專利名稱：雙胞柱孢菌及利用其制備人參皂苷Rh₂的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株人參致病真菌，雙胞柱孢Cylindrocarpon didymium(CGMCC No. 4681)，以及利用該菌轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd制備稀有人參皂苷Mi2的方法。
背景技術(shù)：
近年來，腫瘤疾病嚴(yán)重危害著人類健康。目前，主要依靠手術(shù)、放療、化療和生物方法等進(jìn)行治療，目的在于通過化學(xué)藥物殺傷腫瘤細(xì)胞，促進(jìn)其死亡或阻止增殖，但是絕大多數(shù)藥物的細(xì)胞毒性缺乏特異性，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，往往無選擇地殺傷正常細(xì)胞，特別是增生活躍的造血干細(xì)胞，正常細(xì)胞的損傷常導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥，影響治療效果從而造成患者依從性。因此，近年來從天然藥物中尋找高效低毒的腫瘤藥物成為研究熱點(diǎn)。眾多研究表明，人參皂苷Mi2具有較高的抗腫瘤活性并且對(duì)正常細(xì)胞無毒副作用， 與其他化療藥物聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同作用。人參皂苷Mi2主要通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖周期、誘導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡來發(fā)揮抗腫瘤作用(淺談人參皂苷Mi2對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖周期和凋亡的影響，《中獸醫(yī)學(xué)雜志》，2006. (2) :40-42 ；人參皂苷他2抗腫瘤作用的研究，《微生物學(xué)雜志》， 2003,23(2) :61-63).同時(shí)，人參皂苷Mi2可以通過調(diào)節(jié)和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，發(fā)揮其抗腫瘤作用。然而，由于人參皂苷Rli2在人參屬植物中含量極低，而且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，化學(xué)合成至今尚未成功，目前只能通過從人參等藥用植物的根、莖、葉中提取，但其效率低，成本高，從而限制了 Mi2的深入研究和應(yīng)用。因此，獲得大量、高純度的人參皂苷Mi2具有特別重要的科學(xué)研究意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。對(duì)于人參皂苷Iih2的制備，研究者主要采用化學(xué)法和生物轉(zhuǎn)化法。宋長春等以人參屬植物的總皂苷或原人參二醇類皂苷為原料，轉(zhuǎn)化、分離和提取20 (S)-原人參皂苷-Iih2 (CN 1225366，1999. 8. 11.)。該制備方法的優(yōu)點(diǎn)是利用了大量的二醇類皂苷，但是需在高溫和高壓下反應(yīng)。韓國人參煙草研究所公開了 2種從人參成分中制備20 (R&S)-人參皂苷-Iih2的方法。其特征在于首先得到原人參二醇皂苷組分，再經(jīng)酸水解處理得到20(R&Q-人參皂苷-收3，然后將人參皂苷收3處理得到人參皂苷他2。以上這些方法主要缺陷在于產(chǎn)物的起始材料需要原人參二醇類系列單體皂苷，使得反應(yīng)步驟較繁瑣，原料損失較大，操作繁瑣， 從而導(dǎo)致成本增加，而且難以提高產(chǎn)率。另外，許多學(xué)者還對(duì)化學(xué)法半合成人參皂苷Mi2進(jìn)行了研究。前蘇聯(lián)學(xué)者用人參三醇和乙酰溴代葡萄糖縮合合成了該化合物(人參化學(xué)成分研究的新進(jìn)展，《中國藥物化學(xué)雜志》，1992，2(1) :64-70.)，但選擇性較差，混合物難以分離。之后，又有前蘇聯(lián)學(xué)者采用從樺樹葉分得的白樺烯三醇為原料，通過五步區(qū)域選擇性和立體選擇性反應(yīng)合成了人參皂苷Mi2，但反應(yīng)步驟繁瑣，經(jīng)濟(jì)上也不實(shí)用?？傊?，若采用傳統(tǒng)的化學(xué)轉(zhuǎn)化法，其選擇性低，副產(chǎn)物多，而且容易對(duì)環(huán)境造成污染，相比較而言，生物轉(zhuǎn)化法具有高度專一性和無污染性等優(yōu)勢(shì)，因此，具有很好的應(yīng)用前景。金鳳燮等(酶法制備人參皂甙Mi2的研究，《大連輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)》，2001,20( :99-104)對(duì)酶法制備稀有人參皂苷進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，實(shí)現(xiàn)了稀有人參皂苷的工業(yè)化生產(chǎn)。其中利用人參皂苷葡萄糖苷酶將人參中含量較高的皂苷RbpRc和Rd等PPD型皂苷進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到具有高抗癌活性的Mi2，其收率為0.5% (人參)，比紅參中提高500倍。趙立亞等(酶法生產(chǎn)稀有人參皂苷及其產(chǎn)物成分的分析，《大連輕工學(xué)院學(xué)報(bào)》2002，21 C3) :112-115)通過微生物來源的酶改變?nèi)藚⒍荚碥仗腔?，生產(chǎn)稀有人參皂苷，并分離提純了酶反應(yīng)產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)酶反應(yīng)產(chǎn)物中主要成分為Rh2,副產(chǎn)物為Rg3、Rg5, Rh1, Rh3和PPD型皂苷。呂迪等(酶解產(chǎn)物人參稀有皂苷Μι3的制備與分離，《大連輕工學(xué)院學(xué)報(bào)》，2005，24 C3) =182-185)利用植物來源的人參皂苷酶轉(zhuǎn)化 PPD型皂苷，得到以Iih2和Rh3為主的混合物。經(jīng)常壓硅膠柱分離，得到純Rh2和Rh3粗品。 薛麗莉等(酶轉(zhuǎn)化人參皂苷中間產(chǎn)品收3皂苷的分析，《大連輕工學(xué)院學(xué)報(bào)》，2007，26(1) 1-4)以制備收3為目地，采用酶法轉(zhuǎn)化人參二醇類皂苷RbpRtvR^Rd的混合物，從43g反應(yīng)產(chǎn)物中分離得到Mi2組分19. 2g、Rh3組分2. 42g、Rg3組分4g，并用沉淀方法提純Rg3。生物轉(zhuǎn)化制備人參皂苷Iih2是創(chuàng)新藥物研制開發(fā)并實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的有效“綠色”途徑。隨著分子生物學(xué)、遺傳學(xué)等尖端科學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展，對(duì)于具有某種活性的菌株的分子生物學(xué)的研究必將為尋找具有特定轉(zhuǎn)化功能的菌株及其特性研究提供有利條件，為具有某種轉(zhuǎn)化功能的活性酶的人工合成提供有效的途徑。本發(fā)明人即試圖尋找新的方案，來實(shí)現(xiàn)人參皂苷Mi2的工業(yè)化生產(chǎn)，滿足臨床需要，同時(shí)可解決人參、三七等常用中藥材的資源緊缺的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可用于生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)稀有人參皂苷Mi2的微生物，以及使用該菌轉(zhuǎn)化底物人參皂苷Rb1和Rd制備稀有人參皂苷Mi2的方法。本發(fā)明的人參致病菌是發(fā)明人從患病人參中分離得到的一株真菌，經(jīng)形態(tài)鑒定為雙胞柱抱 Cylindrocarpon didymium。上述本發(fā)明的雙胞柱孢菌已于2011年03月15日提交保藏，具體保藏信息如下保藏單位名稱中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(China General Microbiological Culture Center, CGMCC)；保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所；保藏日期2011年03月15日；保藏編號(hào)CGMCCNo. 4681。本發(fā)明所述的雙胞柱孢菌Cylindrocarpon didymium (CGMCC No. 4681)具有如下的特征PDA上25°C培養(yǎng)7天，菌落直徑達(dá)到25 30mm，伴隨有白色的氣生菌絲生成。菌落初為米黃色，隨培養(yǎng)時(shí)間增加，菌落顏色逐漸加深，最后為褐色，培養(yǎng)基背面深褐色。在初期菌落大量產(chǎn)生單胞小型分生孢子，無色，橢圓形，5 9X3 4. 5μπι ；分生孢子梗細(xì)長， 瓶梗形，16 25 X 2. 5 4 μ m。不久產(chǎn)生大型分生孢子，1 2個(gè)隔膜，少數(shù)3個(gè)隔膜，多呈圓柱形，直或略彎曲；無隔大型分生孢子8 20X2. 5 5μ m ；單隔大型分生孢子15 25 X 3 7 μ m ；雙隔大型分生孢子M 36 X 5 8 μ m。在菌落生長后期形成厚垣孢子，鏈生，球狀，壁光滑，直徑8. 5 12. 5 μ m，初無色，后呈深褐色。發(fā)明人的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該菌具有轉(zhuǎn)化底物人參皂苷Rb1和Rd制備稀有人參皂苷Mi2的活性。在轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1制備Ml2的反應(yīng)中，能夠?qū)⒌孜锶藚⒃碥誖b1完全轉(zhuǎn)化， 主要產(chǎn)物為人參皂苷Mi2，少量副產(chǎn)物產(chǎn)生為Rd和；在轉(zhuǎn)化人參皂苷Rd制備Iih2的反應(yīng)中，底物未完全轉(zhuǎn)化，少量副產(chǎn)物為Rg3?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，本發(fā)明進(jìn)一步提供一種利用所述的雙胞柱孢菌 (Cylindrocarpon didymium, CGMCC No. 4681)轉(zhuǎn)化底物人參皂苷Rb1和Rd生產(chǎn)人參皂苷 Rh2的方法。所述的制備人參皂苷Mi2的方法，其一是微生物原位轉(zhuǎn)化法，即將活化的雙胞柱孢菌(CGMCC No. 4681)點(diǎn)種至含有人參皂苷Rb1和/或Rd的PDA培養(yǎng)基上，于25°C靜置培養(yǎng) 5 7天。搜集培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物即可。該方法適用于少量生產(chǎn)人參皂苷他2。所述的制備人參皂苷Rh2的方法之二是微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化法，是將活化的雙胞柱孢菌(CGMCC No. 4681)接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于培養(yǎng)5 7天；收集酶液并將其與人參皂苷Rb1和/或Rd混合后，于40°C下反應(yīng)24h ；所述的產(chǎn)酶培養(yǎng)基是20g麥麩，SOmL 5°麥芽汁，混勻，經(jīng)121°C，1.0kPa高壓滅菌30min。上述微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化法中所述的酶液收集方法是收集發(fā)酵液，紗布過濾，濾液在 10000r/min下離心IOmin ；取離心上清液，加入3倍產(chǎn)酶培養(yǎng)基體積的95%乙醇，優(yōu)選O 4°C乙醇，4°C沉淀4h ；lOOOOr/min下離心lOmin，去掉上清液，沉淀溶于pH 5. O醋酸-醋酸鈉緩沖液并在該緩沖液中透析，離心收集上清液即可。采用本發(fā)明的技術(shù)方案生產(chǎn)人參皂苷他2，具有簡單方便、安全可靠、成本低，且副產(chǎn)物少的特點(diǎn)。發(fā)酵產(chǎn)物Rh2的純度在85%以上，轉(zhuǎn)化率可達(dá)到45%以上。


本發(fā)明附圖8幅，圖1是二醇類人參皂苷轉(zhuǎn)化為Iih2的轉(zhuǎn)化途徑示意圖；圖2是本發(fā)明的雙胞柱孢菌(CGMCC No. 4681)形態(tài)照片，其中A是分生孢子；B是產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)；C是厚垣孢子；圖3是本發(fā)明的雙胞柱孢菌(CGMCC No. 4681)轉(zhuǎn)化不同底物的TLC結(jié)果；圖4是4種標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜，按照保留時(shí)間，25. 70min是Rd檢測(cè)峰，29. 73min 是Rg3檢測(cè)峰，34. 63min是Rh1檢測(cè)峰，39. 37min是Rh2檢測(cè)峰；圖5是固體轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1制備Iih2試驗(yàn)的HPLC檢測(cè)譜圖；圖6是固體轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化人參皂苷Rd制備Iih2試驗(yàn)的HPLC檢測(cè)譜圖；圖7是微生物酶法轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1制備Iih2試驗(yàn)的HPLC檢測(cè)譜圖；圖8是微生物酶法轉(zhuǎn)化人參皂苷Rd制備Iih2試驗(yàn)的HPLC檢測(cè)譜圖。
具體實(shí)施例方式下面以具體實(shí)施例的方式對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明不以任何形式受限于實(shí)施例的內(nèi)容。無特殊說明，本發(fā)明所用的儀器和試劑包括各種人參單體皂苷對(duì)照品，購自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；麥芽汁(大連杰菲食品有限公司)；薄層層析板 Silica Gel-60F254，德國MERCK公司產(chǎn)品；高效液相色譜分析儀(島津LC-20AD)，色譜柱為C18kromasil 0DS2 250mmX 4. 6mm，5 μ m，中科院大連化學(xué)物理研究所提供；其他試劑均為分析純?cè)噭?如無特殊說明，本部分產(chǎn)物檢測(cè)所采用的TLC及HPLC條件為
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TLC檢測(cè)薄層層析板Silica Gel_60F254 ；展開劑V(氯仿)V(甲醇)V(水) =7:3: 0. 5 !^04水溶液，于110°C下烘干顯色。HPLC 檢測(cè)(1)樣品處理將萃取液在lOOOOr/min離心lmin，用直徑為0. 22 μ m的微孔濾膜
過濾ο(2) HPLC條件流速0. 6mL/min ；檢測(cè)波長203nm ；柱溫；流動(dòng)相A為乙腈，B 為高純水；梯度洗脫流動(dòng)相的比例0min，A為20%，B為80% ； 18min，A為40%，B為60% ； 38min，A 為 80%，B 為 20%;48min，A 為 100%，B 為 0%;58min，A 為 80%，B 為 20%;78min， A 為 40%，B 為 60% ；78 90min，A 為 20%，B 為 80%。在該HPLC條件下，底物Rb1和Rd的出峰時(shí)間分別為23. 139min和25. 703min ；主要轉(zhuǎn)化產(chǎn)物出峰時(shí)間為39. 414min ；Rh2標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間為39. 37& η，可以進(jìn)一步確定轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為實(shí)施例1 菌株的分離篩選1、分離人參致病菌用自來水將罹病的新鮮人參沖洗干凈，用濾紙吸干水分，然后，先用0. 升汞浸泡1 1.5min，經(jīng)無菌水沖洗4 5次，再用75%酒精浸泡1 1. 5min,再經(jīng)無菌水沖洗3 4次。處理后在無菌條件下，用滅過菌的手術(shù)剪將人參根系組織剪成小塊(4mmX4mm)，分別置于直徑9cm的PDA平板上。5 7d后觀察組織塊周圍有無菌落形成。待產(chǎn)生菌落后，挑取菌絲接種到PDA斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行純化和保藏備用。培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)馬鈴薯200g，葡萄糖18g，瓊脂 18g,lOOOmL。本實(shí)施例所采用的人參(Panax ginseng C. A. Mey)通過自行采集的方式獲得，由發(fā)明人于是2009年8月采自遼寧省桓仁縣。2、菌株篩選(1)初步篩選制備固體轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基小塊(cp5mmXH5mm)，分別將已活化好的真菌點(diǎn)種至塊狀培養(yǎng)基上，于25°C靜置培養(yǎng)5 7d，將菌塊浸泡在0. 5mL正丁醇中，取上清液進(jìn)行TLC分析。所述固體轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基是每IOOmL培養(yǎng)基中含馬鈴薯20g，葡萄糖1. Sg,瓊脂 1. 8g，人參單體皂苷Rb1或Rd 20g ；去離子水配制，121°C，1. OkPa高壓滅菌30min。(2)復(fù)篩將已初步篩選出來的活性菌種接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)5 Id0將發(fā)酵液攪拌1 池，用紗布過濾，濾液在lOOOOr/min離心lOmin，取上清液加入300ml 95%冰乙醇，4°C沉淀4h，10000r/min離心lOmin，倒掉上清，沉淀溶于IOml 0. 02mmol/L、 pH5. O醋酸-醋酸鈉緩沖液中，經(jīng)13000r/min離心lOmin，最后得到上清酶液。取0. ImL酶液與等體積單體人參皂苷混合，40°C下反應(yīng)Mh，加入0. 2ml正丁醇萃取lh，取上清液進(jìn)行 TLC檢測(cè)，同樣取0. ImL失活的酶液加入對(duì)應(yīng)單體皂苷作為空白對(duì)照。所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基是麥麩20g，80mL 5°麥芽汁，經(jīng)121°C，1. OkI3a高壓滅菌30min。3、菌株保存及活化培養(yǎng)篩選出的菌株接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，于4°C冰箱內(nèi)短期保存。需長期保存的菌株采用低溫冷凍干燥法保存，使用前活化PDA培養(yǎng)基馬鈴薯 200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，IOOOmL去離子水；溫度25°C。
經(jīng)過鑒定，分離篩選到的真菌(CGMCC No. 4681)是雙胞柱孢，拉丁名 Cylindrocarpon didymium Harting，其形態(tài)學(xué)特征如附圖2所示。實(shí)施例2 轉(zhuǎn)化對(duì)照性試驗(yàn) 采用實(shí)施例1步驟2 (2)的方法，試驗(yàn)篩選得到的雙胞柱孢菌(CGMCCNo. 4681)對(duì)人參皂苷底物及產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化選擇性，經(jīng)TLC檢測(cè)，結(jié)果如附圖3所示可以看出，對(duì)原二醇類皂苷RbpRtvR^Rd為底物的轉(zhuǎn)化反應(yīng)中，本發(fā)明篩得的雙胞柱孢菌(CGMCC No. 4681)對(duì)底物Rb1, Rb2, Re、Rd均發(fā)生反應(yīng)，其中對(duì)Rb1的轉(zhuǎn)化作用較強(qiáng)，根據(jù)Rf值可以初步判斷該主要產(chǎn)物為他2。實(shí)施例3 固體轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1制備Iih2①配制固體轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(PDA)每IOOmL培養(yǎng)基中含馬鈴薯20g，葡萄糖1. Sg,瓊脂LSgiASS-Rb1 ；去離子水配制，121 °C，l.OkPa高壓滅菌30min。②將活化的雙胞柱孢菌(CGMCC No. 4681)點(diǎn)種至上述含有人參皂苷Rb1的PDA培養(yǎng)基上，于25°C靜置培養(yǎng)5 7天。③產(chǎn)物提取分離以正丁醇浸泡培養(yǎng)物，充分提??；提取液在lOOOOr/min離心 Imin,用直徑為0. 22 μ m的微孔濾膜過濾后，HPLC分離目標(biāo)產(chǎn)物。HPLC條件流速0. 6mL/min ；檢測(cè)波長203nm ；柱溫35°C ；流動(dòng)相A為乙腈，B為
高純水；梯度洗脫流動(dòng)相的比例Omin，A 為 20%，B 為 80% ；18min，A 為 40%，B 為 60% ；38min，A 為 80%，B 為 20% ；48min，A 為 100%，B 為 0% ；58min，A 為 80%，B 為 20% ；78min，A 為 40%，B 為 60% ；78 90min，A 為 20%，B 為 80%。收集38 41min洗脫液，脫除溶劑即可得產(chǎn)物他2。經(jīng)檢測(cè)，產(chǎn)物Mi2的純度82%， 底物轉(zhuǎn)化率48%，HPLC檢測(cè)結(jié)果如附圖5所示(標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果見圖4)。實(shí)施例4 固體轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化人參皂苷Rd制備Iih2①配制固體轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(PDA)每IOOmL培養(yǎng)基中含馬鈴薯20g，葡萄糖1. Sg,瓊脂1.8g，人參皂苷Rd 20g ；去離子水配制，121°C，1.0kPa高壓滅菌30min。②將活化的雙胞柱孢菌(CGMCC No. 4681)點(diǎn)種至上述含有人參皂苷Rd的PDA培養(yǎng)基上，于25°C靜置培養(yǎng)5 7天。③按照實(shí)施例3步驟③的方法進(jìn)行產(chǎn)物提取分離。 經(jīng)檢測(cè)，產(chǎn)物Iih2的純度75 %，底物轉(zhuǎn)化率45 %，HPLC檢測(cè)結(jié)果如附圖6所示。實(shí)施例5 微生物酶法轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1制備Iih2①配制產(chǎn)酶培養(yǎng)基麥麩20g，80mL 5°麥芽汁，經(jīng)121°C，1. OkPa高壓滅菌30min。②將活化的雙胞柱孢菌(CGMCC No. 4681)接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基上，于培養(yǎng) 5 7天；③收集酶液收集發(fā)酵液攪拌1 池；紗布過濾，濾液在lOOOOr/min離心IOmin ；取離心上清液，加入3倍產(chǎn)酶培養(yǎng)基體積的95%冰乙醇(0 4°C )，4°C沉淀4h ；IOOOOr/ min離心lOmin，去掉上清液，沉淀溶于pH 5. 0醋酸-醋酸鈉緩沖液，并在該緩沖液中透析， 離心收集上清液即得酶液；④將所得酶液與等體積人參皂苷Rb1溶液混合，于40°C下反應(yīng)Mh，該人參皂苷Rb1 溶液溶劑為步驟③所述及的醋酸-醋酸鈉緩沖液，濃度10mg/ml ；⑤以正丁醇為溶劑萃取反應(yīng)液中的產(chǎn)物，按照實(shí)施例3步驟③的操作提取分離產(chǎn)物。經(jīng)檢測(cè)，產(chǎn)物Rh2的純度85 %，底物轉(zhuǎn)化率52 %，HPLC檢測(cè)結(jié)果如附圖7所示。實(shí)施例6 微生物酶法轉(zhuǎn)化人參皂苷Rd制備Iih2按照實(shí)施例5步驟① ③制備酶液，然后將將所得酶液與等體積的Rd溶液混合， 于40°C下反應(yīng)Mh，所述人參皂苷Rd的溶液溶劑為步驟③所述及的醋酸-醋酸鈉緩沖液， 濃度10mg/ml ；最后按照實(shí)施例5步驟⑤的方法提取分離產(chǎn)物。經(jīng)檢測(cè)，產(chǎn)物Mi2的純度 80 %，底物轉(zhuǎn)化率48 %，HPLC檢測(cè)結(jié)果如附圖8所示。
權(quán)利要求
1.一種雙胞柱孢菌(CGMCC No. 4681)，其特征在于該菌具有轉(zhuǎn)化底物人參皂苷Rb1和 Rd制備稀有人參皂苷Mi2的能力。
2.權(quán)利要求1所述的雙胞柱孢菌(CGMCCNo. 4681)在制備人參皂苷Iih2中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于是將活化的雙胞柱孢菌(CGMCCNo.4681)點(diǎn)種至含有人參皂苷Rb1和/或Rd的PDA培養(yǎng)基上，于25°C靜置培養(yǎng)5 7天。
4.權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于將活化的雙胞柱孢菌(CGMCCNo.4681)接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于培養(yǎng)5 7天；收集酶液并將其與人參皂苷Rb1和/或Rd混合后，于40°C下反應(yīng)Mh;其中所述的產(chǎn)酶培養(yǎng)基是麥麩20g，80mL 5°麥芽汁，經(jīng)121 °C，1. OkPa高壓滅菌 30mino
5.權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述的酶液收集方法是收集發(fā)酵液，攪拌1 2h ；紗布過濾，濾液在lOOOOr/min下離心IOmin ；取離心上清液，加入3倍產(chǎn)酶培養(yǎng)基體積的95 %乙醇，4°C沉淀4h ； 10000r/min下離心lOmin，去掉上清液，沉淀溶于pH 5. 0醋酸-醋酸鈉緩沖液并在該緩沖液中透析，離心收集上清液即可。
6.權(quán)利要求5所述的制備人參皂苷Mi2的方法，其特征在于所述的乙醇溫度0 4°C。
全文摘要
一種人參致病真菌，雙胞柱孢菌(CGMCC No.4681)，該菌具有轉(zhuǎn)化底物人參皂苷Rb1Rd制備人參皂苷Rh2的能力。利用該菌制備人參皂苷Rh2可以采用原位轉(zhuǎn)化，將其點(diǎn)種至含有人參皂苷Rb1和/或Rd的PDA培養(yǎng)基上，于25℃靜置培養(yǎng)5～7天?；蛘卟捎梦⑸锇l(fā)酵轉(zhuǎn)化法，將其接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)5～7天；收集酶液并將其與人參皂苷Rb1和/或Rd混合后，于40℃下反應(yīng)24h。采用本發(fā)明的技術(shù)方案生產(chǎn)人參皂苷Rh2，具有專一性強(qiáng)、簡單方便、安全可靠、成本低且副產(chǎn)物少的特點(diǎn)。發(fā)酵產(chǎn)物Rh2的純度在85％以上，轉(zhuǎn)化率可達(dá)到45％以上。
文檔編號(hào)C12N1/14GK102226152SQ201110120780
公開日2011年10月26日 申請(qǐng)日期2011年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月10日
發(fā)明者呂國忠, 孫曉東, 張薇 申請(qǐng)人:大連民族學(xué)院