試劑，具體涉及一種桑蠶微粒子病(脅)檢驗(yàn)試劑盒及其使用方法。
背景技術(shù)：
桑蠶微粒子病是一種毀滅性的疫病，是由桑蠶微孢子蟲(Nosema bombycis, Nb)引起的。歷史上法國、意大利等國曾因該病的發(fā)生、流行，幾乎導(dǎo)致養(yǎng)蠶業(yè)毀滅。目前的顯微鏡檢驗(yàn)主要是針對母蛾而不是生產(chǎn)的產(chǎn)品蠶種(蠶卵)進(jìn)行的，母蛾檢驗(yàn)的結(jié)果有時(shí)不完全代表蠶種的真實(shí)情況。因此準(zhǔn)確、快速地檢測桑蠶微粒子病(M )具有十分重要的意義。目前對桑蠶微粒子病檢測方法主要采用以病原孢子分離鑒定、顯微鏡鏡檢以形態(tài)學(xué)鑒定為主的國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T20395 — 2006)。其他各種檢測研究包括電鏡檢查、分子生物學(xué)技術(shù)、血清學(xué)技術(shù)等都取得了較大進(jìn)步，并獲得使用者的認(rèn)可。其中病原核酸檢測在快速性、安全性、準(zhǔn)確性和靈敏性等方面都有很大的提高，這些新技術(shù)試圖突破傳統(tǒng)的形態(tài)鏡檢檢測舊模式，而直接用樣品對其基因及基因產(chǎn)物進(jìn)行快速檢測，并且與分子生物學(xué)技術(shù)及生物信息學(xué)手段相結(jié)合，向準(zhǔn)確、快速、靈敏和自動化的方向發(fā)展，避免了傳統(tǒng)鏡檢過程中出現(xiàn)的漏檢、錯檢、誤檢的情況，同時(shí)可以節(jié)約時(shí)間和物力。這些方法雖然有各自的優(yōu)點(diǎn)但是都存在著一定的缺陷。電鏡檢查必須經(jīng)過超薄切片、電鏡觀察，對技術(shù)設(shè)備和操作人員的技術(shù)要求較高，目前主要用于科研，尚不能實(shí)用地進(jìn)行診斷鑒別。血清學(xué)檢測技術(shù)快速簡便成本低廉，但目前發(fā)現(xiàn)的桑蠶微粒子孢子因共同抗原的存在易出現(xiàn)一定的交叉反應(yīng)，特異性較差。而聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)需要專門的儀器，而且存在容易交叉污染和操作過程煩瑣的缺點(diǎn)?？傊?，這些方法雖然有各自的優(yōu)點(diǎn)但是都存在著一定的缺陷，很難在基層生產(chǎn)上推廣。所以及時(shí)運(yùn)用生物技術(shù)發(fā)展的最新成果對滿足病原微生物檢測要求的不斷提高具有重要意義。其中等溫?cái)U(kuò)增(Isothermal Amplification)核酸快速檢測技術(shù)是病原核酸檢測技術(shù)上的長足進(jìn)步，現(xiàn)已建立起來的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)具有很多的優(yōu)越性，此外，2010年4月以來尚未發(fā)現(xiàn)應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測桑蠶微粒子病的基因快速檢驗(yàn)試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種檢測效果更全面、特異性高、準(zhǔn)確度高、漏檢率低的桑蠶微粒子病、m檢驗(yàn)試劑盒。本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)一種桑蠶微粒子病Λ(力孢子檢驗(yàn)試劑盒，所述的桑蠶微粒子病況力孢子檢驗(yàn)試劑盒包括以桑蠶微粒子病況力孢子為靶基因、基于環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)設(shè)計(jì)的兩對引物外引物F3/B3和內(nèi)引物FIP/BIP。與NCBI網(wǎng)站nt數(shù)據(jù)庫的BLAST比對結(jié)果顯示，除桑蠶微粒子病Λ b孢子外，無其它物種帶有該靶基因。
作為本發(fā)明桑蠶微粒子病(Λ20檢驗(yàn)試劑盒的優(yōu)選實(shí)施方式，所述的兩對引物為外引物 F3 (1) :(SEQ ID NO 1)
CAGGAGTTGCTTTTGCGA
外引物 B3 (1) :(SEQ ID NO 2)
AAACGGATTCAGCAGGTA
內(nèi)引物 FIP (1) :(SEQ ID NO 3)
GAAAGCGCTGCTCAAAGCAGttttTGTGCCATTGAATGTCAGA
內(nèi)引物 BIP (1) :(SEQ ID NO 4)
CTGCGCTACCAGCGTTGTTAttttATATCACCATCGGTGGAAG
或
外引物 F3 (2) :(SEQ ID NO 5)
CTTTGAGCAGCGCTTTCA
外引物 B3 (2) :(SEQ ID NO 6)
GGGTAAATCTGTTAATGGTTCTT
內(nèi)引物 FIP (2) :(SEQ ID NO 7)
GCATACGTAGACGATGCAGGCttttCAGCTTTAGCTGCGCTAC
內(nèi)引物 BIP (2) :(SEQ ID NO 8)
GGCTTCCACCGATGGTGATAttttACACCACAAAAGATGGTACTG
或
外引物 F3 (3) :(SEQ ID NO 1)
CAGGAGTTGCTTTTGCGA
外引物 B3 (3) :(SEQ ID NO 2)
AAACGGATTCAGCAGGTA
內(nèi)引物 FIP (3) :(SEQ ID NO 9)
GAAAGCGCTGCTCAAAGCAGTGTGCCATTGAATGTCAGA
內(nèi)引物 BIP (3) :(SEQ ID NO 10)
CTGCGCTACCAGCGTTGTTAATATCACCATCGGTGGAAG
或
外引物 F3 (4) :(SEQ ID NO 5)
CTTTGAGCAGCGCTTTCA
外引物 B3 (4) :(SEQ ID NO 6)
GGGTAAATCTGTTAATGGTTCTT
內(nèi)引物 FIP (4) :(SEQ ID NO 11)
GCATACGTAGACGATGCAGGCCAGCTTTAGCTGCGCTAC
內(nèi)引物 BIP (4) :(SEQ ID NO 12)
GGCTTCCACCGATGGTGATAACACCACAAAAGATGGTACTG。作為本發(fā)明桑蠶微粒子病(Λ20檢驗(yàn)試劑盒的優(yōu)選實(shí)施方式，所述的桑蠶微粒子病 (.Nb)檢驗(yàn)試劑盒還包括樣品預(yù)處理液、feiDNA聚合酶、反應(yīng)液、穩(wěn)定液、顯色液和陽性對照樣本。
7
作為本發(fā)明桑蠶微粒子病(Λ20檢驗(yàn)試劑盒的更優(yōu)選實(shí)施方式，
所述的樣品預(yù)處理液10 20 mmol/L pH 8. 0的Tris- HClU 2 mmol/L EDTA和 1 1. 2 體積 % Triton X-100 ；
所述的fei DNA聚合酶酶濃度4-10 U/ μ L ；
所述的反應(yīng)液1. 6 2mmol/L dNTP、20 25mmol/L Tris-HCl、10 12. 5mmol/L KCl, 10 12. 5mmol/L (NH4)2SO4,8 10mmol/L MgSO4 ·7Η20、0· 1 0. 125 體積％ TritonX-100、 0.8 lmol/L甜菜堿；
所述的顯色液為SYBR Green I或Eva Green ； 所述穩(wěn)定液為石蠟油；
所述的陽性對照為桑蠶微粒子病脅孢子靶基因組DNA ；
所述的內(nèi)引物FIP/BIP各為0. 2 0. 25 μ mol/L,外引物F3/B3的濃度各為1. 2 2. 0 μ mol/L。作為本發(fā)明桑蠶微粒子病(Λ20檢驗(yàn)試劑盒的最優(yōu)選實(shí)施方式， 所述的fei DNA聚合酶酶濃度8 U/ μ L ；
所述的反應(yīng)液2mmol/L dNTP、25mmol/L Tris-HCl、12. 5mmol/L KC1、12. 5mmol/L (NH4) 2S04、10mmol/L MgSO4 · 7H20、0. 125 體積 ％ TritonX-100、lmol/L 甜菜堿；
所述的樣品預(yù)處理液20 mmol/L pH 8.0的Tris- HCl,2 mmol/L EDTA和1.2體積％ Triton X-100 ；
所述的顯色液為STOR Green I ；
所述的內(nèi)引物FIP/BIP的濃度為0. 2 μ mol/L ；
所述的外引物F3/B3的濃度為1.6 μ mol/L。作為本發(fā)明桑蠶微粒子病(脅)檢驗(yàn)試劑盒的優(yōu)選實(shí)施方式，所述的桑蠶微粒子病(脅)檢驗(yàn)試劑盒還包括反應(yīng)管，所述的反應(yīng)管由管體和管蓋兩部分組成，管體內(nèi)腔的下部設(shè)有將其分隔成A、B兩個(gè)空腔的縱向延伸的隔板。所述的反應(yīng)管引用專利CN 200910213987. 4一一種用于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的反應(yīng)管及其使用方法。作為本發(fā)明桑蠶微粒子病(脅)檢驗(yàn)試劑盒的更優(yōu)選實(shí)施方式，所述的A、B兩個(gè)空腔中分別裝有工作液或顯色液，兩個(gè)空腔中的液體上層均由穩(wěn)定液封存，所述工作液為反應(yīng)液和fei DNA聚合酶的混合而成。本發(fā)明還提供一種桑蠶微粒子病(脅)檢驗(yàn)試劑盒的使用方法，該方法包括如下步驟
(1)根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)《家蠶一代雜交種檢驗(yàn)規(guī)程》GB/T20395-2006的要求，取得桑蠶微孢子病Λ力孢子作為待測試樣，將待測試樣50 μ L注入1. 5mL無菌離心管中；
(2)在步驟(1)的離心管加入樣品預(yù)處理液100μ L，混合均勻，沸水浴15min滅活后冰浴上冷卻，高速離心，上清即為樣品模板DNA ；
(3)在反應(yīng)容器中加入feiDNA聚合酶0. 9 1. 8體積份數(shù)、反應(yīng)液38 40體積份數(shù)、 穩(wěn)定液52 54. 5體積份數(shù)、樣品模板DNA 4. 5、體積份數(shù)、內(nèi)引物FIP/BIP各2體積份數(shù)、 外引物F3/B3各4體積份數(shù)，混合均勻，恒溫反應(yīng)；
(4)在上述反應(yīng)容器和陽性對照管中分別加入顯色液，混勻，樣品組顯色與對照組相同則為陽性，否則為陰性；所述步驟(3)中的外引物F3/B3和內(nèi)引物FIP/BIP為以桑蠶微粒子病Λ力孢子為靶基
因、基于環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)設(shè)計(jì)的兩對引物。 作為本發(fā)明使用桑蠶微粒子病(Λ20檢驗(yàn)試劑盒的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述的兩
對引物為
外引物 F3 (1) :(SEQ ID NO 1)
CAGGAGTTGCTTTTGCGA
外引物 B3 (1) :(SEQ ID NO 2)
AAACGGATTCAGCAGGTA
內(nèi)引物 FIP (1) :(SEQ ID NO 3)
GAAAGCGCTGCTCAAAGCAGttttTGTGCCATTGAATGTCAGA
內(nèi)引物 BIP (1) :(SEQ ID NO 4)
CTGCGCTACCAGCGTTGTTAttttATATCACCATCGGTGGAAG
或
外引物 F3 (2) :(SEQ ID NO 5)
CTTTGAGCAGCGCTTTCA
外引物 B3 (2) :(SEQ ID NO 6)
GGGTAAATCTGTTAATGGTTCTT
內(nèi)引物 FIP (2) :(SEQ ID NO 7)
GCATACGTAGACGATGCAGGCttttCAGCTTTAGCTGCGCTAC
內(nèi)引物 BIP (2) :(SEQ ID NO 8)
GGCTTCCACCGATGGTGATAttttACACCACAAAAGATGGTACTG
或
外引物 F3 (3) :(SEQ ID NO 1)
CAGGAGTTGCTTTTGCGA
外引物 B3 (3) :(SEQ ID NO 2)
AAACGGATTCAGCAGGTA
內(nèi)引物 FIP (3) :(SEQ ID NO 9)
GAAAGCGCTGCTCAAAGCAGTGTGCCATTGAATGTCAGA
內(nèi)引物 BIP (3) :(SEQ ID NO 10)
CTGCGCTACCAGCGTTGTTAATATCACCATCGGTGGAAG
或
外引物 F3 (4) :(SEQ ID NO 5)
CTTTGAGCAGCGCTTTCA
外引物 B3 (4) :(SEQ ID NO 6)
GGGTAAATCTGTTAATGGTTCTT
內(nèi)引物 FIP (4) :(SEQ ID NO 11)
GCATACGTAGACGATGCAGGCCAGCTTTAGCTGCGCTAC
內(nèi)引物 BIP (4) :(SEQ ID NO 12)
GGCTTCCACCGATGGTGATAACACCACAAAAGATGGTACTG。
作為本發(fā)明使用桑蠶微粒子病(Λ20檢驗(yàn)試劑盒的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，步驟(3) 中，恒溫反應(yīng)的反應(yīng)條件為溫度63士2°C，反應(yīng)時(shí)間45 90min。本發(fā)明的桑蠶微粒子病(脅)檢驗(yàn)試劑盒能對桑園害蟲及與桑蠶近緣的昆蟲，包括柞蠶、桑毛蟲、菜粉蝶等的微孢子蟲進(jìn)行識別。解決顯微鏡檢驗(yàn)方式根據(jù)微孢子蟲形態(tài)難于識別的困難，避免誤診，以提高檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性；同時(shí)適用于《桑蠶原種檢驗(yàn)規(guī)程》GB/ T19178-2003的桑蠶原種母娥微孢子檢驗(yàn)。本發(fā)明所說的基于環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplication of DNA,簡稱LAMP)快速檢測桑蠶微粒子病(脅)的方法，是利用feiDNA聚合酶和根據(jù)靶基因序列設(shè)計(jì)的兩對特殊的內(nèi)、外引物(即內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3)，特異性識別靶序列上的六個(gè)獨(dú)立區(qū)域，啟動循環(huán)鏈置換反應(yīng)，在靶標(biāo)DNA區(qū)啟動互補(bǔ)鏈合成， 結(jié)果在同一鏈上互補(bǔ)序列周而復(fù)始形成有很多環(huán)的花椰菜結(jié)構(gòu)的莖-環(huán)DNA混合物。LAMP 反應(yīng)過程中，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物——焦磷酸鎂乳白色沉淀，即可通過肉眼觀察判定結(jié)果。LAMP反應(yīng)是在恒溫(63 65°C)條件下 45 90分鐘內(nèi)完成。這種比較溫和的溫度條件以及沒有溫度循環(huán)使所需儀器簡單化，克服了傳統(tǒng)PCR固有的檢測時(shí)間長、容易污染及檢測成本高等缺點(diǎn)。此外，這種檢測方法對檢測人員的技術(shù)素質(zhì)要求較低，實(shí)際操作極為簡便，不需要特殊的試劑和儀器設(shè)備，有利于建立成本低廉的快速篩選體系。LAMP法是一種簡便、快速、高度特異性的基因擴(kuò)增法。將恒溫基因擴(kuò)增技術(shù)與PCR技術(shù)(包括熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù))進(jìn)行比較，可以發(fā)現(xiàn)該技術(shù)在靈敏度、特異性和檢測范圍等方法學(xué)指標(biāo)上相當(dāng)于或優(yōu)于PCR技術(shù)，且不依賴任何專門的儀器設(shè)備即可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測，而且檢測成本遠(yuǎn)低于熒光定量PCR技術(shù)。目前國家標(biāo)準(zhǔn)中采用以病原孢子分離鑒定、形態(tài)學(xué)顯微鏡鏡檢鑒定為主的通行方法，初步鑒定需1 2 天，且誤診、錯檢率高；采用本發(fā)明的檢測試劑盒僅需2小時(shí)，且可連續(xù)操作。并且，本發(fā)明的反應(yīng)體系中加入了顯色液，鑒定結(jié)果更為直觀清晰、準(zhǔn)確。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果1.本發(fā)明的檢測試劑盒只需一個(gè)恒定溫度設(shè)備就能擴(kuò)增反應(yīng)，不需要特殊試劑與設(shè)備，檢測成本低；2.本發(fā)明的基因快速診斷試劑盒應(yīng)用六個(gè)區(qū)段，四條引物，根據(jù)是否擴(kuò)增就能判斷靶標(biāo)物質(zhì)的存在與否，因此具有高特異性；3.本發(fā)明的檢測試劑盒擴(kuò)增快速且高效，在不到1小時(shí)即可完成擴(kuò)增，且產(chǎn)率高；4.本發(fā)明的檢測試劑盒靈敏度高，擴(kuò)增模板僅需10拷貝或更少；5.本發(fā)明的基因快速診斷試劑盒鑒定簡便，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物——焦磷酸鎂沉淀，可通過肉眼觀察鑒定，并且加入顯色液后，陰陽性結(jié)果顯色差異顯著，驗(yàn)證率高，更加明顯可靠；6.由于選擇了高保守性的籍M^f度作為靶基因設(shè)計(jì)引物，使得本發(fā)明的檢測試劑盒檢測桑蠶微粒子病(Λ20的準(zhǔn)確率更高；7.在本發(fā)明檢測試劑盒中采用特制的反應(yīng)管，減少了氣溶膠污染的可能性，同時(shí)方便操作。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明更加容易理解，下面將進(jìn)一步闡述本發(fā)明的具體實(shí)施例。下列縮略語適用于本發(fā)明
LAMP loop-mediated isothermal amplification,環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增 dNTP :deoxyribonucleoside triphosphate,脫氧核苷三憐酸
10Bst Sl :Bst DNA polymerase (large fragment) ,fei DNA 聚合酶(大片段) EDTA :ethylenediamine tetraacetic acid,乙二胺四乙酸 DNA deoxyribonucleic acid，脫氧核糖核酸 Betaine 舌甘菜堿
Triton X-100 聚乙二醇辛基苯基醚實(shí)施例1試劑盒的制備
1、按以下序列經(jīng)DNA合成儀合成寡聚脫氧核酸引物 外引物 F3 (1) :(SEQ ID NO 1) CAGGAGTTGCTTTTGCGA
外引物 B3 (1) :(SEQ ID NO 2)
AAACGGATTCAGCAGGTA
內(nèi)引物 FIP (1) :(SEQ ID NO 3)
GAAAGCGCTGCTCAAAGCAGttttTGTGCCATTGAATGTCAGA
內(nèi)引物 BIP (1) :(SEQ ID NO 4)
CTGCGCTACCAGCGTTGTTAttttATATCACCATCGGTGGAAG。
2、購置DNA聚合酶-.BstDNA聚合酶置于容器；
3、配制反應(yīng)液和引物反應(yīng)液含有2mmol/LdNTP、25mmol/LTris_Cl、12. 5mmol/L KC1、 12. 5mmol/L (NH4) 2S04、lOmmol/L MgSO4 · 7H20、0. 125 體積 ％ TritonX-100、lmol/L 甜菜堿、 內(nèi)引物FIP/BIP各0· 2 μ mol/L和外引物F3/B3各0. 25 μ mol/L,置于容器；
4、配制樣品預(yù)處理液樣品預(yù)處理液含有20mmol/L Tris- HCl (pH 8.0),2 mmol/L EDTA和1. 2體積％ Triton X-100,置于容器；
5、購置穩(wěn)定液石蠟油，置于容器；
6、購置顯色液STORGreenI，置于容器；
7、提取陽性對照提取桑蠶微粒子病脅孢子基因組DNA，置于容器；
8、將上述7個(gè)容器裝成試劑盒，封裝。制備工藝簡述如下
(1)將內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成純化后，定量配制，濃度檢測，抽樣質(zhì)檢；
(2)將上述2、步驟配制的液體無菌分裝，并按照實(shí)驗(yàn)用進(jìn)行濃度確定，抽樣質(zhì)檢；
(3)將穩(wěn)定液分裝，抽樣質(zhì)檢；
(4)將陽性對照標(biāo)本制備，分裝，抽樣質(zhì)檢；
(5)組裝試劑盒。在本發(fā)明桑蠶微粒子病、Nb )檢驗(yàn)試劑盒的其他實(shí)施例中，所采用的引物還可以是外引物 F3 (3) :(SEQ ID NO 1)
CAGGAGTTGCTTTTGCGA
外引物 B3 (3) :(SEQ ID NO 2)
AAACGGATTCAGCAGGTA
內(nèi)引物 FIP (3) :(SEQ ID NO 9)
GAAAGCGCTGCTCAAAGCAGTGTGCCATTGAATGTCAGA
內(nèi)引物 BIP (3) :(SEQ ID NO 10)CTGCGCTACCAGCGTTGTTAATATCACCATCGGTGGAAG。實(shí)施例2試劑盒的制備
1、按以下序列經(jīng)DNA合成儀合成寡聚脫氧核酸引物 外引物 F3 (2) :(SEQ ID NO 5) CTTTGAGCAGCGCTTTCA
外引物 B3 (2) :(SEQ ID NO 6)
GGGTAAATCTGTTAATGGTTCTT
內(nèi)引物 FIP (2) :(SEQ ID NO 7)
GCATACGTAGACGATGCAGGCttttCAGCTTTAGCTGCGCTAC
內(nèi)引物 BIP (2) :(SEQ ID NO 8)
GGCTTCCACCGATGGTGATAttttACACCACAAAAGATGGTACTG。
2、購置DNA聚合酶-.BstDNA聚合酶置于容器；
3、配制反應(yīng)液和引物反應(yīng)液含有1. 6mmol/LdNTP、20mmol/L Tris-ClU0mmol/L KC1、 1 Ommo 1 /L(NH4)2SO4,8mmo 1 /L MgS04、0. 1 體積％ TritonX_100、0. 8mol/L甜菜堿、內(nèi)引物FIP/ BIP各0. 25ymol/L和外引物F3/B3各1. 2 μ mol/L，置于容器；
4、配制樣品預(yù)處理液樣品預(yù)處理液含有10mmol/L Tris- HCl (pH 8.0),1 mmol/L EDTA和1. 0體積％ Triton X-100,置于容器；
5、購置穩(wěn)定液石蠟油，置于容器；
6、購置顯色液EVAGreen I，置于容器；
7、提取陽性對照提取桑蠶微粒子病脅孢子基因組DNA，置于容器；
8、將上述7個(gè)容器裝成試劑盒，封裝。其他同實(shí)施例1。在本發(fā)明桑蠶微粒子病(Μ )檢驗(yàn)試劑盒的其他實(shí)施例中，所采用的引物還可以是外引物 F3 (4) :(SEQ ID NO 5)
CTTTGAGCAGCGCTTTCA
外引物 B3 (4) :(SEQ ID NO 6)
GGGTAAATCTGTTAATGGTTCTT
內(nèi)引物 FIP (4) :(SEQ ID NO 11)
GCATACGTAGACGATGCAGGCCAGCTTTAGCTGCGCTAC
內(nèi)引物 BIP (4) :(SEQ ID NO 12)
GGCTTCCACCGATGGTGATAACACCACAAAAGATGGTACTG。實(shí)施例3桑蠶微粒子病(Λ20檢驗(yàn)試劑盒的應(yīng)用 1. 1材料
1. 1. 1孢子
本研究所用孢子有3株，主要來源于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣東省蠶業(yè)技術(shù)推廣中心。詳見表1。表1孢子名稱及來源
孢子來源孢子及編號華南農(nóng)業(yè)大學(xué)家蠶母蛾微孢子/1 生產(chǎn)抽檢樣品來源于廣東省蠶業(yè)技術(shù)推廣中心的生產(chǎn)檢驗(yàn)樣品JCi
12[1它孢子 I來源于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)的柞蠶母蛾微孢子 1. 1. 2主要儀器和試劑 1. 2分離孢子的鑒定
臨床分離孢子的分離鑒定按要求抽取干燥處理的母蛾進(jìn)行編號。按每盒母蛾為一集團(tuán)投蛾。打開蛾盒檢查蛾袋情況，若符合條件，則將母蛾全數(shù)投入磨蛾杯內(nèi)；若該盒母蛾未裝滿，則不予鏡檢并作記載，再從第二樣本中抽補(bǔ)。在磨蛾杯中加注0. 5%碳酸鉀(或碳酸鈉) 溶液8(T90mL，磨碎后取出(如磨蛾轉(zhuǎn)速為8000r/min，磨蛾時(shí)間應(yīng)補(bǔ)少于90s)。靜置^iin 后，將蛾液倒入有過濾材料的漏斗內(nèi)過濾，禁止用棒攪動，加水校正離心管液量。離心沉淀 3min(3000r/min),倒去上層清液，在沉淀物中加入氫氧化鉀溶液lmL。離心管內(nèi)液體經(jīng)振蕩后，每管取4個(gè)樣本。按規(guī)定將上述4個(gè)樣本制2個(gè)鏡片標(biāo)本，用600倍以上顯微鏡兩人對檢，每人檢兩個(gè)樣本，每個(gè)樣本觀察不少于5個(gè)視野，若對檢結(jié)果不一致，應(yīng)復(fù)檢確認(rèn)。將鏡檢結(jié)果準(zhǔn)確填入鏡檢單。1. 3樣品處理(模板DNA提取)
1. 3. 1取50 μ L分離純化的脅孢子樣品于1. 5mL無菌離心管中； 1. 3. 2在上述孢子沉淀中加入100 μ L樣品預(yù)處理液混合均勻，沸水中煮20分鐘后立即置于冰浴上冷卻10分鐘，3000rpm離心2分鐘，上清即為樣品模板DNA。1. 4環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的反應(yīng)過程
1. 4. 1在200 μ L反應(yīng)管配制反應(yīng)體系反應(yīng)液22 μ UBst DNA聚合酶0. 5 μ L (4U)， 穩(wěn)定液30 μ L，模板DNA 2. 5 μ L。1.4.2將配制好的反應(yīng)管于65°C恒溫反應(yīng)lh。(在本發(fā)明的其他實(shí)施例中，反應(yīng)體系可為feiDNA聚合酶0. 9 1. 8體積份數(shù)、 反應(yīng)液38 40體積份數(shù)、穩(wěn)定液52 54. 5體積份數(shù)、樣品模板DNA 4. 5、體積份數(shù)、內(nèi)引物FIP/BIP各2體積份數(shù)、外引物F3/B3各4體積份數(shù)。恒溫反應(yīng)的反應(yīng)條件可為溫度 63 士 2°C，反應(yīng)時(shí)間 45 90min。)
1.5反應(yīng)后處理
向上述反應(yīng)產(chǎn)物中加入2 μ LSYBR Green I，混勻，同時(shí)也向陽性對照管(家蠶母蛾微孢子DNA)和陰性對照管(ddH20)中加入STOR Green I混勻，若反應(yīng)管與陽性對照管一樣顯現(xiàn)綠色則為陽性，若反應(yīng)管與陰性對照管一樣顯現(xiàn)橙色則為陰性。1. 6特異性試驗(yàn)
1.6.1純孢子LAMP檢測用LAMP方法對2株微孢子核酸進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)顯色反應(yīng)觀察結(jié)果，綠色為陽性，橙色陰性，驗(yàn)證方法特異性。1.6.2幾種孢子混合DNA檢測用LAMP對家蠶脅微孢子及柞蠶微孢子DNA核酸， 取2μ L作LAMP檢測。1. 7靈敏度試驗(yàn)將分離純化的家蠶微粒子脅孢子，提純純化至IO8孢子數(shù)/mL， 用去離子水10倍梯度稀釋至10_8，按1. 3樣品處理方法處理提取DNA模板。1. 8重復(fù)性試驗(yàn)特異性試驗(yàn)和靈敏度試驗(yàn)分別重復(fù)2次。結(jié)果
2.1織Nb微孢子LAMP檢測方法的建立
2.2特異性試驗(yàn)家蠶脅微孢子檢測結(jié)果陽性，柞蠶母蛾微孢子、為陰性。結(jié)果顯示
13試劑盒具有高特異性。2. 3靈敏度試驗(yàn)孢子原液濃度為IO8孢子數(shù)/mL，LAMP方法可檢測到第2個(gè)稀釋度，即為IO6孢子數(shù)/mL。2. 4重復(fù)性試驗(yàn)特異性試驗(yàn)重復(fù)兩次，結(jié)果一致。靈敏度試驗(yàn)重復(fù)兩次，數(shù)量級一致。實(shí)施例4采用反應(yīng)管的桑蠶微粒子病(脅)檢驗(yàn)試劑盒
本實(shí)施例的桑蠶微粒子病(Λ20檢驗(yàn)試劑盒，采用的試劑和引物與實(shí)施例1相同，試劑盒還包括反應(yīng)管，所述的反應(yīng)管引用專利CN 200910213987. 4一一種用于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的反應(yīng)管及其使用方法，反應(yīng)管由管體和管蓋兩部分組成，管體內(nèi)腔的下部設(shè)有將其分隔成A、B兩個(gè)空腔的縱向延伸的隔板，其中空腔A內(nèi)裝有22. 0 μ L的LAMP反應(yīng)液和 0. 5 μ L的 DNA聚合酶，液體上層由石蠟封存；空腔B內(nèi)裝有2. 0 μ L的LAMP反應(yīng)顯色液，液體上層也由石蠟封存，將該反應(yīng)管-20°C保存。本實(shí)施例采用反應(yīng)管作為容器，對桑蠶微粒子病脅孢子進(jìn)行LAMP檢測，同時(shí)設(shè)有陽性對照組和陰性對照組，具體包括如下步驟
取上述制備的反應(yīng)管三支，采用移液槍分別加入陰性對照樣品、待檢測樣品和陽性對照樣品各2. 5 μ L，加樣時(shí)槍頭穿透保護(hù)液層，樣品加至反應(yīng)管A腔內(nèi)，蓋緊管蓋并做好標(biāo)記，移至反應(yīng)區(qū)。將上述反應(yīng)管均于65°C恒溫反應(yīng)Ih。反應(yīng)結(jié)束，將反應(yīng)管倒置甩動1次，再正置甩動1次，使工作液與顯色液充分混合均勻后觀察。若反應(yīng)管與陽性對照管一樣顯現(xiàn)綠色則為陽性，若反應(yīng)管與陰性對照管一樣顯現(xiàn)橙色則為陰性。在LAMP反應(yīng)過程中，顯色液與工作液密封狀態(tài)好，沒有發(fā)生互相泄露的情況，后期顯色反應(yīng)時(shí)，倒置甩動操作使得顯色液和工作液混合，顯色結(jié)果清晰。最后所應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
1權(quán)利要求
1.一種桑蠶微粒子病檢驗(yàn)試劑盒，其特征在于，所述的桑蠶微粒子病檢驗(yàn)試劑盒包括以桑蠶微粒子病脅孢子為靶基因、基于環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)設(shè)計(jì)的兩對引物外引物F3/ B3和內(nèi)引物FIP/BIP。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的桑蠶微粒子病檢驗(yàn)試劑盒，其特征在于，所述的兩對引物為外引物F3 (1)CAGGAGTTGCTTTTGCGA 外引物B3 (1) AAACGGATTCAGCAGGTA 內(nèi)引物FIP (1)GAAAGCGCTGCTCAAAGCAGttttTGTGCCATTGAATGTCAGA 內(nèi)引物BIP (1)CTGCGCTACCAGCGTTGTTAttttATATCACCATCGGTGGAAG 或外引物F3 (2) CTTTGAGCAGCGCTTTCA 外引物B3 (2) GGGTAAATCTGTTAATGGTTCTT 內(nèi)引物FIP (2)GCATACGTAGACGATGCAGGCttttCAGCTTTAGCTGCGCTAC 內(nèi)引物BIP (2)GGCTTCCACCGATGGTGATAttttACACCACAAAAGATGGTACTG 或外引物F3 (3) CAGGAGTTGCTTTTGCGA 外引物B3 (3) AAACGGATTCAGCAGGTA 內(nèi)引物FIP (3)GAAAGCGCTGCTCAAAGCAGTGTGCCATTGAATGTCAGA 內(nèi)引物BIP (3)CTGCGCTACCAGCGTTGTTAATATCACCATCGGTGGAAG 或外引物F3 (4) CTTTGAGCAGCGCTTTCA 外引物B3 (4) GGGTAAATCTGTTAATGGTTCTT 內(nèi)引物FIP (4)GCATACGTAGACGATGCAGGCCAGCTTTAGCTGCGCTAC 內(nèi)引物BIP (4)GGCTTCCACCGATGGTGATAACACCACAAAAGATGGTACTG。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的桑蠶微粒子病檢驗(yàn)試劑盒，其特征在于，所述的桑蠶微粒子病檢驗(yàn)試劑盒還包括樣品預(yù)處理液、fei DNA聚合酶、反應(yīng)液、穩(wěn)定液、顯色液和陽性對照樣本。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的桑蠶微粒子病檢驗(yàn)試劑盒，其特征在于，所述的樣品預(yù)處理液10 20 mmol/L pH 8. 0的Tris- HClU 2 mmol/L EDTA和 1 1. 2 體積 % Triton X-100 ；所述的fei DNA聚合酶酶濃度4-10 U/ μ L ；所述的反應(yīng)液1. 6 2mmol/L dNTP、20 25mmol/L Tris-HCl、10 12. 5mmol/L KCl, 10 12. 5mmol/L (NH4)2SO4,8 10mmol/L MgSO4 ·7Η20、0· 1 0. 125 體積％ TritonX-100、 0.8 lmol/L甜菜堿；所述的顯色液為 STOR Green I 或 Eva Green, 1000 X , 2 μ L ； 所述穩(wěn)定液為石蠟油；所述的陽性對照為桑蠶微粒子病況力孢子基因組DNA ；所述的內(nèi)引物FIP/BIP各為0. 2 0. 25 μ mol/L,外引物F3/B3的濃度各為1. 2 2. 0 μ mol/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的桑蠶微粒子病檢驗(yàn)試劑盒，其特征在于，所述的樣品預(yù)處理液20 mmol/L pH 8.0的Tris- HCl,2 mmol/L EDTA和1.2體積％ Triton X-100 ；所述的fei DNA聚合酶酶濃度8 U/ μ L ；所述的反應(yīng)液2mmol/L dNTP、25mmol/L Tris-HCl、12. 5mmol/L KC1、12. 5mmol/L (NH4) 2S04、10mmol/L MgSO4 · 7H20、0. 125 體積 ％ TritonX-100、lmol/L 甜菜堿； 所述的顯色液為STOR Green I,1000X,2yL； 所述的內(nèi)引物FIP/BIP的濃度為0. 2 μ mol/L ； 所述的外引物F3/B3的濃度為1.6 μ mol/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求3、4或5所述的桑蠶微粒子病檢驗(yàn)試劑盒，其特征在于，所述的桑蠶微粒子病檢驗(yàn)試劑盒還包括反應(yīng)管，所述的反應(yīng)管由管體和管蓋兩部分組成，管體內(nèi)腔的下部設(shè)有將其分隔成A、B兩個(gè)空腔的縱向延伸的隔板。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的桑蠶微粒子病檢驗(yàn)試劑盒，其特征在于，所述的A、B兩個(gè)空腔中分別裝有工作液或顯色液，兩個(gè)空腔中的液體上層均由穩(wěn)定液封存，所述工作液為反應(yīng)液和fei DNA聚合酶的混合而成。
8.一種使用如權(quán)利要求3所述的桑蠶微粒子病檢驗(yàn)試劑盒的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟(1)取待測試樣50μ L注入1.5mL無菌離心管中；(2)在步驟(1)的離心管加入樣品預(yù)處理液100μ L，混合均勻，沸水浴15min滅活后冰浴上冷卻，高速離心，上清即為樣品模板DNA ；(3)在反應(yīng)容器中加入feiDNA聚合酶0. 9 1. 8體積份數(shù)、反應(yīng)液38 40體積份數(shù)、 穩(wěn)定液5(Γ55體積份數(shù)、樣品模板DNA 5、體積份數(shù)、內(nèi)引物FIP/BIP各2體積份數(shù)、外引物F3/B3各4體積份數(shù)，恒溫反應(yīng)；(4)在上述反應(yīng)容器和陽性對照樣本中分別加入顯色液，混勻，樣品組顯色與對照組相同則為陽性，否則為陰性；所述步驟(3)中的外引物F3/B3和內(nèi)引物FIP/BIP為以桑蠶微粒子病Λ(力靶基因、基于環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)設(shè)計(jì)的兩對引物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的使用桑蠶微粒子病檢驗(yàn)試劑盒的方法，其特征在于，所述的兩對引物為外引物F3 (1) CAGGAGTTGCTTTTGCGA 外引物Β3 (1) AAACGGATTCAGCAGGTA 內(nèi)引物FIP (1)GAAAGCGCTGCTCAAAGCAGttttTGTGCCATTGAATGTCAGA 內(nèi)引物BIP (1)CTGCGCTACCAGCGTTGTTAttttATATCACCATCGGTGGAAG 或外引物F3 (2) CTTTGAGCAGCGCTTTCA 外引物B3 (2) GGGTAAATCTGTTAATGGTTCTT 內(nèi)引物FIP (2)GCATACGTAGACGATGCAGGCttttCAGCTTTAGCTGCGCTAC 內(nèi)引物BIP (2)GGCTTCCACCGATGGTGATAttttACACCACAAAAGATGGTACTG 或外引物F3 (3) CAGGAGTTGCTTTTGCGA 外引物B3 (3) AAACGGATTCAGCAGGTA 內(nèi)引物FIP (3)GAAAGCGCTGCTCAAAGCAGTGTGCCATTGAATGTCAGA 內(nèi)引物BIP (3)CTGCGCTACCAGCGTTGTTAATATCACCATCGGTGGAAG 或外引物F3 (4) CTTTGAGCAGCGCTTTCA 外引物B3 (4) GGGTAAATCTGTTAATGGTTCTT 內(nèi)引物FIP (4)GCATACGTAGACGATGCAGGCCAGCTTTAGCTGCGCTAC 內(nèi)引物BIP (4)GGCTTCCACCGATGGTGATAACACCACAAAAGATGGTACTG。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的使用桑蠶微粒子病檢驗(yàn)試劑盒的方法，其特征在于， 步驟(3)中，恒溫反應(yīng)的反應(yīng)條件為溫度63士2°C，反應(yīng)時(shí)間45 90min。
全文摘要
本發(fā)明提供一種桑蠶微粒子病檢驗(yàn)試劑盒，所述的桑蠶微粒子病(Nb)檢驗(yàn)試劑盒包括以桑蠶微粒子病孢子為靶基因、基于環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)設(shè)計(jì)的兩對引物外引物F3/B3和內(nèi)引物FIP/BIP。本發(fā)明的桑蠶微粒子病檢驗(yàn)試劑盒檢測效果更全面、漏檢率低，可代替?zhèn)鹘y(tǒng)的顯微鏡檢測技術(shù)。
文檔編號C12Q1/68GK102154517SQ201110071349
公開日2011年8月17日 申請日期2011年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月24日
發(fā)明者余愛群, 馮雪梅, 曹以誠, 杜正平, 王先燕, 胡智明, 邱國祥, 陳洵, 黃自然 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué), 廣東省蠶業(yè)技術(shù)推廣中心, 廣州華峰生物科技有限公司