專利名稱：沙門氏菌lamp快速檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制品領(lǐng)域，涉及一種利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)快速檢測(cè)沙門氏菌的檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
沙門氏菌病是公共衛(wèi)生學(xué)上具有重要意義的人畜共患病之一，據(jù)世界衛(wèi)生組織的報(bào)告，1985年以來，在世界范圍內(nèi)，由沙門氏菌引起的已確診的人類患病人數(shù)顯著增加，在一些歐洲國(guó)家已增加五倍以上。在我國(guó)內(nèi)陸地區(qū)，由沙門氏菌引起的食物中毒屢居首位。據(jù)資料統(tǒng)計(jì)，在我國(guó)細(xì)菌性食物中毒中，70% 80%是由沙門氏菌引起，而在引起沙門氏菌中毒的食品中，90%以上是肉類等動(dòng)物性產(chǎn)品。動(dòng)物性產(chǎn)品中含有多種豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，非常適宜于沙門氏菌的生長(zhǎng)繁殖，人們一旦攝入了含有大量沙門氏菌的動(dòng)物性產(chǎn)品，就會(huì)引起細(xì)菌性感染，進(jìn)而在毒素的作用下發(fā)生食物中毒。由沙門氏菌引起的疾病主要分為兩大類一類是傷寒和副傷寒，另一類是急性腸胃炎。其中鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、腸炎沙門氏菌等是污染動(dòng)物性產(chǎn)品，進(jìn)而引起人類沙門氏菌食物中毒的主要致病菌。沙門氏菌污染主要來源于患病的人和動(dòng)物及其帶菌者，主要由其糞便、尿、乳汁以及流產(chǎn)胎兒、胎衣和羊水排出的病菌污染水源、土壤和飼料等，其中飼料和水源的污染是導(dǎo)致沙門氏菌傳染的主要原因。各種飼料中均可發(fā)現(xiàn)沙門氏菌，尤其是動(dòng)物性飼料(如魚粉)常見。鑒于沙門氏菌對(duì)人類健康的嚴(yán)重危害，目前世界各國(guó)政府對(duì)動(dòng)物性飼料中沙門氏菌的限量標(biāo)準(zhǔn)均制定出非常嚴(yán)格的規(guī)定，對(duì)動(dòng)物性飼料中沙門氏菌的規(guī)定均為不得檢出，為所有微生物限量標(biāo)準(zhǔn)中的最嚴(yán)格級(jí)。目前已建立多種針對(duì)沙門氏菌的檢測(cè)方法，如常規(guī)的檢測(cè)方法、免疫學(xué)為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法和以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法等，但是這些方法或耗時(shí)長(zhǎng)，或敏感性差、或特異性不強(qiáng)。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(LAMP)是一種新型的核酸擴(kuò)增方法，該方法針對(duì)病原保守基因上的八個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)六條特異性引物，利用BstDNA聚合酶在60°C 65°C進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增 30-60min，通過觀察反應(yīng)液濁度并結(jié)合染料顏色變化判定結(jié)果，該方法靈敏、快速、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單，不需要特殊儀器，成本低，可用于產(chǎn)品現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)?，F(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)有沙門氏菌LAMP檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，在實(shí)際使用過程中， 還是存在檢測(cè)試劑盒的配置不夠合理，反應(yīng)體系不夠穩(wěn)定，以及所設(shè)計(jì)引物的針對(duì)性和靈敏度不夠高等缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種靈敏、特異、簡(jiǎn)便、引物針對(duì)性強(qiáng)的沙門氏菌LAMP快速檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。本發(fā)明的沙門氏菌LAMP快速檢測(cè)試劑盒由提取沙門氏菌基因組試劑和LAMP反應(yīng)試劑組成；
4所述提取沙門氏菌基因組試劑包括SDS、蛋白酶K，CTAB/NaCl溶液和NaAC ； 所述LAMP反應(yīng)試劑由反應(yīng)液A和反應(yīng)液B組成，反應(yīng)液A含有IOX Lamp buffer,Bst DNA聚合酶、dNTP、內(nèi)引物1、內(nèi)引物2、外引物1、外引物2，甜菜堿、超純水，其中
IOX Lamp buffer 含有 200mM Tris-HCl (pH 8.8 ,25° C)、IOOmM氯化鉀、IOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和1%曲拉通X-100 ；
內(nèi)引物 1 為AAGAGGCRCCTTGCGCTAAAGTTTTTGCCAAACCTCGCTTATCGG ； 內(nèi)引物 2 為TAGCACGTCAGCAAAGCGTACCTTTTTGTGGGGAAGGTTAAGGAGG ； 外引物 1 為CTGTACGCGAAGCCTTGTT ； 外引物 2 為ACTGCTGGAkCAGCCGRA ； 反應(yīng)液B為熒光染料。上述提取沙門氏菌基因組試劑中，SDS濃度10mg/ml、蛋白酶K濃度10mg/ml，CTAB/ NaCl溶液和NaAC濃度3M。上述LAMP反應(yīng)試劑中，聚合酶濃度8U/μ 1、dNTP濃度2. 5 mM、內(nèi)引物1濃度 40 μ M、內(nèi)引物2濃度40 μ Μ、外引物1濃度5 μ Μ、外引物2濃度5 μ Μ，甜菜堿濃度5Μ。所述熒光染料為1000XSYBR Green I。本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)沙門氏菌的方法包括以下步驟
a.組織樣品中DNA的提取，具體步驟
1)、取ImL沙門氏菌，10000rpm，5min，棄上清；
2)、菌體沉淀，用600μ TE 懸浮，并加 6(^L10%SDS，6PLproteinK10mg/ml，混勻，37°C，
lh;
3)、加180μ 5mol/L NaCl，混勻，再加入 180μ CTAB/NaCl 溶液，混勻，65°C，20min ；
4)、用與上一步驟液體等體積的酚和氯仿混合溶液抽提，混合溶液中的酚和氯仿體積比為25 :24，離心12000rpm，5min，移取上清至干凈EP管中；
5)、重復(fù)步驟4;
6)、取上清，約500μ ，加入 6“L RNAse，37°C，30min ；
7)、加入ImL 100% 無水乙醇，50μ 3Μ NaAc, -20°C,90min ；
8)、12000rpm，5min,棄上清，加入75%乙醇200μ 沖洗沉淀；
9)、棄上清，加入40μ TE溶解DNA，有白色沉淀溶解，作為模板備用；
b.沙門氏菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，具體步驟
在裝有22 μ 1的LAMP反應(yīng)試劑的反應(yīng)管中加入3 μ 1待檢DNA，于63_65°C恒溫水浴箱中放置45min ；
c.擴(kuò)增產(chǎn)物的顯色檢測(cè)，具體步驟
在步驟b反應(yīng)結(jié)束后，加入1 μ 1的1000 X STOR Green I熒光染料；直接用肉眼觀察顏色變化，顏色變?yōu)榫G色，則說明樣品中含有沙門氏菌；顏色為橙色，說明樣品不含沙門氏菌。本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)沙門氏菌的方法所需周期長(zhǎng)、靈敏度較低、成本高、 現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用困難等缺陷，提供的沙門氏菌的檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，對(duì)沙門氏菌進(jìn)行LAMP 檢測(cè)，快速、準(zhǔn)確性高、靈敏性好、現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用方便，可廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)、食品、出入境檢疫等領(lǐng)域。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例
按下列配方制作沙門氏菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒；
1、提取沙門氏菌基因組
1 )、取ImL沙門氏菌，IOOOOrpm, 5min,棄上清。2)、菌體沉淀，用 600μ TE 懸浮，并加 6(^L10%SDS，6PLproteinK10mg/ml，混勻， 37°C, Ih03)、力Π 180μ 5mol/L NaCl,混勻，再加入 180μ CTAB/NaCl 溶液，混勻，65°C， 20mino4)、用等體積酚氯仿(25 :24)抽提，12000rpm，5min，移取上清至干凈EP管中。5)、重復(fù)步驟4。6)、取上清，約 500μ ，加入 6μ RNAse，37°C，30min。7)、加入 ImL 100% 無水乙醇，50μ 3Μ NaAc，_20°C，90min。8)、12000rpm，5min，棄上清，加入75%乙醇200μ 沖洗沉淀。9)、棄上清，加入40μ TE溶解DNA，有白色沉淀溶解，作為模板備用。2、配制LAMP反應(yīng)試劑，包括以下成分
1)、反應(yīng)液A含有 IOX Lamp buffer,Bst DNA 聚合酶8υ/μ1、2·5 mM dNTP、40yM內(nèi)引物1、40μΜ內(nèi)引物2、5μΜ外引物1、5μΜ外引物2、甜菜堿(5Μ)、超純水，其中
IOX Lamp buffer含有200mM Tris-HCl (pH 8.8 ,25° C)、IOOmM氯化鉀、IOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和1%曲拉通X-100 ； 所含引物序列為
內(nèi)引物 1 為AAGAGGCRCCTTGCGCTAAAGTTTTTGCCAAACCTCGCTTATCGG 內(nèi)引物 2 為TAGCACGTCAGCAAAGCGTACCTTTTTGTGGGGAAGGTTAAGGAGG 外引物 1 為CTGTACGCGAAGCCTTGTT 外引物 2 為ACTGCTGGAkCAGCCGRA
2)、反應(yīng)液B :1000XSYBR Green I。反應(yīng)液A每次反應(yīng)由22 μ 1組成，其配制如下
2.5μ 1 IOX Lamp bufferU. 0μ 1 Bst DNA 聚合酶(8U/μ 1 )、4 μ 1 2. 5 mM dNTP、 0. 5μ 1 40μΜ 內(nèi)引物 1、0. 5μ 1 40μΜ 內(nèi)引物 2、0. 5μ 1 5μΜ 外引物 1、0. 5μ 1 5μΜ 夕卜弓 I 物2，5 μ 1甜菜堿(5Μ)和7. 5 μ 1滅菌超純水。3、沙門氏菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增
在裝有22 μ 1反應(yīng)液A的反應(yīng)管中加入3 μ 1待檢DNA，于63_65°C恒溫水浴箱中放置 45min ；
4、擴(kuò)增產(chǎn)物的顯色檢測(cè)
在上述反應(yīng)結(jié)束后，加入Ιμ 1反應(yīng)液B，直接用肉眼觀察顏色變化，如顏色變?yōu)榫G色， 則說明樣品中含有沙門氏菌；如果顏色為橙色，說明樣品不含沙門氏菌。
試驗(yàn)例1 本發(fā)明試劑盒在檢測(cè)沙門氏菌中的應(yīng)用效果敏感性和臨床檢測(cè)。
一、敏感性1. 1樣品豬霍亂沙門氏菌(原始濃度為6. 2X IO6CFU/μ 1)
1.2樣品處理將豬霍亂沙門氏菌DNA (原始濃度為6. 2 X IO6CFU/ μ 1)做ΚΓ-ΙΟ-7的倍比稀釋。1. 3檢測(cè)體系各組分配比如下
沙門氏菌LAMP檢測(cè)試劑盒反應(yīng)液A由22μ 1組成，其配制如下
2.5μ 1 IOX Lamp bufferU. Ομ 1 Bst DNA 聚合酶(8U/μ 1 )、4 μ 1 2. 5 mM dNTP、 0. 5μ 1 40μΜ 內(nèi)引物 1、0. 5μ 1 40μΜ 內(nèi)引物 2、0. 5μ 1 5μΜ 外引物 1、0. 5μ 1 5μΜ 夕卜弓 I 物2，5 μ 1甜菜堿(5Μ)和7. 5 μ 1滅菌超純水。1. 4沙門氏菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)
在裝有22 μ 1反應(yīng)液A的反應(yīng)管中加入3 μ 1待檢DNA，于63_65°C恒溫水浴箱中放置 45min ；
1.5擴(kuò)增產(chǎn)物的顯色檢測(cè)
在上述反應(yīng)結(jié)束后，加入 μ 1反應(yīng)液B，直接用肉眼觀察顏色變化，如顏色變?yōu)榫G色， 則說明樣品中含有沙門氏菌；如果顏色為橙色，說明樣品不含沙門氏菌。1. 6試劑盒的敏感性結(jié)果
試驗(yàn)結(jié)果表明采用本發(fā)明試劑盒最低檢測(cè)6 CFU/管，表明本發(fā)明試劑盒具有很高的敏感性。二、臨床檢測(cè)
2.1樣品臨床采集的沙門氏菌陽(yáng)性與陰性樣品 2. 2檢測(cè)體系各組分配比如下
沙門氏菌LAMP檢測(cè)試劑盒反應(yīng)液A由22μ 1組成，其配制如下 2. 5μ 1 IOX Lamp bufferU. Ομ 1 Bst DNA 聚合酶(8U/μ 1 )、4 μ 1 2. 5 mM dNTP、 0. 5μ 1 40μΜ 內(nèi)引物 1、0. 5μ 1 40μΜ 內(nèi)引物 2、0. 5μ 1 5μΜ 外引物 1、0. 5μ 1 5μΜ 夕卜弓 I 物2，5 μ 1甜菜堿(5Μ)和7. 5 μ 1滅菌超純水。2. 3沙門氏菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)
在裝有22 μ 1反應(yīng)液A的反應(yīng)管中加入3 μ 1待檢DNA，于63_65°C恒溫水浴箱中放置 45min ；
2. 4擴(kuò)增產(chǎn)物的顯色檢測(cè)
在上述反應(yīng)結(jié)束后，加入1μ 1反應(yīng)液B，直接用肉眼觀察顏色變化，含有沙門氏菌的樣品變?yōu)榫G色；不含沙門氏菌的樣品，顏色為橙色。
權(quán)利要求
1.一種沙門氏菌LAMP快速檢測(cè)試劑盒由提取沙門氏菌基因組試劑和LAMP反應(yīng)試劑組成；其特征是所述提取沙門氏菌基因組試劑包括SDS、蛋白酶K，CTAB/NaCl溶液和NaAC ； 所述LAMP反應(yīng)試劑由反應(yīng)液A和反應(yīng)液B組成，反應(yīng)液A含有IOX Lamp buffer、Bst DNA聚合酶、dNTP、內(nèi)引物1、內(nèi)引物2、外引物 1、外引物2，甜菜堿、超純水，其中IOX Lamp buffer 含有 200mM Tris-HCl (pH 8.8 ,25° C)、IOOmM氯化鉀、IOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和1%曲拉通X-100 ；內(nèi)引物 1 為AAGAGGCRCCTTGCGCTAAAGTTTTTGCCAAACCTCGCTTATCGG 內(nèi)引物 2 為TAGCACGTCAGCAAAGCGTACCTTTTTGTGGGGAAGGTTAAGGAGG 外引物 1 為 KTGIWCGCGAAGCCTTGTT 外引物 2 為ACTGCTGGAkCAGCCGRA 反應(yīng)液B為熒光染料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的沙門氏菌LAMP快速檢測(cè)試劑盒，其特征是提取沙門氏菌基因組試劑中，SDS濃度10mg/ml、蛋白酶K濃度10mg/ml，CTAB/NaCl溶液和NaAC濃度3M。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的沙門氏菌LAMP快速檢測(cè)試劑盒，其特征是所述LAMP反應(yīng)試劑中，聚合酶濃度8U/y l、dNTP濃度2. 5 mM、內(nèi)引物1濃度40 μ Μ、內(nèi)引物2濃度40 μ Μ、 外引物1濃度5 μ Μ、外引物2濃度5 μ Μ,甜菜堿濃度5Μ。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的沙門氏菌LAMP快速檢測(cè)試劑盒，其特征是所述熒光染料為 1000XSYBR Green I。
5.一種用權(quán)利要求1所述試劑盒檢測(cè)沙門氏菌的方法，包括以下步驟a.組織樣品中DNA的提取，具體步驟1)、取ImL沙門氏菌，10000rpm，5min，棄上清；2)、菌體沉淀，用600μ TE 懸浮，并加 6(^L10%SDS，6PLproteinK10mg/ml，混勻，37°C，lh;3)、加180μ 5mol/L NaCl，混勻，再加入 180μ CTAB/NaCl 溶液，混勻，65°C，20min ；4)、用與上一步驟液體等體積的酚和氯仿混合溶液抽提，混合溶液中的酚和氯仿體積比為25 :24，離心12000rpm，5min，移取上清至干凈EP管中；5)、重復(fù)步驟4;6)、取上清，約500μ ，加入 6“L RNAse，37°C，30min ；7)、加入ImL 100% 無水乙醇，50μ 3Μ NaAc，-20°C，90min ；8)、12000rpm，5min,棄上清，加入75%乙醇200μ 沖洗沉淀；9)、棄上清，加入40μ TE溶解DNA，有白色沉淀溶解，作為模板備用；b.沙門氏菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，具體步驟在裝有22 μ 1的LAMP反應(yīng)試劑的反應(yīng)管中加入3 μ 1待檢DNA，于62_64°C恒溫水浴箱中放置45min ；c.擴(kuò)增產(chǎn)物的顯色檢測(cè)，具體步驟在步驟b反應(yīng)結(jié)束后，加入1μ 1的1000 X STOR Green I熒光染料；直接用肉眼觀察顏色變化，顏色變?yōu)榫G色，則說明樣品中含有沙門氏菌；顏色為橙色，說明樣品不含沙門氏菌。.
全文摘要
本發(fā)明屬于生物制品領(lǐng)域，涉及一種利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)快速檢測(cè)沙門氏菌的，檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。其試劑盒由提取沙門氏菌基因組試劑和LAMP反應(yīng)試劑組成；所述提取沙門氏菌基因組試劑包括SDS、蛋白酶K，CTAB/NaCl溶液和NaAC；所述LAMP反應(yīng)試劑由反應(yīng)液A和反應(yīng)液B組成；反應(yīng)液A含有10×Lampbuffer、BstDNA聚合酶、dNTP、內(nèi)引物1、內(nèi)引物2、外引物1、外引物2，甜菜堿、超純水；反應(yīng)液B為熒光染料。本發(fā)明對(duì)沙門氏菌進(jìn)行LAMP檢測(cè)，快速、準(zhǔn)確性高、靈敏性好、現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用方便，可廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)、食品、出入境檢疫等領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102199665SQ20111007570
公開日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2011年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月29日
發(fā)明者劉駿, 吳小華, 孫園園, 朱金連, 王富海, 趙鵬, 錢科 申請(qǐng)人:鎮(zhèn)江出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫綜合技術(shù)中心