專利名稱：一種用于乙型肝炎病毒基因耐藥突變檢測(cè)的試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，涉及乙型肝炎病毒基因的突變耐藥檢測(cè)，特別涉及一種用于乙型肝炎病毒基因耐藥突變檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
全世界約有三分之一的人口感染過(guò)乙肝病毒(HBV)。近些年，隨著乙型肝炎疫苗計(jì)劃的實(shí)施，世界范圍內(nèi)的乙肝表面抗原這一血清學(xué)慢性感染標(biāo)志物檢出率已經(jīng)明顯降低。 但是，目前仍約有3. 5億人為慢性HBV感染者，這些患者有患慢性肝病、肝硬化和肝癌的風(fēng)險(xiǎn)?？共《局委熓强刂坪皖A(yù)防慢性乙肝病毒感染進(jìn)展的唯一選擇。目前，我國(guó)有多種藥物獲批用于治療慢性乙型肝炎。從廣義上講，這些藥物可分為兩類細(xì)胞因子和核苷酸類似物。干擾素是一種自然發(fā)生的細(xì)胞因子，具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)的作用，也是第一種批準(zhǔn)用于治療慢性乙型肝炎的藥物。干擾素對(duì)大約三分之一的患者有效，且需通過(guò)皮下注射進(jìn)行，由于有很多的不良反應(yīng)，需在治療期間進(jìn)行觀察。核苷類似物針對(duì)乙肝病毒逆轉(zhuǎn)錄酶和乙肝病毒復(fù)制，是有效的抑制劑。他們的優(yōu)勢(shì)在于口服藥和相對(duì)較少的不良反應(yīng)。然而，他們必須長(zhǎng)期服用才具療效，耐藥性的發(fā)生是限制其長(zhǎng)期應(yīng)用的一個(gè)主要方面。關(guān)于耐藥性產(chǎn)生的機(jī)制和及時(shí)有效診斷的研究，對(duì)于合理的藥物設(shè)計(jì)和耐藥病人的管理顯得尤為重要。譬如，拉米夫定作為治療乙肝的一線藥物，具有非常好的抗病毒治療效果。但隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，在抗病毒治療藥物的選擇性壓力下，對(duì)藥物敏感的野生株被抑制，而耐藥株因?qū)λ幬锊幻舾卸蔀閮?yōu)勢(shì)病毒株。例如服用拉米夫定治療期間，在選擇性壓力下出現(xiàn)DNA聚合酶的酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸(YMDD)基因序列變異，使其編碼的 204位蛋氨酸(M)突變?yōu)槔i氨酸(V)或異亮氨酸(I)，即常說(shuō)的YVDD和YIDD變異。這兩種變異均導(dǎo)致拉米夫定與HBV DNA聚合酶的親合力下降或消失，HBV對(duì)其敏感性降低上千倍。 若不及時(shí)診斷并進(jìn)行合理治療，將導(dǎo)致治療的失敗。然而目前只有YMDD耐藥突變的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于臨床進(jìn)行定性檢測(cè)，此方法對(duì)耐藥檢測(cè)由于設(shè)計(jì)復(fù)雜且通量較小，并且依賴昂貴的一起，目前只能在良好的實(shí)驗(yàn)室條件下完成，沒有快速、準(zhǔn)確、大通量的對(duì)乙型肝炎病毒基因突變耐藥檢測(cè)的合適方法，對(duì)乙型肝炎的早期治療造成了一定程度上的延誤。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問(wèn)題在于提供一種用于乙型肝炎病毒基因耐藥突變檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，以基因芯片為基礎(chǔ)進(jìn)行通量檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了高特異性且快速的對(duì)乙型肝炎病毒的突變檢測(cè)。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)一種用于乙型肝炎病毒基因耐藥突變檢測(cè)的試劑盒，包括用于PCR擴(kuò)增乙型肝炎病毒基因耐藥突變檢測(cè)的P區(qū)引物對(duì)、表面固定有耐藥檢測(cè)探針和對(duì)照探針的固相檢測(cè)陣列、包含DNA聚合酶和反應(yīng)底物的固相載體上核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系和顯色試劑；所述的P區(qū)引物對(duì)的5、端增加生物素標(biāo)記；所述的耐藥檢測(cè)探針包括針對(duì)一個(gè)或多個(gè)乙型肝炎病毒耐藥突變的耐藥檢測(cè)探針，其長(zhǎng)度為15 25nt，其中針對(duì)檢測(cè)突變位點(diǎn)設(shè)置在耐藥檢測(cè)探針5、端5nt之后，并在耐藥檢測(cè)探針5、端進(jìn)行減少空間位阻的序列延長(zhǎng)修飾和/或輔助固定修飾；所述的顯色試劑包括含親和素-堿性磷酸酶的親和反應(yīng)液和含NBT/BCIP的顯色反應(yīng)液。所述的P區(qū)引物對(duì)所擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度不超過(guò)IOOObp ；在檢測(cè)探針上還加入PNA、 LNA或硫基提高檢測(cè)特異性的修飾。所述的耐藥檢測(cè)探針包括以下一種或幾種檢測(cè)探針針對(duì)拉米夫定耐藥突變檢測(cè)位點(diǎn)rtL180M的乙型肝炎病毒的耐藥檢測(cè)探針的序列如SEQ ID NO 1所示；針對(duì)拉米夫定耐藥突變檢測(cè)位點(diǎn)rtM204V/I的乙型肝炎病毒的耐藥檢測(cè)探針的序列如SEQ ID NO 2所示；針對(duì)阿德福韋酯耐藥突變檢測(cè)位點(diǎn)rtA181V/T的乙型肝炎病毒的耐藥檢測(cè)探針的序列如SEQ ID NO 3所示；針對(duì)阿德福韋酯耐藥突變檢測(cè)位點(diǎn)rtN236T的乙型肝炎病毒的耐藥檢測(cè)探針的序列如SEQ ID NO 4所示；針對(duì)恩替卡韋耐藥突變檢測(cè)位點(diǎn)rtI169T的乙型肝炎病毒的耐藥檢測(cè)探針序列如 SEQ ID NO 5 所示；針對(duì)恩替卡韋耐藥突變檢測(cè)位點(diǎn)rtS202I的乙型肝炎病毒的耐藥檢測(cè)探針序列如 SEQ ID NO 6 所示；針對(duì)恩替卡韋耐藥突變檢測(cè)位點(diǎn)rtM250V/I的乙型肝炎病毒的耐藥檢測(cè)探針序列如SEQ ID NO 7所示。所述的對(duì)照探針包括陰性對(duì)照探針和陽(yáng)性對(duì)照探針，其所設(shè)計(jì)的序列均與待檢測(cè)的序列無(wú)互補(bǔ)性，陽(yáng)性對(duì)照探針的5、端還被生物素標(biāo)記。所述的進(jìn)行減少空間位阻的序列延長(zhǎng)修飾是在耐藥檢測(cè)探針5、端進(jìn)行polyT、 polyC、polyT+polyC 或 spacer 6 15C 序列的延長(zhǎng)修飾；所述的固相檢測(cè)陣列的載體為硝酸纖維素膜、尼龍膜或載玻片，耐藥檢測(cè)探針5、 端的輔助固定修飾為在耐藥檢測(cè)探針5、最末端添加氨基、巰基、羥基或醛基。所述的親和反應(yīng)液組成為ImL ddH20和2 μ 1親和素-堿性磷酸酶液；顯色反應(yīng)液組成為ImL顯色緩沖液、6. 5 μ INBT和3. 5 μ 1 BCIP0一種基于上述試劑盒的乙型肝炎病毒耐藥突變檢測(cè)方法，包括以下步驟1)以包含待測(cè)乙型肝炎病毒基因組的DNA為模板，以引物對(duì)為擴(kuò)增引物，進(jìn)行多個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性處理后，置于固相載體上核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系中，然后再加入固相檢測(cè)陣列，進(jìn)行固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)；其反應(yīng)程序?yàn)锳 在不低于探針Tm值5°C 的溫度下退火至少IOs ；B :72°C延伸至少IOs ；A-B循環(huán)數(shù)至少大于1 ；最后72°C延伸至少3min ；3)固相核酸擴(kuò)增完成后，取出固相檢測(cè)陣列放入洗脫液中離心洗脫，去除非特異核酸的結(jié)合，用親和反應(yīng)液覆蓋固相檢測(cè)陣列并進(jìn)行孵育，再次洗脫后用ddH20沖洗，最后覆蓋包含NBT和BCIP的顯色反應(yīng)液進(jìn)行顯色，直至看到顯色斑點(diǎn)后用ddH20終止反應(yīng)；6)顯色斑點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的檢測(cè)結(jié)果即為所檢測(cè)的乙型肝炎病毒基因野生型檢測(cè)位點(diǎn)并未發(fā)生突變，根據(jù)顯色斑點(diǎn)與突變檢測(cè)探針?biāo)槍?duì)的基因突變位點(diǎn)，判定乙型肝炎病毒突變情況。所述的固相檢測(cè)陣列在使用前還在體積濃度為2% 5%的BSA中37°C封閉至少 15min。所述的變性處理為熱變性處理95°C以上至少放置5min，再在0°C至少放置 3min ；或者，所述的變性處理為堿變性處理將質(zhì)量濃度10%的NaOH溶液與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物按照1 10 20的體積比混合，放置至少;3min。所述的固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)完成后，取出固相檢測(cè)陣列首先放入洗脫液A中，轉(zhuǎn)速至少30rpm離心洗脫至少Imin ；然后將固相檢測(cè)陣列覆蓋親和反應(yīng)液后37°C孵育至少 IOmin后，再依次放入洗脫液A、洗脫液B中，轉(zhuǎn)速至少30rpm離心洗脫至少Imin ；取出固相檢測(cè)陣列用ddH20沖洗，最后覆蓋顯色反應(yīng)液進(jìn)行顯色，至看到顯色斑點(diǎn)后終止反應(yīng)；所述的洗脫液A 的組成為 100mmol/L pH = 7. 5 的 Tris-Cl、300mmol/L NaCl 和 4mmol/L Mg2Cl ；洗脫液 B 的組成為 100mmol/L pH = 9. 5 的 Tris-Cl、300mmol/L NaCl 和 4mmol/L Mg2Cl0與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果1、本發(fā)明提供的用于乙型肝炎病毒耐藥突變檢測(cè)，是基于固相載體上核酸擴(kuò)增的基因突變檢測(cè)，將檢測(cè)探針固定在固相檢測(cè)陣列上，與PCR擴(kuò)增的待測(cè)基因片段進(jìn)行雜交， 當(dāng)擴(kuò)增的片段被檢測(cè)探針識(shí)別后，能夠進(jìn)行序列的延長(zhǎng)(固相核酸擴(kuò)增)，使得被生物素標(biāo)記的擴(kuò)增片段固定在膜陣列上而不被洗脫，而不能被探針識(shí)別的序列，就不能進(jìn)行序列的延長(zhǎng)，不能通過(guò)檢測(cè)探針被固定，進(jìn)而被洗脫掉；這樣通過(guò)設(shè)計(jì)多個(gè)檢測(cè)探針呈矩陣式的分布，通過(guò)一次就可以檢測(cè)出待檢測(cè)基因位點(diǎn)的突變性質(zhì)。本發(fā)明通過(guò)以基因芯片為基礎(chǔ)、PCR反應(yīng)技術(shù)為原理的高通量、高特異性、快速、并且易于推廣的檢測(cè)方法，通過(guò)在以硝酸纖維素膜為代表的固相介質(zhì)上進(jìn)行特異性探針引發(fā)的核酸擴(kuò)增反應(yīng)，結(jié)合反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)，將攜帶生物素標(biāo)記的靶序列與膜陣列上探針結(jié)合后，通過(guò)生物素-親和素-堿性磷酸酶-BCIP/NBT反應(yīng)，可以觀察到明顯藍(lán)紫色斑點(diǎn)，從而進(jìn)行肉眼判讀。由于乙肝病毒的耐藥突變種類較多，將其一一將對(duì)應(yīng)的突變結(jié)合探針設(shè)計(jì)并進(jìn)行染色判定比較困難，而且操作繁瑣，很容易出錯(cuò)；因此，以野生型作為顯色對(duì)照，如果待測(cè)樣本在所檢測(cè)的位點(diǎn)未發(fā)生突變，則相應(yīng)的進(jìn)行顯色；那么，對(duì)其以多個(gè)野生型作為顯色對(duì)照進(jìn)行檢測(cè)，就可以檢測(cè)到其是否發(fā)生了耐藥突變。本發(fā)明提供了 7種耐藥檢測(cè)探針，在進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，陣列當(dāng)中只有一種探針針顯色， 進(jìn)行結(jié)果指示，膜陣列中其他探針并無(wú)顯色；這表明這幾種耐藥突變檢測(cè)探針能夠特異性的識(shí)別出待測(cè)乙肝基因組的突變類型，而且其結(jié)果準(zhǔn)確可靠，彼此之間無(wú)雜交染色。
2、本發(fā)明提供的乙型肝炎病毒耐藥突變的檢測(cè)，檢測(cè)準(zhǔn)確性高包括通過(guò)特異性的探針設(shè)計(jì)、利用已經(jīng)成熟PCR技術(shù)的退火溫度以阻止非特異的結(jié)合、以及利用Taq酶
外切酶活性阻止錯(cuò)配之后的延伸，完全可以達(dá)到對(duì)核酸序列單堿基差異的良好分辨力，保障了檢測(cè)的準(zhǔn)確性；并且對(duì)實(shí)驗(yàn)室及儀器設(shè)備的要求不高在普通實(shí)驗(yàn)室PCR儀上即可完成整體實(shí)驗(yàn)，無(wú)需特殊和昂貴設(shè)備；操作簡(jiǎn)單；主要操作以PCR技術(shù)為核心，常規(guī)操作，成本低廉，易于推廣。3、本發(fā)明提供的乙型肝炎病毒耐藥突變的檢測(cè)，針對(duì)乙型肝炎病毒基因P區(qū)進(jìn)行，因?yàn)楦鶕?jù)以往報(bào)道，該區(qū)的突變主要引起乙型肝炎病毒耐藥性的產(chǎn)生。該方法檢測(cè)結(jié)果可靠、精確；而且解決了現(xiàn)有方法的檢測(cè)速度慢、分辨率不高、配套儀器昂貴、檢測(cè)過(guò)程復(fù)雜等技術(shù)問(wèn)題，可以顯著的改善現(xiàn)有很少考慮乙型肝炎患者治療前對(duì)耐藥基因的檢測(cè)，進(jìn)而忽略了基因耐藥而導(dǎo)致延誤治療的現(xiàn)況。4、本發(fā)明提供的乙型肝炎病毒耐藥突變的檢測(cè)，所提供的耐藥突變檢測(cè)探針能夠靈活組合，以適應(yīng)不同的檢測(cè)人群和檢測(cè)目的，有利于臨床檢驗(yàn)的靈活應(yīng)用。


圖1為擴(kuò)增片段與固定在固相載體上的耐藥檢測(cè)探針結(jié)合、延伸、顯色的程序示意圖；其中①為硝酸纖維素膜，②為5、端延長(zhǎng)修飾的ClO鏈，③為耐藥檢測(cè)探針，④為擴(kuò)增片段靶序列互補(bǔ)區(qū)，⑤為Taq酶，⑥為生物素標(biāo)記，⑦為親和素-堿性磷酸酶，⑧為BCIP/NBT 顯色；圖2為乙型肝炎病毒耐藥突變的檢測(cè)特異性鑒定芯片陣列分布示意圖；圖3為乙型肝炎病毒耐藥突變探針的特異性鑒定顯色結(jié)果圖；圖3a 圖3g分別為檢出的 rtL180M，rtM204V/I，rtA181V/T，rtN236T、rtI169、rtS202I、rtM250V/I 的顯色結(jié)^ ο
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體的乙型肝炎病毒耐藥突變的檢測(cè)中檢測(cè)片段的擴(kuò)增和檢測(cè)探針的設(shè)計(jì)，檢測(cè)探針與固相載體的固定，檢測(cè)探針與擴(kuò)增片段在固相載體上雜交、擴(kuò)增，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。參見圖1，基于固相載體上核酸擴(kuò)增的基因突變檢測(cè)方法，所提供的一種用于乙型肝炎病毒耐藥突變的檢測(cè)試劑盒，包括用于PCR擴(kuò)增乙型肝炎病毒基因P區(qū)的引物對(duì)、表面固定有耐藥檢測(cè)探針和對(duì)照探針的固相檢測(cè)陣列、包含DNA聚合酶和反應(yīng)底物的固相載體上核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系和顯色試劑。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的乙型肝炎耐藥突變序列將P區(qū)基因區(qū)作為檢測(cè)耐藥突變區(qū)段，其擴(kuò)增采用通常的PCR體外擴(kuò)增，要求循環(huán)數(shù)25 40，擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度建議不超過(guò)lOOObp， 而擴(kuò)增引物對(duì)上親和素的標(biāo)記既可以在正向引物也可以在反向引物上，具體由待測(cè)的突變位點(diǎn)在擴(kuò)增片段的位置關(guān)系來(lái)決定；檢測(cè)探針的長(zhǎng)度設(shè)計(jì)為15 25nt，檢測(cè)探針上針對(duì)檢測(cè)突變多態(tài)性的位點(diǎn)設(shè)置在5、端5nt之后。所述的耐藥突變檢測(cè)探針包括針對(duì)一個(gè)或多個(gè)乙型肝炎病毒耐藥突變檢測(cè)探針，其長(zhǎng)度為15 25nt，在以下序列當(dāng)中有下劃線標(biāo)注的位點(diǎn)為檢測(cè)的野生型的特異性序列位點(diǎn)；針對(duì)拉米夫定耐藥突變檢測(cè)位點(diǎn)rtL180M的乙型肝炎病毒的耐藥檢測(cè)探針的序列如SEQ ID NO 1所示；針對(duì)拉米夫定耐藥突變檢測(cè)位點(diǎn)rtM204V/I的乙型肝炎病毒的耐藥檢測(cè)探針的序列如SEQ ID NO 2所示；針對(duì)阿德福韋酯耐藥突變檢測(cè)位點(diǎn)rtA181V/T的乙型肝炎病毒的耐藥檢測(cè)探針的序列如SEQ ID NO 3所示；針對(duì)阿德福韋酯耐藥突變檢測(cè)位點(diǎn)rtN236T的乙型肝炎病毒的耐藥檢測(cè)探針的序列如SEQ ID NO 4所示；針對(duì)恩替卡韋耐藥突變檢測(cè)位點(diǎn)rtI169T的乙型肝炎病毒的耐藥檢測(cè)探針序列如 SEQ ID NO 5 所示；針對(duì)恩替卡韋耐藥突變檢測(cè)位點(diǎn)rtS202I的乙型肝炎病毒的耐藥檢測(cè)探針序列如 SEQ ID NO 6 所示；針對(duì)恩替卡韋耐藥突變檢測(cè)位點(diǎn)rtM250V/I的乙型肝炎病毒的耐藥檢測(cè)探針序列如SEQ ID NO 7所示。并且在其5、端添加pOlyT(10)+pOlyC(10)的修飾。在所提供的耐藥突變檢測(cè)探針中，每個(gè)突變點(diǎn)檢測(cè)探針可以單獨(dú)使用，也可以將幾種探針混合后固定在同一個(gè)分布位點(diǎn)上。對(duì)照探針包括陰性對(duì)照探針和陽(yáng)性對(duì)照探針，陰性對(duì)照探針和陽(yáng)性對(duì)照探針的序列設(shè)計(jì)可以相同或不相同，原則是其序列不能與擴(kuò)增片段有交叉互補(bǔ)性。陽(yáng)性對(duì)照探針的
端被生物素標(biāo)記，能夠被顯色，用以監(jiān)測(cè)顯色系統(tǒng)是否正常；陰性對(duì)照探針用以監(jiān)測(cè)雜交和固相核酸擴(kuò)增的特異性。具體的對(duì)照探針的序列可以設(shè)計(jì)為P曰t生胃,吧·歹[J Biotin-acagcactaa ggcaagctat tctg ；陰性對(duì)照序列 acagcactaa ggcaagctat tctg。耐藥檢測(cè)探針5、端的修飾包括減少空間位阻的序列延長(zhǎng)修飾和/或輔助固定修飾；其中減少空間位阻的序列延長(zhǎng)修飾是出于減少核酸擴(kuò)增錯(cuò)配和擴(kuò)增后的序列與固相載體的附著、顯色的考慮，包括polyT、polyC、polyT+polyC或spacer 6 15C等多種序列的延長(zhǎng)修飾。端的輔助固定修飾一般與固相載體結(jié)合考慮，固相載體可以為硝酸纖維素膜、 尼龍膜或者載玻片，通過(guò)在檢測(cè)探針的5、端添加氨基、巰基、羥基或醛基的輔助固定修飾與其固定，為了檢測(cè)探針更好的固定和將來(lái)的顯色效果，固相載體可以進(jìn)行多種表面修飾。比如，以硝酸纖維素膜為固相載體，通過(guò)在SSC溶液中浸泡再烘干之后，可以使得顯色斑點(diǎn)不擴(kuò)散；通過(guò)檢測(cè)探針5、端的羥基，經(jīng)紫外光照后與硝酸纖維素膜固定。固相核酸擴(kuò)增即檢測(cè)探針與目的基因片段在固相載體上雜交、擴(kuò)增，是探針特異性識(shí)別的核心，其中，擴(kuò)增體系采用常規(guī)的PCR反應(yīng)液，其獨(dú)特之處就在于以包含檢測(cè)位點(diǎn)的耐藥檢測(cè)探針作為引物，能夠與目的基因互補(bǔ)雜交并進(jìn)行核酸擴(kuò)增，且通過(guò)檢測(cè)探針被固定在固相載體上不被洗脫；同時(shí)，為了保證雜交的特異性，退火溫度一般設(shè)置在不低于探針Tm值的5°C范圍內(nèi)。洗脫過(guò)程是為了將未與固相載體結(jié)合的擴(kuò)增片段洗脫掉，洗脫液可以為一般常用的緩沖液，結(jié)合離心洗脫效果比較好。顯色通過(guò)親和素-堿性磷酸酶液+NBT/BCIP的顯示方式，其優(yōu)勢(shì)在于底色不明顯， 反應(yīng)精確，結(jié)果容易判定，效果比較好；而且實(shí)現(xiàn)方便，親和素-堿性磷酸酶液和NBT/BCIP 顯色液均可采用現(xiàn)有的試劑盒。下面結(jié)合乙肝病毒的基因耐藥檢測(cè)過(guò)程，對(duì)試劑盒及其檢測(cè)方法進(jìn)行具體的說(shuō)明1)檢測(cè)用擴(kuò)增產(chǎn)物的制備設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物對(duì)，并對(duì)反向擴(kuò)增引物的5、端增加生物素(Biotin)標(biāo)記，所設(shè)計(jì)的引物對(duì)P具體為正向弓丨物tgttcctgcg gtaaagta18;反向弓丨物:Biotin-tgtattccca tcccatca 18 ；人工合成7個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)的野生型序列用于耐藥檢測(cè)的靶序列，全長(zhǎng)332bp，以這7 種野生型序列的DNA為模板，以引物對(duì)P為引物進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增，能夠獲得7種檢測(cè)位點(diǎn)分別突變的長(zhǎng)度為332bp的擴(kuò)增片段。2)檢測(cè)探針的設(shè)計(jì)與合成設(shè)計(jì)并人工合成了乙肝病毒HBV的7個(gè)耐藥檢測(cè)位點(diǎn)的檢測(cè)探針，探針Tm值設(shè)計(jì)為45士 1°C，探針長(zhǎng)度為13 15nt,同時(shí)在探針序列5、端進(jìn)行加上polyT (Tltl) ,polyC (C10) 的序列延長(zhǎng)修飾，進(jìn)行減少空間位阻的延長(zhǎng)修飾是為了利于靶序列與固定在基膜上的探針進(jìn)行結(jié)合，具體的檢測(cè)探針序列為SEQ ID NO 1 SEQ ID NO 7所示；探針上檢測(cè)多態(tài)性的位點(diǎn)設(shè)置均在探針5、端5nt之后。3)檢測(cè)探針在檢測(cè)陣列上的固定將硝酸纖維素膜在2 X SSC溶液(檸檬酸三鈉15mM，氯化鈉150mM，pH7. 0)中浸泡 30min后取出，在37°C孵箱內(nèi)烘干2小時(shí)，再將耐藥檢測(cè)探針和對(duì)照探針用點(diǎn)膜儀噴涂至膜上(1滴500nl，間隔1mm，呈矩陣分布)，裁減至4mmX 6mm大小，將點(diǎn)完探針的硝酸纖維素膜放入80°C烘箱烘干30分鐘，2Mnm波長(zhǎng)紫外光照6分鐘，通過(guò)紫外光照將探針與硝酸纖維素膜固定連接，得到固定有檢測(cè)探針和對(duì)照探針的固相檢測(cè)陣列。在干燥條件下，固相檢測(cè)陣列可長(zhǎng)期儲(chǔ)備待用，使用前將該膜浸入2% BSA液37°C封閉15min。 檢測(cè)陣列設(shè)計(jì)如圖2分布圖加其中①為陽(yáng)性對(duì)照探針②為陰性對(duì)照探針，③ ⑥為rtL180M，rtM204V/I, rtA181V/T, rtN236T0圖2b其中①為陽(yáng)性對(duì)照探針②為陰性對(duì)照探針，③ ⑤為rt1169、rtS2021、 rtM250V/L·4)固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)首先對(duì)第一步獲得的基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序號(hào)標(biāo)記，然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熱變性處理95°C水浴5min，然后冰上放置^iin ；再將變性后的擴(kuò)增產(chǎn)物10 μ 1、PCR反應(yīng)液(欣百諾公司，TagMixMaster) 20 μ UddH2O 10 μ 1放入干凈的PCR反應(yīng)管中混勻，將制備好的檢測(cè)陣列放入，固相檢測(cè)陣列的膜背面靠管壁，進(jìn)行固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)；設(shè)計(jì)反應(yīng)程序:A :45°C退火30s ；B :72°C延伸30s ；A-B循環(huán)數(shù)為10 ；最后72°C延伸3min。其中檢測(cè)對(duì)象是擴(kuò)增的7種位點(diǎn)未突變的P區(qū)基因序列。5)洗脫與顯色固相PCR反應(yīng)完成后，取出檢測(cè)陣列進(jìn)行洗脫，將未與檢測(cè)陣列固定的片段洗脫掉，全部洗脫過(guò)程均在37°C條件下完成，具體為將檢測(cè)陣列取出，放入洗脫液A(100mmol/LpH = 7. 5 的 Tris-Cl、300mmol/L NaCl 和4mmol/L Mg2Cl)中離心洗脫(轉(zhuǎn)速為30rpm，洗脫lmin)，取出檢測(cè)陣列后，用堿性磷酸酯酶標(biāo)記的親和反應(yīng)液(ImL ddH20和2 μ 1親和素-堿性磷酸酶液，購(gòu)自碧云天公司，堿性磷酸酯酶標(biāo)記為Sti^ptavidin)覆蓋后，37°C條件下孵育IOmin ；孵育完成后將檢測(cè)陣列放入干凈的洗脫液A進(jìn)行洗脫(轉(zhuǎn)速30rpm，洗脫lmin)，取出后再放入洗脫液B(100mmOl/L pH =9. 5 的 Tris-Cl、300mmol/L NaCl 禾口 4mmol/L Mg2Cl)中，再離心洗脫(轉(zhuǎn)速 30rpm，洗脫 lmin)；取出檢測(cè)陣列，用清水對(duì)膜塊表面沖洗，并利用吸水紙去除膜塊上的液體，將膜塊覆蓋顯色反應(yīng)液(ImL顯色緩沖液、6. 5μ INBT和3. 5μ 1 BCIP，購(gòu)自碧云天公司，BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒)，30秒后肉眼可看到斑點(diǎn)后，即用清水中止反應(yīng)。6)突變檢測(cè)分析乙型肝炎病毒耐藥突變檢測(cè)顯色結(jié)果圖如圖3所示，其中①為陽(yáng)性對(duì)照，②為陰性對(duì)照，可以看到被生物素標(biāo)記的陽(yáng)性對(duì)照均正常顯色，說(shuō)明顯色系統(tǒng)工作正常；陰性對(duì)照不顯色，說(shuō)明固相擴(kuò)增的特異性好，沒有非特異性雜交和核酸擴(kuò)增。圖3a 圖3d中均只有 ③、④、⑤、⑥當(dāng)中的一個(gè)位點(diǎn)、圖!Be 圖3g中均只有③、④、⑤當(dāng)中的一個(gè)位點(diǎn)，所固定的檢測(cè)探針中分別與相應(yīng)的HBV基因未突變靶序列特異結(jié)合并顯色，陣列當(dāng)中只有一種探針針對(duì)待測(cè)的某種未發(fā)生耐藥突變乙肝病毒顯色，進(jìn)行結(jié)果指示，膜陣列中其他探針并無(wú)顯色；這表明這七種耐藥突變檢測(cè)探針能夠特異性的識(shí)別出待測(cè)乙肝基因組的未突變類型， 相應(yīng)的一旦突變即不產(chǎn)生斑點(diǎn)，而且其結(jié)果準(zhǔn)確可靠，彼此之間無(wú)雜交染色。結(jié)合以上陣列的檢測(cè)結(jié)果，本發(fā)明所提供的HBV耐藥突變檢測(cè)探針被固定形成陣列分布的檢測(cè)陣列后，每種檢測(cè)探針均能針對(duì)待測(cè)的某種耐藥突變乙肝病毒顯色，進(jìn)行結(jié)果指示，其顯色明顯、結(jié)果準(zhǔn)確可靠。準(zhǔn)確性和重復(fù)性考證對(duì)四種HBV 耐藥突變類型 rtL180M，rtM204V/I, rtA181V/T, rtN236T 各 25 例中國(guó)乙型肝炎病毒耐藥患者的血清中HBV擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，再同上述方法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，該方法檢測(cè)準(zhǔn)確率為99%。其中2例誤檢因在設(shè)計(jì)探針的位點(diǎn)旁邊堿基產(chǎn)生突變引起。
權(quán)利要求
1.一種用于乙型肝炎病毒耐藥突變檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括用于PCR擴(kuò)增乙型肝炎病毒基因耐藥突變檢測(cè)的P區(qū)引物對(duì)、表面固定有耐藥檢測(cè)探針和對(duì)照探針的固相檢測(cè)陣列、包含DNA聚合酶和反應(yīng)底物的固相載體上核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系和顯色試劑；所述的P區(qū)引物對(duì)的5、端增加生物素標(biāo)記；所述的耐藥檢測(cè)探針包括針對(duì)一個(gè)或多個(gè)乙型肝炎病毒耐藥突變的耐藥檢測(cè)探針，其長(zhǎng)度為15 25nt，其中針對(duì)檢測(cè)突變位點(diǎn)設(shè)置在耐藥檢測(cè)探針5、端5nt之后，并在耐藥檢測(cè)探針5、端進(jìn)行減少空間位阻的序列延長(zhǎng)修飾和/或輔助固定修飾；所述的顯色試劑包括含親和素-堿性磷酸酶的親和反應(yīng)液和含NBT/BCIP的顯色反應(yīng)液。
2.如權(quán)利要求1所述的用于乙型肝炎病毒耐藥突變檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的P 區(qū)引物對(duì)所擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度不超過(guò)IOOObp ；在檢測(cè)探針上還加入PNA、LNA或硫基提高檢測(cè)特異性的修飾。
3.如權(quán)利要求1所述的用于乙型肝炎病毒耐藥突變檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的耐藥檢測(cè)探針包括以下一種或幾種檢測(cè)探針針對(duì)拉米夫定耐藥突變檢測(cè)位點(diǎn)rtL180M的乙型肝炎病毒的耐藥檢測(cè)探針的序列如 SEQ ID NO 1 所示；針對(duì)拉米夫定耐藥突變檢測(cè)位點(diǎn)rtM204V/I的乙型肝炎病毒的耐藥檢測(cè)探針的序列如 SEQ ID NO 2 所示；針對(duì)阿德福韋酯耐藥突變檢測(cè)位點(diǎn)rtA181V/T的乙型肝炎病毒的耐藥檢測(cè)探針的序列如SEQ ID NO 3所示；針對(duì)阿德福韋酯耐藥突變檢測(cè)位點(diǎn)rtN236T的乙型肝炎病毒的耐藥檢測(cè)探針的序列如 SEQ ID NO 4 所示；針對(duì)恩替卡韋耐藥突變檢測(cè)位點(diǎn)rtI169T的乙型肝炎病毒的耐藥檢測(cè)探針序列如SEQ ID NO 5 所示；針對(duì)恩替卡韋耐藥突變檢測(cè)位點(diǎn)rtS202I的乙型肝炎病毒的耐藥檢測(cè)探針序列如SEQ ID NO 6 所示；針對(duì)恩替卡韋耐藥突變檢測(cè)位點(diǎn)rtM250V/I的乙型肝炎病毒的耐藥檢測(cè)探針序列如 SEQ ID NO 7 所示。
4.如權(quán)利要求1所述的用于乙型肝炎病毒耐藥突變檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的對(duì)照探針包括陰性對(duì)照探針和陽(yáng)性對(duì)照探針，其所設(shè)計(jì)的序列均與待檢測(cè)的序列無(wú)互補(bǔ)性，陽(yáng)性對(duì)照探針的5、端還被生物素標(biāo)記。
5.如權(quán)利要求1所述的用于乙型肝炎病毒耐藥突變檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的進(jìn)行減少空間位阻的序列延長(zhǎng)修飾是在耐藥檢測(cè)探針5、端進(jìn)行p0lyT、p0lyC、 polyT+polyC或spacer 6 15C序列的延長(zhǎng)修飾；所述的固相檢測(cè)陣列的載體為硝酸纖維素膜、尼龍膜或載玻片，耐藥檢測(cè)探針5、端的輔助固定修飾為在耐藥檢測(cè)探針5、最末端添加氨基、巰基、羥基或醛基。
6.如權(quán)利要求1所述的用于乙型肝炎病毒耐藥突變檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的親和反應(yīng)液組成為ImL ddH20和2 μ 1親和素-堿性磷酸酶液；顯色反應(yīng)液組成為ImL顯色緩沖液、6. 5 μ INBT 禾口 3. 5 μ 1 BCIP0
7.一種基于權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試劑盒的乙型肝炎病毒耐藥突變檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟1)以包含待測(cè)乙型肝炎病毒基因組的DNA為模板，以引物對(duì)為擴(kuò)增引物，進(jìn)行多個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性處理后，置于固相載體上核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系中，然后再加入固相檢測(cè)陣列，進(jìn)行固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)；其反應(yīng)程序?yàn)锳:在不低于探針Tm值5°C的溫度下退火至少IOs ；B :72°C延伸至少IOs ；A-B循環(huán)數(shù)至少大于1 ；最后72°C延伸至少^iin ；3)固相核酸擴(kuò)增完成后，取出固相檢測(cè)陣列放入洗脫液中離心洗脫，去除非特異核酸的結(jié)合，用親和反應(yīng)液覆蓋固相檢測(cè)陣列并進(jìn)行孵育，再次洗脫后用ddH20沖洗，最后覆蓋包含NBT和BCIP的顯色反應(yīng)液進(jìn)行顯色，直至看到顯色斑點(diǎn)后用ddH20終止反應(yīng)；4)顯色斑點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的檢測(cè)結(jié)果即為所檢測(cè)的乙型肝炎病毒基因野生型檢測(cè)位點(diǎn)并未發(fā)生突變，根據(jù)顯色斑點(diǎn)與突變檢測(cè)探針?biāo)槍?duì)的基因突變位點(diǎn)，判定乙型肝炎病毒突變情況。
8.如權(quán)利要求7所述的乙型肝炎病毒耐藥突變檢測(cè)方法，其特征在于，所述的固相檢測(cè)陣列在使用前還在體積濃度為20Z0 5%的BSA中37°C封閉至少15min。
9.如權(quán)利要求7所述的乙型肝炎病毒耐藥突變檢測(cè)方法，其特征在于，所述的變性處理為熱變性處理95°C以上至少放置5min，再在0°C至少放置^iin ；或者，所述的變性處理為堿變性處理將質(zhì)量濃度10%的NaOH溶液與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物按照1 10 20的體積比混合，放置至少;3min。
10.如權(quán)利要求7所述的乙型肝炎病毒耐藥突變檢測(cè)方法，其特征在于，所述的固相核酸擴(kuò)增反應(yīng)完成后，取出固相檢測(cè)陣列首先放入洗脫液A中，轉(zhuǎn)速至少30rpm離心洗脫至少 Imin ；然后將固相檢測(cè)陣列覆蓋親和反應(yīng)液后37°C孵育至少IOmin后，再依次放入洗脫液 A、洗脫液B中，轉(zhuǎn)速至少30rpm離心洗脫至少Imin ；取出固相檢測(cè)陣列用ddH20沖洗，最后覆蓋顯色反應(yīng)液進(jìn)行顯色，至看到顯色斑點(diǎn)后終止反應(yīng)；所述的洗脫液 A 的組成為 100mmol/L pH = 7. 5 的 Tris-Cl、300mmol/L NaCl 和 4mmol/ L Mg2Cl ；洗脫液 B 的組成為 100mmol/L pH = 9. 5 的 Tris-Cl、300mmol/L NaCl 和 4mmol/L Mg2Cl。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于乙型肝炎病毒基因耐藥突變檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，試劑盒包括用于PCR擴(kuò)增乙型肝炎病毒基因P區(qū)的引物對(duì)、表面固定有耐藥檢測(cè)探針和對(duì)照探針的固相檢測(cè)陣列、包含DNA聚合酶和反應(yīng)底物的固相載體上核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系和顯色試劑。本發(fā)明通過(guò)以基因芯片為基礎(chǔ)，PCR反應(yīng)技術(shù)為原理的高通量、高特異性、快速、且易于推廣的檢測(cè)方法，將檢測(cè)探針固定在檢測(cè)陣列上，與PCR擴(kuò)增的待測(cè)基因片段進(jìn)行雜交，當(dāng)目的片段被固相載體上的探針識(shí)別后，能夠進(jìn)行核酸序列的合成延長(zhǎng)，使得被生物素標(biāo)記的擴(kuò)增片段固定在檢測(cè)陣列上而不被洗脫，進(jìn)而顯色顯示，就可以檢測(cè)出待檢測(cè)乙肝病毒的耐藥突變產(chǎn)生情況。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102230025SQ20111015283
公開日2011年11月2日 申請(qǐng)日期2011年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月8日
發(fā)明者劉永蘭, 包晗, 梁平, 汪欽, 王偉, 王偉華, 郭晏海, 顏真 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)