專利名稱：一種蔗渣高效同步糖化共發(fā)酵產(chǎn)乙醇的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物化工、發(fā)酵工程與生物質(zhì)能源領域，具體地是涉及到一種蔗渣高效同步糖化共發(fā)酵產(chǎn)乙醇的方法。
背景技術：
木質(zhì)纖維素是地球上最豐富而廉價的可再生資源，年生成量高達2X10"t。木質(zhì)纖維素的生物轉(zhuǎn)化對解決能源問題、緩解環(huán)境污染具有重要的現(xiàn)實意義。我國每年可利用的木質(zhì)纖維素在7億噸左右，主要來源于農(nóng)林廢棄物、工業(yè)廢棄物和城市廢棄物。蔗渣是甘蔗制糖工業(yè)主要的纖維性殘渣副產(chǎn)品，干蔗渣產(chǎn)率一般為11. 5% 13%，我國年總產(chǎn)蔗量 7000多萬噸，蔗渣將達到700萬噸以上。蔗渣生產(chǎn)燃料乙醇被給予厚望，其綜合利用受到國內(nèi)外越來越廣泛的重視。隨著化石資源的日益枯竭，石油儲量的日益減少，世界能源問題面臨著嚴峻的考驗。據(jù)預測，2020年我國石油供需缺口將達到3. 6億噸，屆時石油對外依存度將達到60%。 加之化石資源的利用產(chǎn)生的環(huán)境污染與氣候變暖，綠色新能源尤其是生物質(zhì)能源的開發(fā)利用愈發(fā)受到重視。燃料乙醇是生物質(zhì)液體能源物質(zhì)的主要形式，也是化石燃料尤其是石油最可能的理想替代品，與傳統(tǒng)能源相比，它既是一種清潔能源，又是一種可再生能源。使用 ElO車用乙醇汽油(即變性燃料乙醇含量為10%的汽油)可使辛烷值提高3%，燃燒更加充分、徹底，減少一氧化碳排放25% _30%，減少二氧化碳排放約10%。目前，乙醇主要以糧食作物為生產(chǎn)原料，由于糧食緊缺問題日益突出，開發(fā)由木質(zhì)纖維素等非糧作物原料生產(chǎn)第二代燃料乙醇的技術受到各國的巨大重視。目前，木質(zhì)纖維資源轉(zhuǎn)化液體燃料主要通過熱轉(zhuǎn)化和生物轉(zhuǎn)化兩條途徑。其中， 乙醇的生物轉(zhuǎn)化及發(fā)酵生產(chǎn)具有產(chǎn)物得率高、品質(zhì)好等優(yōu)勢，是開發(fā)的主要方向。經(jīng)多年努力，以纖維素類資源酸法或酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)乙醇或其他化學品的技術研究已取得了重大進展，但仍面臨幾個主要困難(1)木質(zhì)纖維難以直接被生物降解，需要先進行預處理，顯著增加了投資和成本。(2)與酸水解相比，酶水解具有條件溫和、不生成有毒降解產(chǎn)物、糖得率高等優(yōu)點，但目前纖維素酶的比活力較低，酶用量大，成本較高。( 半纖維素水解產(chǎn)物主要是戊糖，不能被一般的釀酒酵母發(fā)酵成乙醇，使得率較低。世界各國研究利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇也都圍繞預處理工藝、水解工藝、發(fā)酵工藝幾個關鍵技術進行。美國(NREL、馬斯科馬、波伊特、杜邦丹尼斯克等)、加拿大(IogeruSimOpta等)、巴西(Dedini等)以及歐洲 (Abengoa Jnbicon等)在纖維素乙醇的研究及產(chǎn)業(yè)化方面取得了較大進展，我國(中糧集團、河南天冠集團、安徽豐原集團、山東澤生等)雖然取得了一定的成果，但存在的差距還較大。但纖維素乙醇至今未能完全進入工業(yè)化生產(chǎn)，主要原因有三一是纖維原料預處理的成本較高；二是纖維素酶解成本高；三是缺乏成熟、高效的戊糖發(fā)酵技術。木質(zhì)纖維素原料的水解工藝主要有酸法和酶法兩種。酸法消耗大量的酸，對設備腐蝕嚴重，且酸回收困難，造成環(huán)境污染。另外，酸水解過程產(chǎn)生的副產(chǎn)物對發(fā)酵存在強烈的抑制作用，因而酸法的應用受到一定限制。酶法具有條件溫和、不生成抑制性有毒降解產(chǎn)
3物、糖得率高等優(yōu)點，但成本相對較高。然而，隨著纖維素酶生產(chǎn)技術的不斷革新，酶法成為非常具有應用前景的水解方法，得到了廣泛的研究應用。分步水解發(fā)酵工藝(SHF)是纖維素水解和水解液的乙醇發(fā)酵分別在不同的容器內(nèi)進行，但由于纖維二糖和葡萄糖對水解過程的抑制大大增加了纖維素酶的成本，于是同步糖化發(fā)酵工藝(SSF)愈來愈受到重視。同步糖化發(fā)酵工藝即纖維素水解和水解液的乙醇發(fā)酵在同一個容器中進行，水解產(chǎn)生的葡萄糖馬上被酵母利用，消除了葡萄糖和纖維二糖濃度的增加對纖維素酶的抑制作用。與分步水解發(fā)酵工藝相比，同步糖化發(fā)酵工藝可以顯著提高乙醇產(chǎn)量，而且減少了反應所需的設備，同步糖化發(fā)酵工藝還具有簡化反應設備、降低設備投資、提高生產(chǎn)效率、減少染菌幾率等優(yōu)點。但這種工藝存在的主要問題是纖維素酶解和乙醇發(fā)酵的最適溫度不一致，因此只能折中選取二者中間某一溫度作為實際操作溫度，對酶水解效果和乙醇產(chǎn)率帶來了負面影響，但總的來說，具有比分步水解發(fā)酵更好的乙醇產(chǎn)率。同步糖化發(fā)酵仍需較高的纖維素酶用量和較長的反應時間，這是由于纖維素酶不可逆地吸附在底物的木素表面，使酶活性逐漸降低，造成水解速率及反應速率逐漸下降。同步糖化發(fā)酵轉(zhuǎn)化乙醇的反應速度主要取決于水解反應的速度，纖維素酶的“鈍化”是瓶頸， 減少纖維素酶的失活和提高纖維素酶的穩(wěn)定性成為近年來研究的熱點。本發(fā)明提供的同步糖化共發(fā)酵工藝，將預處理的原料(參見申請人的專利申請 2011100522690)在反應器中酶解的同時進行可發(fā)酵糖的發(fā)酵，減弱了酶水解產(chǎn)物對酶的反饋抑制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對目前以木質(zhì)纖維素為原料制備乙醇工藝路線中普遍存在的分離效果差、轉(zhuǎn)化率低與綜合利用率低、產(chǎn)業(yè)化潛力不足等瓶頸，提供一種蔗渣高效同步糖化共發(fā)酵產(chǎn)乙醇的方法。實現(xiàn)上述目的的技術方案如下一種蔗渣高效同步糖化共發(fā)酵產(chǎn)乙醇的方法，所述的方法包括以下步驟(1)預處理將干蔗渣于稀硫酸中浸泡，過濾后進行蒸汽爆破處理；汽爆蔗渣加入熱水洗滌可溶性水解物，過濾得到水洗液和濾渣；濾渣加入低級醇-堿水混合體系，于高壓反應釜中高溫攪拌抽提，過濾分離，水洗，得抽提殘渣和水洗液；(2)濃縮脫毒將步驟(1)的水洗液真空濃縮至原體積的1/6 1/10，加入含量為 Iwt % 5wt%的Ca(OH)2進行毒性抑制物脫除處理，過濾，調(diào)節(jié)濾液pH至中性，固液分離， 得脫毒濃縮水洗液；(3)酵母種子液制備將釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌種接入種子培養(yǎng)基，該種子培養(yǎng)基的主要成份為葡萄糖10 20g/L、酵母膏2. 0 5. 0g/L、NH4Cl 1. 0 2. Og/L、MgSO4 · 7H20 0. 2 0. 5g/L、KH2PO4O. 5 1. Og/L ；將戊糖發(fā)酵酵母菌種接入種子培養(yǎng)基，該種子培養(yǎng)基的主要成份為木糖10 20g/L、酵母膏2. 0 5. Og/L、NH4Cl 1. 0 2. Og/L,MgSO4 · 7Η20 0· 2 0. 5g/L,KH2PO4 0· 5 1. Og/L ；于 28°C 30°C培養(yǎng) 16 24 小時，分別控制釀酒酵母種子液、戊糖發(fā)酵酵母種子液0D_值為0. 8 1. 0 ；將以上兩種種子液混合配制即可得到酵母種子液；(4)同步糖化共發(fā)酵步驟(1)中的抽提殘渣置于發(fā)酵罐中，加入步驟O)的脫毒濃縮水洗液，再加入0. 2M醋酸/醋酸鈉緩沖液至pH = 4. 8 5. 0，補加水至抽提殘渣干重終濃度為 8wt%，同時加入主要具有以下組成的發(fā)酵培養(yǎng)基營養(yǎng)成分和無機鹽酵母膏 0. 2% 0. 5%、蛋白胨 0. 0. 3%, NH4Cl 0. 2% 0. 4%, KH2PO4 0. 0. 3%, MgSO4 · 7H20 0. 05% 0. 1%,CaCl2O. 05% 0. 1 %、非離子型表面活性劑 0. 01% 0. 1% ； 發(fā)酵體系滅菌；體系中加入混合纖維素酶制劑，并按發(fā)酵體系體積的8% 12%接入步驟 (3)中制備的酵母種子液，第一階段于30°C 32°C、限制性供氧條件下糖化發(fā)酵20 30小時，第二階段于36°C 38°C、厭氧條件下糖化發(fā)酵20 30小時；(5)蒸餾/精餾發(fā)酵液經(jīng)過濾、蒸餾可得粗乙醇，再經(jīng)精餾可得95%乙醇，最后經(jīng)脫水可得無水乙醇。優(yōu)選地，步驟C3)所述的戊糖發(fā)酵酵母菌種是樹干畢赤酵母(Pichia stipitis) 或嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)或休哈塔假絲酵母(Candida Shehatae)中的任意一種；所述的釀酒酵母與戊糖發(fā)酵酵母混合種子液的中釀酒酵母種子液與戊糖發(fā)酵酵母種子液混合的體積比為1 0. 5 2。步驟(4)所述的非離子型表面活性劑是Tween80或Tween60或Tween40或Tween20 或 PEG-2000 或 PEG-4000 或 PEG-6000 中的任意一種。進一步地，步驟(4)所述的纖維素酶制劑是酸性纖維素酶、纖維二糖酶(β-葡萄糖苷酶)和木聚糖酶的混合；所述的酸性纖維素酶、纖維二糖酶和木聚糖酶的添加量分別是酸性纖維素酶10 40FPU/g抽提殘渣，纖維二糖酶5 10CBIU/g抽提殘渣，木聚糖酶 10 20IU/g抽提殘渣。進一步地，步驟(4)所述的限制性供氧條件是通過控制攪拌和通氣速率，使得發(fā)酵體系溶氧濃度保持在 5%飽和水平(飽和度)。本方法工藝簡單、轉(zhuǎn)化率及生產(chǎn)效率高、設備投資少、雜菌污染小，提高了乙醇產(chǎn)率和生產(chǎn)能力。本發(fā)明提供的方法簡化了工藝，具有高效可靠、清潔無污染、低能耗、低水耗、低成本等優(yōu)點，具體如下(1)混合使用能代謝己糖、戊糖的酵母共發(fā)酵，提高了蔗渣中可發(fā)酵性糖的利用率和乙醇產(chǎn)率，實現(xiàn)了蔗渣等生物質(zhì)資源的綜合高效利用。(2)半纖維素和木質(zhì)素成分的分離使得蔗渣的酶解效率得到較大提高，減少了酶的消耗，降低了生產(chǎn)成本。(3)非離子表面活性劑的添加改善了纖維素酶分子在底物表面上的吸附與脫附作用過程，在較低的酶濃度及較短的時間內(nèi)提高了酶解效果。(4)考慮到不同酵母的特性，運用階段性溶氧控制手段，提高了酵母代謝活性和糖醇轉(zhuǎn)化率，提高了產(chǎn)酒率，減少了代謝副產(chǎn)物的生成。(5)酶解和發(fā)酵同時進行，酶解產(chǎn)生的纖維二糖和單糖及時被酵母利用消耗、轉(zhuǎn)化為乙醇，避免了糖的積累對纖維素酶的反饋抑制，提高了乙醇的發(fā)酵生產(chǎn)效率。(6)設備投資減少，建設費用低，生產(chǎn)成本，產(chǎn)業(yè)化潛力大，同時具有很好的經(jīng)濟社會效益。
具體實施例方式本發(fā)明所述方法對預處理后的蔗渣采用同時酶解糖化共發(fā)酵產(chǎn)乙醇，減輕水解的葡萄糖和纖維二糖對纖維素酶活性的抑制作用，提高酶解和發(fā)酵效率；在較低的混合酶添加濃度下，添加表面活性劑增進酶解，使得酶解率顯著增加；使用混合菌株發(fā)酵，充分轉(zhuǎn)化己糖和戊糖，提高了蔗渣的轉(zhuǎn)化、利用率。本發(fā)明提出的方法減小了纖維素水解產(chǎn)生的單糖組分對纖維素酶的抑制作用，提高了酶解糖化效率和發(fā)酵得率，蔗渣中半纖維素回收率為60%左右，纖維素回收率為86% 左右，干蔗渣乙醇總產(chǎn)率可達到20%左右。本發(fā)明所述的預處理方法可以參照專利申請2011100522690( —種蔗渣生物質(zhì)組分高效分離的組合預處理方法)，具體如下(1)稀硫酸預浸含水量為0% 15%蔗渣按固液比W/V為1 30 60加入濃度為0. 1. 0%稀硫酸，攪拌、浸泡20 60min，過濾分離；(2)汽爆處理將步驟(1)稀硫酸預浸后的蔗渣裝入蒸汽爆破罐中進行蒸汽爆破處理，蒸汽壓力為1. 5 2. 2MPa，壓力穩(wěn)定后維持時間為2 lOmin，瞬間泄壓放料實現(xiàn)爆破，分離；(3)熱水洗滌將步驟(2)汽爆處理后的蔗渣按固液比W/V為1 10 30加入 45°C 70°C熱水重復洗滌蔗渣中可溶性水解物，洗滌次數(shù)為1 3次，洗滌后過濾分離；(4)抽提將步驟(3)中熱水充分洗滌后的蔗渣按固液比W/V為1 20 50與低級醇-堿水體系混合，然后置于反應釜中于110°c 190°C高溫攪拌抽提10 90min，混合物冷卻后過濾分離，得抽提殘渣。所述的低級醇是甲醇、乙醇中的任意一種；或所述的低級醇是甲醇、乙醇的混合物，甲醇與乙醇的體積比是1 5 10。所述的堿水是氫氧化鈉、氫氧化鈣、NH3中的任意一種的水溶液，所述的堿水的PH 值范圍為9. O 14. O。所述的低級醇-堿水體系中低級醇與堿水的體積比為1 0. 25 4。下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。但本發(fā)明的保護范圍不能認為僅局限于下述具體實施方式
。在不脫離本發(fā)明基本構(gòu)思的前提下，所屬領域的技術人員據(jù)此做出的簡單推演或同等替換方案，均屬于本發(fā)明的保護范圍。實施例1本實施例所述的蔗渣高效同步糖化共發(fā)酵產(chǎn)乙醇的方法，主要包括以下步驟(1)預處理稱取干蔗渣lOOOg，于稀硫酸中浸泡，過濾后進行蒸汽爆破處理；汽爆蔗渣加入熱水洗滌可溶性水解物，過濾得到水洗液和濾渣；濾渣加入低級醇-堿水混合體系，于高壓反應釜中高溫攪拌抽提，過濾分離，水洗，得抽提殘渣和水洗液；抽提殘渣纖維素回收率(以葡萄糖計)為86% ；(2)濃縮脫毒將步驟(1)的水洗液約30L真空濃縮至約5L，加入1 % (W/W)的 Ca(OH)2進行毒性抑制物脫除處理，過濾，用2% (W/W)稀硫酸調(diào)節(jié)濾液pH至中性，固液分離，得脫毒濃縮水洗液，經(jīng)檢測木糖濃度36. lg/L ；半纖維素回收率(以木糖計)為62% ；(3)酵母種子液制備將釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌種斜面活化后接入種子培養(yǎng)基葡萄糖 20g/L、酵母膏 2. Og/L、NH4Cl 2. 0g/L、MgSO4 · 7H200. 2g/L、KH2PO4 1. Og/L ；將樹干畢赤酵母(Pichia stipitis)菌種斜面活化后接入種子培養(yǎng)基木糖20g/ L、酵母膏 2. 0g/L、NH4Cl 2. 0g/L、MgSO4 · 7H20 0. 2g/L、KH2PO4 1. Og/L ；于 28°C振蕩培養(yǎng) 24小時，兩種種子液的OD6tltl值控制在0. 8 ；將該兩種種子液按體積比V 釀酒酵母v樹干畢赤酵母= 1 0. 5混合可得釀酒酵母與戊糖發(fā)酵酵母混合種子液；(4)抽提殘渣530g (干重)置于發(fā)酵罐中，加入步驟O)的脫毒濃縮水洗液，再加入0. 2M醋酸/醋酸鈉緩沖液至pH = 4. 8，補加水至抽提殘渣干重終濃度為4%，同時按比例加入發(fā)酵培養(yǎng)基營養(yǎng)成分(終濃度，W/W)酵母膏0.5%、蛋白胨0. 1%、NH4C1 0.2%,KH2PO4 0.1%,MgSO4 ‘ 7H20 0. 1%, CaCl2 0. 05%, Tween800. 01%, ；115°C滅菌 20min ；再于發(fā)酵體系中加入酸性纖維素酶26. 5mL(添加比例10FPU/g抽提殘渣，酶液200FPU/mL)，β -葡萄糖苷酶2. 65mL (添加比例5CBIU/g抽提殘渣，酶液100CBIU/mL)，木聚糖酶53mL (添加比例 10IU/g抽提殘渣，酶液100IU/mL)；并按8%體積比接入步驟(3)中制備的酵母種子液；第一階段于30°C、1 %溶氧飽和水平的限制性供氧條件下糖化發(fā)酵30小時，第二階段于36°C、 厭氧條件下糖化發(fā)酵30小時。發(fā)酵結(jié)束經(jīng)檢測，發(fā)酵液乙醇濃度為1. 51% (W/W)，產(chǎn)乙醇201g，對干蔗渣的乙醇產(chǎn)率為20. 1% ο(5)發(fā)酵液經(jīng)過濾、蒸餾可得粗乙醇，再經(jīng)精餾得95%乙醇，最后經(jīng)脫水可得無水乙醇。實施例2本實施例所述的蔗渣高效同步糖化共發(fā)酵產(chǎn)乙醇的方法，主要包括以下步驟(1)預處理同實施例1;(2)濃縮脫毒將步驟(1)的水洗液約30L真空濃縮至約3L，加入5% (W/W)的 Ca(OH)2進行毒性抑制物脫除處理，過濾，用2% (W/W)稀硫酸調(diào)節(jié)濾液pH至中性，固液分離，得脫毒濃縮水洗液，經(jīng)測定木糖濃度60. lg/L ；半纖維素回收率(以木糖計)為62% ；(3)酵母種子液制備將釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌種斜面活化后接入種子培養(yǎng)基葡萄糖 10g/L、酵母膏 5. 0g/L、NH4Cl 1. 0g/L、MgSO4 · 7Η200· 5g/L、KH2PO4 0. 5g/L ；將嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)菌種斜面活化后接入種子培養(yǎng)基木糖 10g/L、酵母膏 5. 0g/L,NH4Cl 1. 0g/L、MgSO4 · 7Η200· 5g/L,KH2PO4 0. 5g/L ；于 32°C振蕩培養(yǎng)16小時，兩種種子液的0D_值控制在1. 0 ；將該兩種種子液按體積比V 釀酒酵母v嗜鞣管囊酵 ￠=1:2混合可得釀酒酵母與戊糖發(fā)酵酵母混合種子液。(4)抽提殘渣530g(干重)置于發(fā)酵罐中，加入步驟O)的脫毒濃縮水洗液，再加入0. 2M醋酸/醋酸鈉緩沖液至pH = 5. 0，補加水至抽提殘渣干重終濃度為8%，同時加入發(fā)酵培養(yǎng)基營養(yǎng)成分(終濃度，W/W):酵母膏0. 2%、蛋白胨0. 3%、NH4Cl 0.4%, KH2PO4 0. 3%,MgSO4 ‘ 7H20 0. 05%, CaCl2 0. l%,Tween20 0.1%, ；115°C滅菌 20min ；再于發(fā)酵體系中加入酸性纖維素酶106mL (添加比例40FPU/g抽提殘渣，酶液200FPU/mL)，β -葡萄糖苷酶5. 3mL (添加比例10CBIU/g抽提殘渣，酶液100CBIU/mL)，木聚糖酶106mL (添加比例 20IU/g抽提殘渣，酶液100IU/mL)；并按12%體積比接入步驟( 中制備的酵母種子液；第一階段于32°C、5%溶氧飽和水平的限制性供氧條件下糖化發(fā)酵20小時，第二階段于38°C、 厭氧條件下糖化發(fā)酵20小時。經(jīng)檢測，發(fā)酵液乙醇濃度為2. 92% (W/W)，產(chǎn)乙醇193g，對干蔗渣的乙醇產(chǎn)率為19.3%。(5)發(fā)酵液經(jīng)過濾、蒸餾可得粗乙醇，再經(jīng)精餾得95%乙醇，最后經(jīng)脫水可得無水乙醇。
實施例3本實施例所述的蔗渣高效同步糖化共發(fā)酵產(chǎn)乙醇的方法，主要包括以下步驟(1)預處理同實施例1;(2)濃縮脫毒將步驟(1)的水洗液約30L真空濃縮至約4L，加入2% (W/W)的 Ca(OH)2進行毒性抑制物脫除處理，過濾，用2% (W/W)稀硫酸調(diào)節(jié)濾液pH至中性，固液分離，得脫毒濃縮水洗液，經(jīng)測定木糖濃度36. lg/L ；半纖維素回收率(以木糖計)為62% ；(3)酵母種子液制備將釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌種斜面活化后接入種子培養(yǎng)基葡萄糖 15g/L、酵母膏 3. Og/L、NH4Cl 1. 5g/L、MgSO4 · 7H200. 3g/L、KH2PO4 0.7g/L;將休哈塔假絲酵母(Candida Shehatae)菌種斜面活化后接入種子培養(yǎng)基木糖 15g/L、酵母膏 3. Og/L、NH4Cl 1. 5g/L、MgSO4 · 7Η200· 3g/L、KH2PO4 0. 7g/L ；于 30°C培養(yǎng) 20 小時，兩種種子液的0D_值都控制在0. 9 ；將該兩種種子液按體積比V 釀酒酵母哈塔假絲酵母 =1:1混合得釀酒酵母與戊糖發(fā)酵酵母混合種子液；(4)抽提殘渣530g(干重)置于發(fā)酵罐中，加入步驟O)的脫毒濃縮水洗液，再加入0. 2M醋酸/醋酸鈉緩沖液至pH = 4. 9，補加水至抽提殘渣干重終濃度為6%，同時加入發(fā)酵培養(yǎng)基營養(yǎng)成分(終濃度，W/W):酵母膏0. 4%、蛋白胨0. 2%、NH4Cl 0.3%, KH2PO4
0.2%,MgSO4 ‘ 7H20 0. 07%, CaCl2 0. 08%、PEG2000 0. 05%, ；115°C滅菌 20min ；再于發(fā)酵體系中加入酸性纖維素酶53mL(添加比例20FPU/g抽提殘渣，酶液200FPU/mL)，β -葡萄糖苷酶5. 3mL (添加比例10CBIU/g抽提殘渣，酶液100CBIU/mL)，木聚糖酶53mL (添加比例 10IU/g抽提殘渣，酶液100IU/mL)；并按10%體積比接入步驟( 中制備的酵母種子液；第一階段于31°C、3%溶氧飽和水平的限制性供氧條件下糖化發(fā)酵M小時，第二階段于37°C、 厭氧條件下糖化發(fā)酵M小時。經(jīng)檢測，發(fā)酵液乙醇濃度為2. 02% (W/W)，產(chǎn)乙醇184g，對干蔗渣的乙醇產(chǎn)率為18.4%。(5)發(fā)酵液經(jīng)過濾、蒸餾可得粗乙醇，再經(jīng)精餾得95%乙醇，最后經(jīng)脫水可得無水乙醇。實施例4本實施例所述的蔗渣高效同步糖化共發(fā)酵產(chǎn)乙醇的方法，主要包括以下步驟(1)預處理同實施例1;(2)濃縮脫毒將步驟(1)的水洗液約30L真空濃縮至約5L，加入3% (W/W)的 Ca(OH)2進行毒性抑制物脫除處理，過濾，用2% (W/W)稀硫酸調(diào)節(jié)濾液pH至中性，固液分離，得脫毒濃縮水洗液，經(jīng)測定木糖濃度36. lg/L ；半纖維素回收率(以木糖計)為62% ；(3)酵母種子液制備將釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌種斜面活化后接入種子培養(yǎng)基葡萄糖 20g/L、酵母膏 2. 0g/L、NH4Cl 2. 0g/L、MgSO4 · 7H200. 2g/L、KH2PO4
1.Og/L ；將樹干畢赤酵母(Pichia stipitis)菌種斜面活化后接入種子培養(yǎng)基木糖20g/ L、酵母膏 2. 0g/L、NH4Cl 2. 0g/L,MgSO4 ·7Η20 0. 2g/L、KH2PO4 1. Og/L ；于培養(yǎng) 22 小時， 兩種種子液的OD6tltl值都控制在1. 0 ；將該兩種種子液按體積比V 釀酒酵母v樹干畢赤酵母=1 : 1 混合可得釀酒酵母與戊糖發(fā)酵酵母混合種子液；(4)抽提殘渣530g(干重)置于發(fā)酵罐中，加入步驟O)的脫毒濃縮水洗液，再加入0. 2M醋酸/醋酸鈉緩沖液至pH = 4. 8，補加水至抽提殘渣干重終濃度為7%，同時加入發(fā)酵培養(yǎng)基營養(yǎng)成分(終濃度，W/W):酵母膏0. 5%、蛋白胨0. 1%、NH4Cl 0.2%, KH2PO40. 1 MgSO4 ·7Η20 0. 1%,CaCl2 0. 05%、PEG6000 0· 03%，；115°C滅菌 20min ；再于發(fā)酵體系中加入酸性纖維素酶79. 5mL (添加比例30FPU/g抽提殘渣，酶液200FPU/mL)，β -葡萄糖苷酶4. 2mL (添加比例8CBIU/g抽提殘渣，酶液100CBIU/mL)，木聚糖酶79. 5mL (添加比例 15IU/g抽提殘渣，酶液100IU/mL)；并按9%體積比接入步驟(3)中制備的酵母種子液；第一階段于30°C、2%溶氧飽和水平的限制性供氧條件下糖化發(fā)酵觀小時，第二階段于36°C、 厭氧條件下糖化發(fā)酵26小時。經(jīng)檢測，發(fā)酵液乙醇濃度為2. 54% (W/W)，產(chǎn)乙醇195g，對干蔗渣的乙醇產(chǎn)率為19.51%。(5)發(fā)酵液經(jīng)過濾、蒸餾可得粗乙醇，再經(jīng)精餾得95%乙醇，最后經(jīng)脫水可得無水乙醇。以上僅為本發(fā)明的具體實施例，并不以此限定本發(fā)明的保護范圍；在不違反本發(fā)明構(gòu)思的基礎上所作的任何替換與改進，均屬本發(fā)明的保護范圍。
權利要求
1.一種蔗渣高效同步糖化共發(fā)酵產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于，主要包括以下步驟(1)預處理將干蔗渣于稀硫酸中浸泡，過濾后進行蒸汽爆破處理；汽爆蔗渣加入熱水洗滌可溶性水解物，過濾得到水洗液和濾渣；濾渣加入低級醇-堿水混合體系，于高壓反應釜中高溫攪拌抽提，過濾分離，水洗，得抽提殘渣和水洗液；(2)濃縮脫毒將步驟(1)的水洗液真空濃縮至原體積的1/6 1/10，加入含量為 Iwt % 5wt %的Ca (OH) 2進行毒性抑制物脫除處理，過濾，調(diào)節(jié)濾液pH至中性，固液分離， 得脫毒濃縮水洗液；(3)酵母種子液制備將釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌種接入種子培養(yǎng)基，該種子培養(yǎng)基的主要成份為葡萄糖10 20g/L、酵母膏2. 0 5. Og/L、NH4Cl 1. 0 2. Og/L、MgSO4 · 7H20 0. 2 0. 5g/L、KH2PO4O. 5 1. Og/L ；將戊糖發(fā)酵酵母菌種接入種子培養(yǎng)基，該種子培養(yǎng)基的主要成份為木糖10 20g/L、酵母膏2. 0 5. Og/L、NH4Cl 1. 0 2. 0g/L,MgSO4 · 7Η20 0· 2 0. 5g/L,KH2PO4 0· 5 1. 0g/L ；于 28°C 30°C培養(yǎng) 16 24 小時，分別控制釀酒酵母種子液、戊糖發(fā)酵酵母種子液的0D_值在0. 8 1. 0 ；將以上兩種種子液混合配制即可得到酵母種子混合液；(4)同步糖化共發(fā)酵步驟(1)中的抽提殘渣置于發(fā)酵罐中，加入步驟O)的脫毒濃縮水洗液，再加入0. 2M醋酸/醋酸鈉緩沖液至pH = 4. 8 5. 0,補加水至抽提殘渣干重終濃度為 8wt%，同時加入主要具有以下組成的發(fā)酵培養(yǎng)基營養(yǎng)成分和無機鹽酵母膏 0. 2% 0. 5%、蛋白胨 0. 0. 3%, NH4Cl 0. 2% 0. 4%, KH2PO4 0. 0. 3%, MgSO4 · 7Η200· 05% 0. 1%,CaCl2 0. 05% 0. 1 %、非離子型表面活性劑 0. 01% 0. 1% ； 發(fā)酵體系滅菌；體系中加入混合纖維素酶制劑，并按發(fā)酵體系體積的8% 12%接入步驟(3)中制備的酵母種子混合液，第一階段于30°C 32°C、限制性供氧條件下糖化發(fā)酵20 30小時，第二階段于36°C 38°C、厭氧條件下糖化發(fā)酵20 30小時；(5)蒸餾/精餾發(fā)酵液經(jīng)過濾、蒸餾、精餾得到乙醇。
2.根據(jù)權利要求1所述的蔗渣高效同步糖化共發(fā)酵產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于，步驟C3)所述的戊糖發(fā)酵酵母菌種為樹干畢赤酵母(Pichia stipitis)或嗜鞣管囊酵母 (Pachysolen tannophilus)或休哈塔假絲酵母(Candida Shehatae)中的任意一種。
3.根據(jù)權利要求2所述的蔗渣高效同步糖化共發(fā)酵產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于，所述酵母種子混合液中釀酒酵母種子液與戊糖發(fā)酵酵母種子液的體積比為1 0.5 2。
4.根據(jù)權利要求1所述的蔗渣高效同步糖化共發(fā)酵產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于，步驟(4)所述的非離子型表面活性劑是Tween80或Tween60或Tween40或Tween20或PEG-2000 或PEG-4000或PEG-6000中的任意一種。
5.根據(jù)權利要求1-4任一項所述的蔗渣高效同步糖化共發(fā)酵產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于，步驟(4)所述的纖維素酶制劑是酸性纖維素酶、纖維二糖酶和木聚糖酶的混合；所述的酸性纖維素酶、纖維二糖酶和木聚糖酶的添加量分別是酸性纖維素酶10 40FPU/g抽提殘渣，纖維二糖酶5 10CBIU/g抽提殘渣，木聚糖酶10 20IU/g抽提殘渣。
6.根據(jù)權利要求1-4任一項所述的蔗渣高效同步糖化共發(fā)酵產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于，步驟(4)所述的限制性供氧條件是通過控制攪拌和通氣速率，使得發(fā)酵體系溶氧濃度保持在 5%飽和水平。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蔗渣高效同步糖化共發(fā)酵產(chǎn)乙醇的方法，主要包括以下步驟預處理；濃縮脫毒；酵母種子液制備；同步糖化共發(fā)酵；蒸餾/精餾。本發(fā)明提供的方法減小了纖維素水解產(chǎn)生的單糖組分對纖維素酶的抑制作用，提高了酶解糖化效率和發(fā)酵得率，蔗渣中半纖維素回收率為60％左右，纖維素回收率為86％左右，干蔗渣乙醇總產(chǎn)率可達到20％左右。
文檔編號C12P19/14GK102251010SQ20111012891
公開日2011年11月23日 申請日期2011年5月18日 優(yōu)先權日2011年5月18日
發(fā)明者劉柏楠, 劉立國, 楊尉, 林香瑤 申請人:廣州優(yōu)銳生物科技有限公司