專利名稱：一種用馬杜拉放線菌轉(zhuǎn)化康百汀生產(chǎn)普伐他汀的發(fā)酵工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物制備領(lǐng)域，尤其涉及普伐他汀的制備，具體涉及一種可提高二步發(fā)酵法生產(chǎn)普伐他汀產(chǎn)量的發(fā)酵工藝。
背景技術(shù)：
普伐他汀是3-羥基3-甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，最初用于治療高血脂癥和家族性高膽固醇，后來(lái)適應(yīng)癥不斷擴(kuò)大，可以減緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展，減少冠狀動(dòng)脈粥樣硬化病變和臨床心血管事件的發(fā)生。長(zhǎng)期服用普伐他汀，無(wú)論病人是否患有冠心病，都能減低各種原因所致的死亡率，因此，普伐他汀成為目前他汀類藥物中僅有的可用于膽固醇水平較高的或者冠心病的病人進(jìn)行心臟病、中風(fēng)一級(jí)和二級(jí)防御的藥物。 也有研究顯示，普伐他汀還能降低糖尿病和阿爾茨海默病的發(fā)生率；能抑制肝癌細(xì)胞的增殖；能有效地治療潰瘍性結(jié)腸炎，副作用少，半年復(fù)發(fā)率低；在治療慢性心力衰竭、舒張性心力衰竭方面，可改善心功能，改善心室重塑。普伐他汀的生產(chǎn)通常由兩步發(fā)酵過(guò)程獲得，雖然也有報(bào)道或?qū)＠?W099/10499、W02007/147827、US 6，274，360和EP I, 266，967)描述可用一步發(fā)酵的方法生產(chǎn)獲得普伐他汀，但由于技術(shù)復(fù)雜及生產(chǎn)效率等原因，普伐他汀的工業(yè)化生產(chǎn)仍以兩步發(fā)酵為主。普伐他汀的兩步發(fā)酵過(guò)程為首先，通過(guò)桔青霉(Penicillium citrinum)等微生物發(fā)酵生產(chǎn)獲得其次級(jí)代謝產(chǎn)物康百汀Compactin (又名美伐他汀Mevastatin),然后,通過(guò)微生物酶的轉(zhuǎn)化作用，將康百汀轉(zhuǎn)化為普伐他汀?，F(xiàn)有的專利或文獻(xiàn)資料公開的將康百汀轉(zhuǎn)化為普伐他汀的微生物主要包括以下幾類絲狀霉菌(Mortierella maculata, W000/46175)、根毛霉菌(Mucor Rhizopus,US4448979)、諾卡氏菌(Norcardia, US5830695)、馬杜拉放線菌(Actinomadura,W096/40863)、鏈霉菌(Streptomyces Carbopilus EP215665)、脫葉鏈霉菌(Streptomycesexfoliates, W098/45410)和粉白小多抱菌(Micropolyspora roseoalba, CN03141475A)
坐 寸o按照公開的專利，上述的霉菌、絲狀細(xì)菌、放線菌和鏈霉菌均可以將康百汀轉(zhuǎn)化成普伐他汀，然而，由于康百汀對(duì)微生物轉(zhuǎn)化菌的毒害作用，使得微生物不能耐受添加到培養(yǎng)物中的甚至是低濃度的康百汀，現(xiàn)有技術(shù)下微生物轉(zhuǎn)化菌對(duì)底物康百汀的耐受濃度為0. 01-0. 05%。盡管李周靈等(W098/45410)獲得的脫葉鏈霉菌YJ-118表現(xiàn)了較高(0. 1-0. 5% )的底物抗性，Metkinen(Metkinen News March 2000, Metkinen 0y, Finland ；reviewed byManzoni and Rollini, 2002, Appl Microbiol Biotechnol 58:555-564)也獲得了對(duì) 3g/L康百汀具有抗性的Streptomyces突變菌株，但其普伐他汀產(chǎn)率不高。
雖然W096/40863公開了馬杜拉放線菌(Actinomadura)ATCC 55678轉(zhuǎn)化康百汀生產(chǎn)普伐他汀的方法，但未提及微量元素配方在其中的應(yīng)用，也未提及發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程分別控制菌體增殖培養(yǎng)溫度和康百汀轉(zhuǎn)化溫度對(duì)普伐他汀產(chǎn)量提高的有益作用。
目前，普伐他汀發(fā)酵生產(chǎn)水平大多在lOg/L左右，作為商業(yè)應(yīng)用的規(guī)模生產(chǎn)，這樣的生產(chǎn)水平仍有較大的提高空間。對(duì)于二步發(fā)酵法生產(chǎn)普伐他汀來(lái)說(shuō)，其第二步-由微生物轉(zhuǎn)化康百汀為普伐他
汀是影響普伐他汀產(chǎn)量的關(guān)鍵性步驟，而在這一步中，如何提高微生物對(duì)底物康百汀的轉(zhuǎn)化能力和普伐他汀發(fā)酵水平是降低普伐他汀生產(chǎn)成本、增加普伐他汀產(chǎn)量以提高經(jīng)濟(jì)效益的最有效途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種可有效提高微生物對(duì)底物康百汀的轉(zhuǎn)化能力、提高普伐他汀發(fā)酵水平，且操作簡(jiǎn)單、成本低廉的用馬杜拉放線菌轉(zhuǎn)化康百汀生產(chǎn)普伐他汀的發(fā)酵工藝。
本發(fā)明的上述目的是通過(guò)如下方案予以實(shí)現(xiàn)的一種用馬杜拉放線菌轉(zhuǎn)化康百汀生產(chǎn)普伐他汀的發(fā)酵工藝，該發(fā)酵工藝和現(xiàn)有工藝相似，也是先對(duì)馬杜拉放線菌在種子培養(yǎng)基中進(jìn)行種子培養(yǎng)，然后在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種種子培養(yǎng)后的馬杜拉放線菌，并且向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入康百汀，在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中馬杜拉放線菌將康百汀轉(zhuǎn)化成普伐他汀，發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束得到所需普伐他汀。但是現(xiàn)有工藝中普伐他汀產(chǎn)量很低，為了克服這個(gè)缺陷，本發(fā)明人對(duì)整個(gè)工藝中的多項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行了研究，如種子培養(yǎng)中培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件、發(fā)酵培養(yǎng)中培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件等，最終發(fā)現(xiàn)，向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入微量元素溶液，可提高馬杜拉放線菌對(duì)康百汀的轉(zhuǎn)化能力，提高普伐他汀的發(fā)酵水平，從而提高普伐他汀的產(chǎn)量。上述微量元素溶液是按如下配方配制而得鑰酸鈉(Na2MoO4 2H20) 0. I 0. 2g/L ；硼酸(H3BO3)I. 0 I. 5g/L ；氯化錳(MnCl2 H2O)0. I 0. 2g/L ；硫酸鋅(ZnSO4 7H20)5. 0 5. 5g/L ；硫酸亞鐵(FeSO4 7H20) I. 5 2. Og/L ；硝酸鈉(NaNO3)3. 0 3. 3g/L ；檸檬酸(C6H8O7)I. 5 2. Og/L ；硫酸銅(CuSO4 5H20)0. 2 0. 3g/L。針對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基配方的改變，發(fā)明人又對(duì)改進(jìn)后的工藝進(jìn)行了工藝參數(shù)的優(yōu)化，并最終發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵培養(yǎng)基配方改變的基礎(chǔ)上，再分別控制馬杜拉放線菌的培養(yǎng)溫度和馬杜拉放線菌轉(zhuǎn)化康百汀為普伐他汀的轉(zhuǎn)化溫度，可更加好地提高馬杜拉放線菌對(duì)康百汀的轉(zhuǎn)化能力，提高普伐他汀的發(fā)酵水平，從而提高普伐他汀的產(chǎn)量。上述馬杜拉放線菌的培養(yǎng)溫度控制在35 37°C ；上述馬杜拉放線菌轉(zhuǎn)化康百汀為普伐他汀的轉(zhuǎn)化溫度控制在27 29°C。本發(fā)明的一種用馬杜拉放線菌轉(zhuǎn)化康百汀生產(chǎn)普伐他汀的發(fā)酵工藝，該發(fā)酵工藝的具體步驟如下所示步驟I種子培養(yǎng)首先按照如下配方配制種子培養(yǎng)基
葡萄糖30g/L、酵母提取物 20g/L、大豆蛋白胨 5g/L、K2HP04 3H202g/L,MgS04 *7H200. 5g/L ；向上述種子培養(yǎng)基中接種馬杜拉放線菌(Actinomadura),接種后在35 37°C下培養(yǎng)48 72小時(shí)；步驟2發(fā)酵培養(yǎng)首先按照如下配方配制發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖60g/L、酵母提取物 25g/L、大豆蛋白胨 5g/L、K2HP04 3H202g/L,MgS04 *7H20
0.5g/L、(NH4)2SO4 2g/L、微量元素溶液 2. Oml/L 和消沫劑 I. Og/L ；向發(fā)酵培養(yǎng)基中接種經(jīng)步驟I種子培養(yǎng)后的馬杜拉放線菌，接種后先在35 37°C 下進(jìn)行增殖培養(yǎng)30 40小時(shí)，然后調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基溫度為27 29°C后補(bǔ)入康百汀溶液，27 29°C下培養(yǎng)72 156小時(shí)實(shí)現(xiàn)馬杜拉放線菌轉(zhuǎn)化康百汀為普伐他汀，在27 29°C下培養(yǎng)72 156小時(shí)的過(guò)程中，監(jiān)測(cè)發(fā)酵液中康百汀的濃度，需維持康百汀在發(fā)酵液中的濃度為 0. 3 0. 7g/L。發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，檢測(cè)普伐他汀含量和康百汀的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)康百汀的轉(zhuǎn)化率達(dá)70%以上，普伐他汀發(fā)酵生產(chǎn)水平達(dá)18g/L以上。與現(xiàn)有技術(shù)相比，生產(chǎn)水平提高幅度達(dá)60%以上，轉(zhuǎn)化率提高達(dá)10個(gè)百分點(diǎn)以上，由此說(shuō)明本發(fā)明的發(fā)酵工藝可大幅度提高普伐他汀生產(chǎn)效率及其產(chǎn)量。上述發(fā)酵工藝中，種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中所用到的葡萄糖、酵母提取物、大豆蛋白胨為本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行培養(yǎng)基配制時(shí)所常用的碳源和氮源成分，本領(lǐng)域技術(shù)人員在實(shí)現(xiàn)本發(fā)明時(shí)只需購(gòu)買市售的培養(yǎng)基配制時(shí)常用的葡萄糖、酵母提取物和大豆蛋白胨即可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明；本發(fā)明的種子培養(yǎng)除了培養(yǎng)過(guò)程的溫度需控制在35 37°C外，其余操作和參數(shù)均采用現(xiàn)有技術(shù)即可；本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)除了培養(yǎng)基中加入的微量元素溶液、控制馬杜拉放線菌的培養(yǎng)溫度(35 37°C )和控制轉(zhuǎn)化溫度(27 29°C )夕卜，其余操作和參數(shù)均采用現(xiàn)有技術(shù)即可。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果I.本發(fā)明人通過(guò)對(duì)發(fā)酵工藝中的多種影響參數(shù)進(jìn)行研究后，確定了將微量元素引入發(fā)酵過(guò)程中的方案；微量元素與酶的活動(dòng)密切有關(guān)，或是酶的活性基團(tuán)成分，或是酶的激活劑，微量元素主要包括鐵、銅、鋅、錳、硼、鈷、鑰等，它們?cè)谂囵B(yǎng)基中，一般僅需含有萬(wàn)分之一甚至更少，濃度太低，不能滿足微生物生長(zhǎng)的需要，濃度太高，又會(huì)抑制甚至毒害微生物生長(zhǎng)；有鑒于此，本發(fā)明人通過(guò)長(zhǎng)期而深入的研究，最終確定了微量元素溶液的配方，及其在發(fā)酵培養(yǎng)基中的添加量，充分利用微量元素的作用，達(dá)到提高微生物底物轉(zhuǎn)化能力和提高普伐他汀發(fā)酵水平的目的；2.本發(fā)明通過(guò)分別控制微生物培養(yǎng)過(guò)程和微生物轉(zhuǎn)化過(guò)程的溫度，在添加微量元素溶液的前提下，有效提高微生物轉(zhuǎn)化菌——馬杜拉放線菌對(duì)康百汀的轉(zhuǎn)化能力、提高普伐他汀發(fā)酵水平，且其發(fā)酵水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于現(xiàn)有技術(shù)的水平；3.本發(fā)明通過(guò)研究控制種子培養(yǎng)過(guò)程的溫度為35 37°C，該溫度為菌體繁殖的最適溫度，在該溫度下菌種生長(zhǎng)迅速；本發(fā)明將種子培養(yǎng)后的菌體轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制增殖培養(yǎng)的溫度為35 37°C，縮短菌體生長(zhǎng)的延滯期、提前進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，有利于菌體大量增殖；
4.本發(fā)明的發(fā)酵工藝操作簡(jiǎn)便、成本低廉，適合于大規(guī)模的生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步地描述，但具體實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何限定。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或生產(chǎn)廠商推薦的條件進(jìn)行。本發(fā)明的馬杜拉放線菌(Actinomadura)采用任何一種現(xiàn)有公開文獻(xiàn)中，可將康百汀轉(zhuǎn)化為普伐他汀的馬杜拉放線菌屬的菌種，均可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。下述實(shí)施例中的馬杜拉放線菌(Actinomadura)采用美國(guó)典型微生物菌種保藏中心保藏號(hào)為ATCC55678 (W096/40863)的菌種。 本發(fā)明的下述實(shí)施例中，普伐他汀和康百汀含量按照韓明活等.《HPLC法測(cè)定普伐他汀生產(chǎn)樣品中相關(guān)組分的含量》.今日藥學(xué).2010,20(7)的方法進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明的實(shí)施例中，康百汀的轉(zhuǎn)化率以下述公式進(jìn)行計(jì)算轉(zhuǎn)化率=普伐他汀獲得量+康百汀使用量X 100%。實(shí)施例I本實(shí)施例的一種用馬杜拉放線菌轉(zhuǎn)化康百汀生產(chǎn)普伐他汀的發(fā)酵工藝，該發(fā)酵工藝的具體步驟如下所示本實(shí)施例的微量元素溶液是按如下配方配制而得鑰酸鈉(Na2MoO4 2H20)0. lg/L ；硼酸(H3BO3)I. Og/L ；氯化錳(MnCl2 H2O) 0. lg/L ；硫酸鋅(ZnSO4 7H20) 5. Og/L ；硫酸亞鐵(FeSO4 7H20) I. 5g/L ；硝酸鈉(NaNO3)3. Og/L ；檸檬酸(C6H8O7)I. 5g/L ；硫酸銅(CuSO4 5H20) 0. 2g/L。步驟I種子培養(yǎng)首先按照如下配方以IL搖瓶配制350mL種子培養(yǎng)基葡萄糖30g/L、酵母提取物 20g/L、大豆蛋白胨 5g/L、K2HP04 3H202g/L,MgS04 *7H200. 5g/L 和消沫劑 I. 0g/L。種子培養(yǎng)基滅菌后接入斜面種子馬杜拉放線菌(Actinomadura),在36°C下?lián)u床培養(yǎng)55h。步驟2發(fā)酵培養(yǎng)首先按照如下配方以5L全自動(dòng)發(fā)酵罐配制3L發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖60g/L，酵母提取物 25g/L，大豆蛋白胨 5g/L，K2HPO4 UH2OZgA^MgSO4 *7H200. 5g/L，(NH4)2SO4 2g/L，微量元素溶液 2. 0ml/L 消沫劑 I. 0g/L。發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后接入300mL種子液，在35 37°C下增殖培養(yǎng)40小時(shí)，調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度為27 29°C并在微生物轉(zhuǎn)化康百汀過(guò)程保持此溫度，補(bǔ)入康百汀溶液，以HPLC法檢測(cè)康百汀濃度使其維持在0. 2 0. 5g/L，培養(yǎng)至172h后停止補(bǔ)加康百汀溶液，培養(yǎng)至185h后結(jié)束發(fā)酵，檢測(cè)普伐他汀含量和康百汀含量分別為18612mg/L和12mg/L，共加入康百汀76. 5g，轉(zhuǎn)化率達(dá)73%。本實(shí)施例中發(fā)酵培養(yǎng)基中的增殖培養(yǎng)時(shí)間為40小時(shí)，馬杜拉放線菌轉(zhuǎn)化康百汀為普伐他汀的時(shí)間為145小時(shí)(185-40小時(shí))。實(shí)施例2本實(shí)施例采用50L全自動(dòng)發(fā)酵罐，用馬杜拉放線菌轉(zhuǎn)化康百汀生產(chǎn)普伐他汀，其發(fā)酵工藝的具體步驟如下所示
本實(shí)施例的微量元素溶液是按如下配方配制而得鑰酸鈉(Na2MoO4 2H20) 0. 2g/L ；硼酸(H3BO3)I. 5g/L ；氯化錳(MnCl2 H2O)0. 2g/L ；硫酸鋅(ZnSO4 7H20) 5. 5g/L ；硫酸亞鐵(FeSO4 7H20) 2. Og/L ；硝酸鈉(NaNO3)3. 3g/L ；檸檬酸(C6H8O7)2. Og/L ；硫酸銅(CuSO4 5H20) 0. 3g/L。種子培養(yǎng)方法同實(shí)施例I。發(fā)酵培養(yǎng)操作如下所示首先按照如下配方配制30L發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖60g/L，酵母提取物25g/L，大豆蛋白胨 5g/L，K2HPO4 3H20 2g/L，MgSO4 7H20 0. 5g/L，(NH4)2SO4 2g/L，微量元素溶液 2. Oml/L消沫劑I. Og/L。發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后接入2. 5L種子液，在35 37°C下培養(yǎng)32小時(shí)，調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度為27 29°C并在微生物轉(zhuǎn)化康百汀過(guò)程保持此溫度，補(bǔ)入康百汀溶液，以HPLC法檢測(cè)康百汀濃度使其維持在0. 3 0. 7g/L，培養(yǎng)至180小時(shí)后停止補(bǔ)加康百汀溶液，培養(yǎng)至188小時(shí)后結(jié)束發(fā)酵，檢測(cè)普伐他汀含量和康百汀含量分別為18598mg/L和10mg/L，共加入康百汀815. 2g，轉(zhuǎn)化率達(dá)73%。本實(shí)施例中發(fā)酵培養(yǎng)基中的增殖培養(yǎng)時(shí)間為32小時(shí)，馬杜拉放線菌轉(zhuǎn)化康百汀為普伐他汀的時(shí)間為156小時(shí)。實(shí)施例3對(duì)照實(shí)施例本實(shí)施例采用50L全自動(dòng)發(fā)酵罐，用馬杜拉放線菌轉(zhuǎn)化康百汀生產(chǎn)普伐他汀，本實(shí)施例發(fā)酵培養(yǎng)基中不添加微量兀素溶液，控制增殖培養(yǎng)溫度和轉(zhuǎn)化培養(yǎng)溫度均為35 37°C。實(shí)施步驟如下種子培養(yǎng)方法同實(shí)施例I。發(fā)酵培養(yǎng)操作如下所示 首先按照如下配方配制30L發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖60g/L，酵母提取物25g/L，大豆蛋白胨 5g/L，K2HPO4 3H20 2g/L，MgSO4 7H20 0. 5g/L，(NH4)2SO4 2g/L，消沫劑 I. 0g/L。發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后接入2. 5L種子液，發(fā)酵全過(guò)程在35 37°C下培養(yǎng)，培養(yǎng)至33小時(shí)開始補(bǔ)入康百汀溶液，以HPLC法檢測(cè)康百汀濃度使其維持在0. 3 0. 7g/L,培養(yǎng)至181小時(shí)后停止補(bǔ)加康百汀溶液，培養(yǎng)至188小時(shí)后結(jié)束發(fā)酵，檢測(cè)普伐他汀含量和康百汀含量分別為11372mg/L和18mg/L，共加入康百汀591.6g，轉(zhuǎn)化率62%。實(shí)施例4對(duì)照實(shí)施例本實(shí)施例采用50L全自動(dòng)發(fā)酵罐，用馬杜拉放線菌轉(zhuǎn)化康百汀生產(chǎn)普伐他汀，本實(shí)施例與實(shí)施例3相同，發(fā)酵培養(yǎng)基中不添加微量元素溶液，但在其余各項(xiàng)參數(shù)控制不變情況下，控制增殖培養(yǎng)溫度為35 37°C，培養(yǎng)33小時(shí)、轉(zhuǎn)化培養(yǎng)溫度為27 29°C，發(fā)酵培養(yǎng)至183小時(shí)結(jié)束，檢測(cè)普伐他汀含量和康百汀含量分別為13372mg/L和27mg/L，共加入康百汀622. 0g，轉(zhuǎn)化率65%。實(shí)施例5對(duì)照實(shí)施例本實(shí)施例采用50L全自動(dòng)發(fā)酵罐，用馬杜拉放線菌轉(zhuǎn)化康百汀生產(chǎn)普伐他汀，本實(shí)施例發(fā)酵培養(yǎng)基中添加微量元素溶液，但按照常規(guī)的溫度控制方法，發(fā)酵培養(yǎng)全過(guò)程控 制相同溫度35 37°C。實(shí)施步驟如下本實(shí)施例的微量元素溶液配方同實(shí)施例I。種子培養(yǎng)方法同實(shí)施例I。發(fā)酵培養(yǎng)操作如下所示首先按照以下配方配制30L發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖60g/L，酵母提取物25g/L，大豆蛋白胨 5g/L，K2HPO4 3H20 2g/L，MgSO4 7H20 0. 5g/L，(NH4)2SO4 2g/L，微量元素溶液 2. Oml/L，消沫劑I. Og/L。發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后接入2. 5L種子液，發(fā)酵全過(guò)程在35 37°C下培養(yǎng)，培養(yǎng)至35小時(shí)時(shí)開始補(bǔ)入康百汀溶液，以HPLC法檢測(cè)康百汀濃度使其維持在0. 3 0. 7g/L，培養(yǎng)至180小時(shí)后停止補(bǔ)加康百汀溶液，培養(yǎng)至190小時(shí)后結(jié)束發(fā)酵，檢測(cè)普伐他汀含量和康百汀含量分別為13466mg/L和24mg/L，共加入康百汀652. 5g，轉(zhuǎn)化率66%。實(shí)施例6對(duì)照實(shí)施例本實(shí)施例采用50L全自動(dòng)發(fā)酵罐，用馬杜拉放線菌轉(zhuǎn)化康百汀生產(chǎn)普伐他汀，本實(shí)施例與實(shí)施例5相同，發(fā)酵培養(yǎng)基中微量元素配方同實(shí)施例1，但按照常規(guī)的溫度控制方法，發(fā)酵培養(yǎng)全過(guò)程控制相同溫度27 29°C。發(fā)酵結(jié)束檢測(cè)普伐他汀含量和康百汀含量分別為14066mg/L和14mg/L,共加入康百汀671. 5g,轉(zhuǎn)化率67%。將實(shí)施例I 6的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果如表I所示。表I各實(shí)施例的數(shù)據(jù)對(duì)比
權(quán)利要求
1.一種用馬杜拉放線菌轉(zhuǎn)化康百汀生產(chǎn)普伐他汀的發(fā)酵工藝，該發(fā)酵工藝是先將馬杜拉放線菌在種子培養(yǎng)基中進(jìn)行種子培養(yǎng)，然后在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種種子培養(yǎng)后的馬杜拉放線菌進(jìn)行增殖培養(yǎng)后，向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入康百汀，發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后得到所需普伐他汀，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方中加有微量元素溶液，所述微量元素溶液是按如下配方配制而得 鑰酸鈉 0. I 0. 2g/L ； 硼酸 I. 0 I. 5g/L ； 氯化錳 0. I 0. 2g/L ； 硫酸鋅 5. 0 5. 5g/L ； 硫酸亞鐵I. 5 2. Og/L ； 硝酸鈉 3. 0 3. 3g/L ； 梓檬酸 I. 5 2. Og/L ； 硫酸銅 0. 2 0. 3g/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用馬杜拉放線菌轉(zhuǎn)化康百汀生產(chǎn)普伐他汀的發(fā)酵工藝，其特征在于所述將馬杜拉放線菌在種子培養(yǎng)基中進(jìn)行種子培養(yǎng)的溫度為35 37°C;所述在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種種子培養(yǎng)后的馬杜拉放線菌，進(jìn)行增殖培養(yǎng)的溫度為35 37°C ;所述增殖培養(yǎng)后，調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基溫度為27 29°C，向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入康百汀，發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后得到所需普伐他汀。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用馬杜拉放線菌轉(zhuǎn)化康百汀生產(chǎn)普伐他汀的發(fā)酵工藝，其特征在于所述種子培養(yǎng)時(shí)間為48 72小時(shí)；所述增殖培養(yǎng)時(shí)間為30 40小時(shí)；所述增殖培養(yǎng)后，調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基溫度為27 29°C，向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入康百汀，72 156小時(shí)后結(jié)束發(fā)酵培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用馬杜拉放線菌轉(zhuǎn)化康百汀生產(chǎn)普伐他汀的發(fā)酵工藝，其特征在于所述增殖培養(yǎng)后，調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基溫度為27 29°C，向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入康百汀，培養(yǎng)過(guò)程控制康百汀在發(fā)酵液中的濃度為0. 3 0. 7g/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至4中任一項(xiàng)所述的用馬杜拉放線菌轉(zhuǎn)化康百汀生產(chǎn)普伐他汀的發(fā)酵工藝，其特征在于所述發(fā)酵工藝具體包括如下步驟 步驟I種子培養(yǎng) 首先按照如下配方配制種子培養(yǎng)基 葡萄糖 30g/L、酵母提取物 20g/L、大豆蛋白胨 5g/L、K2HPO4 3H202g/L、MgSO4 7H200. 5g/L ； 向上述種子培養(yǎng)基中接種馬杜拉放線菌，接種后在35 37°C下培養(yǎng)48 72小時(shí)； 步驟2發(fā)酵培養(yǎng) 首先按照如下配方配制發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖 60g/L、酵母提取物 25g/L、大豆蛋白胨 5g/L、K2HPO4 3H202g/L、MgSO4 7H200. 5g/L、(NH4)2SO4 2g/L、微量元素溶液 2. Oml/L 和消沫劑 I. Og/L ； 向發(fā)酵培養(yǎng)基中接種經(jīng)步驟I種子培養(yǎng)后的馬杜拉放線菌，接種后先在35 37°C下培養(yǎng)30 40小時(shí)，然后調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基溫度為27 29°C后補(bǔ)入康百汀溶液，27 29°C下培養(yǎng)72 156小時(shí)，培養(yǎng)過(guò)程控制康百汀在發(fā)酵液中的濃度為0. 3 0. 7g/L，發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后得到所需普伐 他汀。
全文摘要
本發(fā)明公開一種用馬杜拉放線菌轉(zhuǎn)化康百汀生產(chǎn)普伐他汀的發(fā)酵工藝，該發(fā)酵工藝是在現(xiàn)有發(fā)酵工藝基礎(chǔ)上，向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入微量元素溶液，充分利用微量元素的作用，達(dá)到提高微生物底物轉(zhuǎn)化能力和提高普伐他汀發(fā)酵水平的目的，并且通過(guò)控制馬杜拉放線菌的培養(yǎng)溫度以及馬杜拉放線菌轉(zhuǎn)化康百汀的轉(zhuǎn)化溫度有效提高微生物轉(zhuǎn)化菌——馬杜拉放線菌對(duì)康百汀的轉(zhuǎn)化能力、提高普伐他汀發(fā)酵水平，且其發(fā)酵水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于現(xiàn)有技術(shù)的水平。本發(fā)明的發(fā)酵工藝操作簡(jiǎn)便、成本低廉，適合于大規(guī)模的生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12P7/42GK102757986SQ201110106499
公開日2012年10月31日 申請(qǐng)日期2011年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月27日
發(fā)明者徐會(huì)根, 羅定軍, 陳繼敏, 韓明活, 黃智勇 申請(qǐng)人:廣東藍(lán)寶制藥有限公司