專利名稱：一種重組釀酒酵母發(fā)酵菊芋生產(chǎn)乙醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及重組釀酒酵母的構(gòu)建方法，具體為一種發(fā)酵菊芋生產(chǎn)乙醇的重組釀酒酵母的構(gòu)建方法；本發(fā)明還涉及一種發(fā)酵乙醇的方法，具體為用重組釀酒酵母發(fā)酵乙醇的方法。
背景技術(shù)：
資源、能源和環(huán)境是制約國(guó)民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)可持續(xù)發(fā)展的重大瓶頸問題，積極探索并創(chuàng)立新技術(shù)，建立資源和能源可持續(xù)利用的環(huán)境友好型社會(huì)是“十二五”期間科技創(chuàng)新的重要內(nèi)容之一。利用非耕地大規(guī)模種植高產(chǎn)能源植物，發(fā)展以生物燃料、生物基產(chǎn)品及生物材料為主體的新興產(chǎn)業(yè)，是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的主要出路。我國(guó)“十五”和“十一五”期間試點(diǎn)發(fā)展以燃料乙醇為代表的生物能源產(chǎn)業(yè)，先后在黑龍江、吉林、河南、安徽和廣西四省建設(shè)了總量為152萬(wàn)噸的燃料乙醇裝置，以玉米、小麥和木薯等淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)燃料乙醇，但我國(guó)人口多耕地少的基本國(guó)情，嚴(yán)重制約了這一產(chǎn)業(yè)的規(guī)模化發(fā)展。不與人爭(zhēng)糧，不與糧爭(zhēng)地，不破壞生態(tài)環(huán)境，是我國(guó)生物乙醇產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基本方針！菊芋(Helianthus tuberous L，俗稱洋姜、鬼子姜)是一種可利用邊際性土地生長(zhǎng)，生態(tài)適宜性強(qiáng)[隆小華等。半干旱地區(qū)海涂海水灌溉對(duì)不同品系菊芋產(chǎn)量構(gòu)成及離子分布的影響.土壤學(xué)報(bào)，2007，44:300-306]。鮮菊芋塊莖中含水70 80 %，碳水化合物 15 20%，以菊粉的形式存在。菊粉anulin)，又稱菊糖，是由D-果糖經(jīng)β-2，1糖苷鍵連接的聚合度不高的聚果糖，末端為一個(gè)葡萄糖殘基[Khodzhaeva MA, Kondratenko ES. The structure of the inulin from inula grandis. Chem Nat Compd，1982，3 :394_395]。與目前國(guó)內(nèi)外普遍關(guān)注的以農(nóng)作物秸稈為代表的木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)原料相比，菊芋易被酸或菊粉酶水解而生成果糖和葡萄糖的混合物，是生產(chǎn)乙醇的良好原料D^noroy P. The crop physiology of helianthus tuberosus L :a model orientated view. Biomass and Bioenergy，1996，11 :11-32]。以菊芋塊莖為原料生產(chǎn)乙醇的研究工作在國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道，利用能產(chǎn)生菊粉酶的微生物菌種(例如克魯維酵母、黑曲霉等)和乙醇發(fā)酵菌株運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞桿菌或釀酒酵母進(jìn)行混菌培養(yǎng)的共發(fā)酵[Nakamura T, Ogata Y, Hamada S，et al. Ethanol production from Jerusalem artichoke tubers by Aspergillus niger and Saccharomyces cerevisiae. J Ferment Bioeng，1996，81 :564-566]；或利用同時(shí)具有產(chǎn)菊粉酶和乙醇發(fā)酵能力的克魯維酵母進(jìn)行乙醇發(fā)酵等[袁文杰等一步法發(fā)酵菊芋生產(chǎn)乙醇。2008,24 :1931-1935 ；劉建平等鷹嘴豆孢克魯維酵母利用菊芋原料同步糖化與發(fā)酵生產(chǎn)乙醇.生物工程學(xué)報(bào)，2010，7 982-990.中國(guó)專利，CN101265485A]。其中最優(yōu)的當(dāng)屬克魯維酵母的一步法發(fā)酵工藝，菊芋的糖化和發(fā)酵均由克魯維酵母自身完成，原料不需預(yù)先糖化，節(jié)約了能耗和額外添加酶的費(fèi)用，但其缺點(diǎn)是克魯維酵母屬非常規(guī)酵母，其乙醇產(chǎn)生機(jī)制尚不明了，乙醇耐性較釀酒酵母差，不利于后續(xù)的代謝工程改造。并且發(fā)酵速率慢，時(shí)間長(zhǎng)，導(dǎo)致發(fā)酵罐設(shè)備生產(chǎn)強(qiáng)度很低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種由本發(fā)明獲得的重組釀酒酵母發(fā)酵菊芋干粉生產(chǎn)燃料乙醇的方法，解決目前現(xiàn)有菌株存在的發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)、乙醇耐性差的問題。本發(fā)明的技術(shù)方案具體如下一種重組釀酒酵母發(fā)酵菊芋生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于所述方法包括a提供菊芋原料鮮菊芋原料清洗、搗碎或切片、晾干或烘干后研磨成粉；b菊芋粗粉加水配成的發(fā)酵培養(yǎng)基(菊芋粗粉與水的質(zhì)量比為1 4)，未滅菌，直接將0D_為10的重組釀酒酵母按10%體積比接種發(fā)酵培養(yǎng)基中，30-33°C進(jìn)行厭氧發(fā)酵 24-60h，產(chǎn)生乙醇；優(yōu)選方案在步驟b中，30-33 °C進(jìn)行厭氧發(fā)酵24h后，添加干菊芋粉，攪拌均勻使添加后菊芋粉濃度達(dá)到280g/L，使得發(fā)酵液中總糖濃度達(dá)到180g/L，繼續(xù)厭氧發(fā)酵 24-36h ；所述重組釀酒酵母包含p-inu基因；所述包含p-inu基因的重組釀酒酵母的構(gòu)建包括①以馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus CGMCC2. 1549)基因組為模板，PCR擴(kuò)增得到p-inu基因，并連接到克隆載體；②BamH I和BssH II酶分別切割載體質(zhì)粒和含p_inu基因的克隆載體；③將p-inu基因插入載體質(zhì)粒；④用所構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC2. 1882)中，得到重組釀酒酵母；步驟①中擴(kuò)增引物序列如下p-inu forward primer GCCgRatccGAATTCTCAAACCGAA(BamH I)；p-inu reverse primer CGGrcrcrcAGATCAGATCAAACG(BssH II)；擴(kuò)增和保存質(zhì)粒用大腸桿菌Ε. coli DH5a ；所述克隆載體為pMD19-T。本發(fā)明是以菊芋粉為培養(yǎng)基，用重組釀酒酵母厭氧發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，具有乙醇發(fā)酵速率快、殘?zhí)堑汀⑻谴嫁D(zhuǎn)化率高等特點(diǎn)，采用本發(fā)明所述原料和發(fā)酵方法，在60h內(nèi)，乙醇發(fā)酵濃度即可達(dá)到9%以上，可以替代我國(guó)現(xiàn)有乙醇工業(yè)生產(chǎn)中所采用的玉米粉、小麥粉等糧食類原料，為非糧燃料乙醇生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。


本發(fā)明共有附圖四張圖1為用于轉(zhuǎn)化釀酒酵母、含有菊粉酶基因的表達(dá)載體pOH/inu結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為基因工程菌生長(zhǎng)及產(chǎn)菊粉酶隨時(shí)間變化圖；圖3為基因工程菌菊芋粉乙醇發(fā)酵隨時(shí)間變化圖；圖4為基因工程菌菊芋粉批式補(bǔ)料乙醇發(fā)酵隨時(shí)間變化圖；圖1中INU為菊粉酶編碼基因；HO-L為核酸內(nèi)切酶基因的上游序列；HO-R為核酸內(nèi)切酶基因的下游序列；Kam遺傳霉素編碼基因。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1菊粉酶整合表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)菊粉酶(GenBank:X57202)序列，設(shè)計(jì)引物 p_inu forward primer :GCCggatccGAATTCTCAAACCGAA(BamH I)禾口 p-inu reverse primer CGGgcgcgcAGATCAGATCAAACG(BssH II)，以 K. marxianus 馬克斯克魯維酵母(CGMCC2. 1549) 基因組為模板擴(kuò)增P-inu基因。PCR體系模板1 μ 1，F(xiàn)/R引物各1 μ 1，酶1 μ 1，dNTP 4 μ 1，緩沖液 5 μ 1，ddH20 37 μ 1 ;PCR 程序94°C 預(yù)變性 5min ;94°C lmin，63.6°C lmin, 72 °C 3min，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，與載體pMD19_T連接。陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒后測(cè)序，測(cè)序分析結(jié)果證明該菊粉酶基因與NCBI報(bào)道的菊粉酶基因一致。pMD19T/p-inu經(jīng)BamH I禾Π BssH II酶切后與經(jīng)BamH I禾Π BssH II酶切的 Η0-2 (H0-poly-KanMX4-H0, Warren P V, James D R, Janet M S and Stillman D J. Yeast vectors for integration at the HO locus. Nucleic Acids Research,2001, Vol,29, No. 12e59)進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Ε. coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，在LB選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)， 挑取單菌落，小量提取質(zhì)粒酶切鑒定并進(jìn)行DNA序列測(cè)定，得到整合載體HO/p-inu (圖1)。 菊粉酶基因的表達(dá)是在K. marxianus酵母的菊粉酶啟動(dòng)子、分泌信號(hào)肽的控制下組成型表達(dá)。實(shí)施例2 S. cerevisiae釀酒酵母(CGMCC2. 1882)的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證整合載體HO/p-inu經(jīng)Not I酶切后，進(jìn)行1 %瓊脂糖電泳，回收目的DNA片段，采用電擊法轉(zhuǎn)化 S. cerevisiae釀酒酵母(CGMCC2. 1882)感受態(tài)細(xì)胞，在含有300 μ g/mL G418的YPD (無(wú)水葡萄糖20，酵母浸粉10，蛋白胨20和1.5%瓊脂粉)平板上。采用電擊法轉(zhuǎn)化，可以參照 BIORAD MicroPulser 電轉(zhuǎn)儀使用說(shuō)明書。30°C培養(yǎng)2-3天，挑選轉(zhuǎn)化子，提取HI6/6的基因組DNA。采用PCR法進(jìn)行驗(yàn)證。HI6/6的驗(yàn)證所使用的引物序列為HI6/6 forward primer AGCTTAATTATCCTGGGCACGAGT 和 HI6/6 reverse primer :GCGAGCTCAGCTCGTTTTCGACACTGGA。 PCR程序94°C預(yù)變性 5min ；94°C lmin，60°C lmin，72°C 3min，30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 lOmin。
瓊脂糖電泳顯示獲得大小正確片段，證明獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。實(shí)施例3轉(zhuǎn)化子產(chǎn)酶情況考察取S. cerevisiae 6525 和轉(zhuǎn)化子HI6/6 各 100 μ L，接至 50mL 的 YPD 培養(yǎng)基中，30°C 培養(yǎng)24h后，按10%接種到種子培養(yǎng)基，100/250mL搖瓶，30°C培養(yǎng)每24h取樣。發(fā)酵液經(jīng)適當(dāng)稀釋后，測(cè)定菌體密度(OD6J ；發(fā)酵液5000rp離心IOmin后，上清液用于測(cè)定菊粉酶活性。轉(zhuǎn)化子HI6/6生物量幾乎與出發(fā)菌株生長(zhǎng)一致，達(dá)到9g/L ；轉(zhuǎn)化子HI6/6的菊粉酶活力在144h達(dá)到最高酶活86U/mL，是出發(fā)菌株的4. 5倍。實(shí)施例4轉(zhuǎn)化子發(fā)酵性能考察取S. cerevisiae 6525和轉(zhuǎn)化子HI6/6各100 μ L,接至50mL的YPD液體培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)24h后，測(cè)0D_為10，按10%體積比接種到菊芋粗粉發(fā)酵培養(yǎng)基中(料水比為 1 4)，無(wú)其他成分添加，未滅菌，100/250mL搖瓶，30°C厭氧發(fā)酵，每1 取樣測(cè)定菊粉酶的活性、還原糖、總糖及乙醇含量。乙醇對(duì)理論值的收率=乙醇/(總糖-剩余總糖)/0. 511。轉(zhuǎn)化子HI6/6的最終乙醇濃度為55g/L，高于出發(fā)菌株49g/L，較出發(fā)菌株最終乙醇濃度提高了 12. M %，糖醇轉(zhuǎn)化率為0. 495，為理論值的96. 9%。實(shí)施例5基因工程菌在批式補(bǔ)料工藝的乙醇發(fā)酵取S. cerevisiae 6525和轉(zhuǎn)化子HI6/6各100 μ L,接至50mL的YPD液體培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)Mh，測(cè)0D_為10，按10%體積比接種到菊芋粗粉發(fā)酵培養(yǎng)基中(菊芋粗粉與水的質(zhì)量比為1 4)，1.5L發(fā)酵罐中裝料量為1L，無(wú)其他成分添加，未滅菌，30°C進(jìn)行厭氧發(fā)酵，24h后，直接添加干菊芋粉80g，攪拌均勻使添加后菊芋粉濃度達(dá)到280g/L，使得發(fā)酵液中總糖濃度達(dá)到180g/L，繼續(xù)厭氧發(fā)酵36h。轉(zhuǎn)化子HI6/6的最終乙醇濃度為72. 5g/L，高于出發(fā)菌株66. 5g/L，較出發(fā)菌株最終乙醇濃度提高了 9%。
權(quán)利要求
1.一種重組釀酒酵母發(fā)酵菊芋生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于所述方法包括a提供菊芋原料鮮菊芋原料清洗、搗碎或切片、晾干或烘干后研磨成粗粉；b菊芋粗粉加水配成的發(fā)酵培養(yǎng)基，將0D_數(shù)值為10的重組釀酒酵母按10%體積比接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30-33°C進(jìn)行厭氧發(fā)酵M_60h，產(chǎn)生乙醇；所述發(fā)酵培養(yǎng)基中菊芋粗粉與水的質(zhì)量比為1:4;所述重組釀酒酵母包含p-inu基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵菊芋生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于還包括在步驟b中， 30-33°C進(jìn)行厭氧發(fā)酵24h后，添加干菊芋粉，攪拌均勻使添加后菊芋粉濃度達(dá)到280g/L， 使得發(fā)酵液中總糖濃度達(dá)到180g/L，繼續(xù)厭氧發(fā)酵對(duì)-3他，產(chǎn)生乙醇。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種重組釀酒酵母發(fā)酵菊芋生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于所述包含P-inu基因的重組釀酒酵母的構(gòu)建包括①以馬克斯克魯維酵母基因組為模板，PCR擴(kuò)增得到p-inu基因，并連接到克隆載體；②BamHI和BssH II酶分別切割載體質(zhì)粒和含p_inu基因的克隆載體；③將p-inu基因插入載體質(zhì)粒；④用所構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入釀酒酵母中，得到重組釀酒酵母。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種重組釀酒酵母發(fā)酵菊芋生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于步驟①中擴(kuò)增引物序列如下p-inu forward primer GCCggatccGAATTCTCAAACCGAA(BamH I)；p-inu reverse primer CGGrcrcrcAGATCAGATCAAACG(BssH II)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組釀酒酵母的構(gòu)建方法，其特征在于擴(kuò)增和保存質(zhì)粒用大腸桿菌 E. coli DH5 α。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組釀酒酵母的構(gòu)建方法，其特征在于所述克隆載體為 PMD19-T。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種重組釀酒酵母發(fā)酵菊芋生產(chǎn)乙醇的方法，該方法是以菊芋粉為培養(yǎng)基，用重組釀酒酵母厭氧發(fā)酵生產(chǎn)乙醇；在60h內(nèi)，乙醇發(fā)酵濃度即可達(dá)到9％以上。采用本發(fā)明所述原料和發(fā)酵方法，可以替代我國(guó)現(xiàn)有乙醇工業(yè)生產(chǎn)中所采用的玉米粉、小麥粉等糧食類原料，為非糧燃料乙醇生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/81GK102229966SQ20111015025
公開日2011年11月2日 申請(qǐng)日期2011年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月3日
發(fā)明者任劍剛, 李楠楠, 白鳳武, 袁文杰, 辛程勛 申請(qǐng)人:大連理工大學(xué)