專利名稱：用于區(qū)分原發(fā)性肺癌與癌旁組織的microRNA標志物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，更具體地，本發(fā)明涉及ー類可用于區(qū)分原發(fā)性肺癌與癌旁組織的microRNA標志物及其用途。本發(fā)明還涉及檢測所述microRNA標志物的芯片和試劑盒。
背景技術：
肺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，惡性程度高，發(fā)展迅速，治療困難，病死率高。因此，肺癌的盡早診斷就愈發(fā)顯得迫切。任何事物的發(fā)生發(fā)展都處于內(nèi)外因共同作用之下，內(nèi)因為主，外因為輔?；蜃鳛樯倪z傳介質(zhì)，在生物體的生、老、病、死中處于基礎的內(nèi)因地位。絕大部分基因通過轉(zhuǎn)錄 生成核糖核酸，再翻譯生成蛋白質(zhì)而發(fā)揮生物學功能。microRNA (miR或miRNA，微小RNA)是ー類在較高等的真核生物體內(nèi)廣泛存在的，長度約18-26個堿基的單鏈RNA分子。它可以通過堿基配對原則特異性地與ー些mRNA上的靶位點相結(jié)合，引起靶mRNA降解或翻譯抑制，進而在轉(zhuǎn)錄后水平對靶基因進行調(diào)控。microRNA來源于長度約IOOObp的長鏈RNA初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(Pri-miRNA)，Pri-miRNA分子在細胞核中經(jīng)Drosha酶剪切形成長度約60_80nt的具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNA前體(PreniRNA)。PreniRNA轉(zhuǎn)運至胞質(zhì)后，被Dicer酶進ー步切割成長約22nt的雙鏈miRNA。雙鏈miRNA解開后，成熟的miRNA進入RNA誘導基因沉默復合物(RNA-inducedsilencing complex, RISC),與互補mRNA完全或不完全配對，降解祀mRNA或阻遏其表達。盡管microRNA在細胞總RNA中所占的比重很小，但由于它可以高效地對所有具有靶位點的mRNA產(chǎn)生調(diào)控作用，microRNA在生物體的發(fā)育乃至腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程所起的作用仍不可小視。然而，迄今為止，本領域?qū)τ谂c腫瘤(如肺癌)相關的microRNA 了解甚少，因此本領域迫切需要進ー步地分離各種microRNA，尤其是與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、復發(fā)或檢測有關的microRNAο

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供ー類新的、可用于區(qū)分原發(fā)性肺癌癌組織及癌旁組織的microRNA標志物及其用途。本發(fā)明的另ー目的是提供檢測所述microRNA標志物的芯片和試劑盒。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種分離的miRNA，所述的miRNA選自⑴序列如SEQ ID NO 38所示的miRNA，其中η為選自ト38的正整數(shù)；或(ii)與 SEQ ID NO n 所示序列互補的 miRNA。在另ー優(yōu)選例中，所述的miRNA分離自人。在本發(fā)明的第二方面,提供了ー種miRNA集(set)或組合(combination),所述的集或組合由序列如SEQ ID NO 1-38所示的38種miRNA所構(gòu)成。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種分離的或人工構(gòu)建的前體miRNA，所述的前體miRNA能在人細胞內(nèi)剪切并表達成本發(fā)明第一方面中所述的miRNA。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種分離的多核苷酸，所述的多核苷酸能被人細胞轉(zhuǎn)錄成前體miRNA，所述的前體miRNA能在人細胞內(nèi)被剪切且表達成本發(fā)明第一方面中所述的miRNA。在另ー優(yōu)選例中，所述的多核苷酸具有式I所示的結(jié)構(gòu)Seq正向-X-Seq反向式 I,式I 中，能在人細胞中表達成所述的miRNA的核苷酸序列；與Seq1^1基本上互補或完全互補的核苷酸序列； X為位于Seq正向和Seq反向之間的間隔序列，并且所述間隔序列與Seq正向和Seq反向不互補；并且式I所示的結(jié)構(gòu)在轉(zhuǎn)入人細胞后，形成式II所示的ニ級結(jié)構(gòu)
Seq 正向—,~
NX
Seq反向式II，式II中，Seq正向、Seq反向和X的定義如上述，I I表示在Seqtt和Seqfi^1之間形成的堿基互補配對關系。在本發(fā)明的第五方面，提供了ー種載體，它含有本發(fā)明第一方面中所述的miRNA，或第四方面中所述的多核苷酸。在本發(fā)明的第六方面，提供了本發(fā)明第一方面中所述的miRNA的用途，用于制備區(qū)分原發(fā)性肺癌癌組織及癌旁組織的芯片或試劑盒。在本發(fā)明的第七方面，提供了ー種miRNA芯片，所述的miRNA芯片包括固相載體；以及有序固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述的寡核苷酸探針特異性地對應于 SEQ ID NO :1-38 所示的部分或全部序列(如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38 種)。在另ー優(yōu)選例中，所述的寡核苷酸探針含有互補結(jié)合區(qū)；和/或與固相載體相連的連接區(qū)。在本發(fā)明的第八方面，提供了上述miRNA芯片的用途，用于制備區(qū)分原發(fā)性肺癌癌組織及癌旁組織的試劑盒。在本發(fā)明的第九方面，提供了ー種試劑盒，所述的試劑盒中含有本發(fā)明上述所述的miRNA芯片。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。應理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術方案。限于篇幅，在此不
再一一累述。


圖I顯示以MDS算法轉(zhuǎn)換后的有癌樣本(淺色)和癌旁樣本(深色)在三維空間內(nèi)的散點圖。
具體實施方式

本發(fā)明人經(jīng)過長期而廣泛的研究，通過檢測原發(fā)性肺癌的癌組織樣本和癌旁組織樣本的microRNA表達譜水平,用統(tǒng)計學方法,首次從中篩選出38個特異性的microRNA。經(jīng)檢驗證明，這些特異性的microRNA標志物可非常有效地區(qū)分原發(fā)性肺癌癌組織及癌旁組織。在此基礎上完成了本發(fā)明。具體地，本發(fā)明人采用芯片雜交的方法得到原發(fā)肺癌的癌組織樣本和癌旁組織樣本的microRNA表達譜，通過比較兩種組織的表達譜，得到癌組織樣本和癌旁組織這兩種樣本間差異表達的microRNA。以這些差異microRNA作為候選,使用貝葉斯網(wǎng)絡(BayesNet)、支持向量機(IibSVM)、前饋神經(jīng)網(wǎng)絡(RBFnetwork)和支持向量回歸模型(SMO)篩選得到分類準確度為93. 42%的一組分類器(含38個microRNA)。由這38個microRNA組成的分類器，可預測樣本是來自癌組織還是癌旁組織，其預測準確度達到93. 42%?；诒景l(fā)明的這38個microRNA,可以開發(fā)成小型microRNA芯片或RT-PCR試劑盒用于區(qū)分肺癌組織和癌旁組織。miRNA及其前體本發(fā)明提供了ー類新的從人中發(fā)現(xiàn)的miRNA。如本文所用，所述的“miRNA”是指ー種RNA分子，從可形成miRNA前體的轉(zhuǎn)錄物加工而來。成熟的miRNA通常具有18-26個核苷酸(nt)(更特別的約19-22nt)，也不排除具有其它數(shù)目核苷酸的miRNA分子。miRNA通?？杀籒orthern印跡檢測到。人來源的miRNA可被從人細胞中分離。如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。miRNA 可從前體 miRNA (Precursor miRNA, Pre-miRNA)加工而來，所述的前體miRNA可折疊成ー種穩(wěn)定的莖環(huán)(發(fā)夾)結(jié)構(gòu)，所述的莖環(huán)結(jié)構(gòu)長度一般在50-100bp之間。所述的前體miRNA可折疊成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖部兩側(cè)包含基本上互補的兩條序列。所述的前體miRNA可以是天然的或是人工合成的。前體miRNA可被剪切生成miRNA，所述的miRNA可與編碼基因的mRNA的至少一部分序列基本上互補。如本文所用，“基本上互補”是指核苷酸的序列是足夠互補的，可以以ー種可預見的方式發(fā)生相互作用，如形成ニ級結(jié)構(gòu)(如莖環(huán)結(jié)構(gòu))。通常，兩條“基本上互補”的核苷酸序列互相之間至少有70%的核苷酸是互補的；優(yōu)選的，至少有80%的核苷酸是互補的；更優(yōu)選的，至少有90%的核苷酸是互補的；進一步優(yōu)選的，至少有95%的核苷酸是互補的；如98%、99%或100%。一般地，兩條足夠互補的分子之間可以具有最多40個不匹配的核苷酸；優(yōu)選的，具有最多30個不匹配的核苷酸；更優(yōu)選的，具有最多20個不匹配的核苷酸；進一步優(yōu)選的，具有最多10個不匹配的核苷酸，如具有1、2、3、4、5、8、11個不匹配的核苷酸。
如本文所用，“莖環(huán)”結(jié)構(gòu)也被稱作“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)，是指一種核苷酸分子，其可形成一種包括雙鏈區(qū)域(莖部)的ニ級結(jié)構(gòu)，所述的雙鏈區(qū)域由該核苷酸分子的兩個區(qū)域(位于高一分子上)形成，兩個區(qū)域分列雙鏈部分的兩側(cè)；其還包括至少ー個“環(huán)”結(jié)構(gòu)，包括非互補的核苷酸分子，即單鏈區(qū)域。即使該核苷酸分子的兩個區(qū)域不是完全互補的，核苷酸的雙鏈部分也可保持雙鏈狀態(tài)。例如，插入、缺失、取代等可導致ー個小區(qū)域的不互補或該小區(qū)域自身形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)或其它形式的ニ級結(jié)構(gòu)，然而，該兩個區(qū)域仍可基本上互補，并在可預見的方式中發(fā)生相互作用，形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙鏈區(qū)域。莖環(huán)結(jié)構(gòu)是本領域技術人員所熟知的，通常在獲得了一條具有一級結(jié)構(gòu)的核苷酸序列的核酸后，本領域技術人員能夠確定該核酸是否能形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明所述的miRNA具有如SEQ ID NO 38所示的序列，其中η為選自1_38的正整數(shù)。
為了提高miRNA的穩(wěn)定性或其它性質(zhì)，還可在所述的miRNA的至少一端加上至少ー個保護性堿基，如“TT”等。反義寡核苷酸根據(jù)本發(fā)明所提供的miRNA序列，可以設計出了它們的反義寡核苷酸，所述的反義寡核苷酸可在體內(nèi)下調(diào)相應的miRNA的表達。如本文所用，“反義寡核苷酸(antisense-oligonucleotides, AS-Ons或AS0) ”又稱為“反義核苷酸”，是指長度約為18-26nt (更特別的約19-22nt)的DNA分子或RNA分子或其類似物。在本發(fā)明中，所述的“反義寡核苷酸”還包括采用如基于核酸鎖或核酸鏈骨架修飾技術等手段獲得的經(jīng)修飾的反義核苷酸，所述的修飾基本不改變反義寡核苷酸的活性，更佳地，所述修飾可提高反義寡核苷酸的穩(wěn)定性、活性或治療效果。核酸鎖(locked nucleicacid,LNA)通常是指通過ー個亞甲基橋?qū)⒑颂堑?’氧原子和4’碳原子連接起來的修飾技術。LNA能延長miRNA的血清半衰期，提高對靶標親和性，減少脫靶作用的范圍和程度?；诤怂徭湽羌艿男揎椉夹g發(fā)展出的反義藥物在可溶性，抗核酸酶降解等方面大有改善，且易于大量合成。寡核苷酸的骨架修飾方法有多種，包括硫代法，例如將脫氧核苷酸鏈硫代修飾為硫代脫氧核苷酸鏈。該方法是將DNA骨架上的磷酸鍵的氧原子用硫原子替代，可抵抗核酸酶降解。應理解，任何能夠保持所述反義寡核苷酸的大部分或全部活性的修飾都包含在本發(fā)明中。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，對反義寡核苷酸進行核酸鎖修飾；更佳地還進行硫代修飾。將本發(fā)明所述的反義寡核苷酸轉(zhuǎn)移到人體內(nèi)后，它們能夠明顯下調(diào)相關miRNA的表達。多核苷酸構(gòu)建物根據(jù)本發(fā)明所提供的人miRNA序列，可設計出在被導入后可被加工成可影響相應的mRNA表達的miRNA的多核苷酸構(gòu)建物，也即所述多核苷酸構(gòu)建物能夠在體內(nèi)上調(diào)相應的miRNA的量。因此，本發(fā)明提供了一種分離的多核苷酸(構(gòu)建物)，所述的多核苷酸(構(gòu)建物)可被人細胞轉(zhuǎn)錄成前體miRNA，所述的前體miRNA可被人細胞剪切且表達成所述的miRNA。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述的多核苷酸構(gòu)建物含有式I所示的結(jié)構(gòu)
Seq正向-X-Seq反向式 I,式I 中，Seq正^)為可在細胞中表達成所述的miRNA的核苷酸序列，與Seq正^)基本上互補的核苷酸序列；或者，Seq&@為可在細胞中表達成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq1向為與Seq正向基本上互補的核苷酸序列；X為位于Seq正向和Seq反向之間的間隔序列，并且所述間隔序列與Seq正向和Seq反向不互補；式I所示的結(jié)構(gòu)在轉(zhuǎn)入細胞后，形成式II所示的ニ級結(jié)構(gòu)
Seq正向
iiX
Seq 反向 ~式II，式II中，Seq正向、Seq反向和X的定義如上述；I I表示在Seqtt和Seqfi^1之間形成的堿基互補配對關系。通常，所述的多核苷酸構(gòu)建物位于表達載體上。因此，本發(fā)明還包括ー種載體，它含有所述的miRNA,或所述的多核苷酸構(gòu)建物。所述的表達載體通常還含有啟動子、復制起點和/或標記基因等。本領域的技術人員熟知的方法能用于構(gòu)建本發(fā)明所需的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內(nèi)重組技術等。所述的表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細胞的表型性狀，如卡拉霉素、慶大霉素、潮霉素、氨芐青霉素抗性。芯片microRNA表達譜芯片通常含有多達幾百個探針，涵蓋多種microRNA，利用DNA雙鏈同源互補的原理在全基因組水平上檢測樣本中所含各種microRNA的含量。因此，可在同一時間對待測樣本中全基因組范圍內(nèi)的microRNA的轉(zhuǎn)錄水平進行檢測。利用本發(fā)明所述的miRNA序列，還可以制備相應的miRNA芯片，進而研究其表達譜WlmiRNAs的調(diào)節(jié)方式。在另一方面，本發(fā)明還提供一種用于分析miRNA表達譜的芯片，所述的芯片可用于區(qū)分原發(fā)性肺癌癌組織及癌旁組織。本發(fā)明的所述的miRNA芯片包括固相載體；以及有序固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述的寡核苷酸探針特異性地對應于 SEQ ID NO :1-38 所示的序列中的至少 I 種(如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、
15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38 種)。具體地，可根據(jù)本發(fā)明所述的miRNA，設計出適合的探針，固定在固相載體上，形成“寡核苷酸陣列”。所述的“寡核苷酸陣列”是指具有可尋址位置(即以區(qū)別性的，可訪問的地址為特征的位置)的陣列，每個可尋址位置均含有一個與其相連的特征性寡核苷酸。根據(jù)需要，可將寡核苷酸陣列分成多個亞陣。所述固相載體可采用基因芯片領域的各種常用材料，例如但不限于尼龍膜，經(jīng)活性基團(如醛基、氨基等)修飾的玻片或硅片、未修飾的玻片、塑料片等。所述的miRNA芯片的制備可采用本領域已知的生物芯片的常規(guī)制造方法。例如，如果固相載體采用的是修飾玻片或硅片，探針的5’端含有氨基修飾的聚dT串，可將寡核苷酸探針配制成溶液，然后采用點樣儀將其點在修飾玻片或硅片上，排列成預定的序列或陣列，然后通過放置過夜來固定，就可得到本發(fā)明的miRNA芯片。如果核酸不含氨基修飾，則其制備方法也可參照王申五主編的《基因診斷技木-非放射性操作手冊》；J. L. erisi, V. R. Iyer, P. O. BROWN. Exploring the metabolic and genetic control ofgene expression on a genomic scale. Science, 1997 ;278 :680和馬立人，蔣中華主編.生物芯片·北京化學エ業(yè)出版社，2000，1-130。另ー方面，本發(fā)明還提供了一種通過miRNA芯片檢測人組織中miRNA表達譜的方法，包括步驟(I)提供分離自人組織的RNA樣品，在所述的RNA上設置標記物；(2)將(I)的RNA與所述的芯片接觸，使所述的RNA與固相載體上的寡核苷酸探針發(fā)生雜交反應，從而在固相載體上形成“寡核苷酸探針-RNA” ニ元復合物； (3)檢測(2)形成的ニ元復合物的標記物，從而確定人組織中相應的miRNA的表達
-i'Tfeレ曰。從人組織中提取RNA的方法是本領域技術人員熟知的方法，包括Trizol法。更優(yōu)選的，在步驟(I)中，在從人組織組織中分離出RNA樣品后，對RNA樣品進行適當處理，以富集具有一定長度的RNA，所述長度一般在10-100之間(小片段RNA)。在經(jīng)過上述處理后，利用這些小片段RNA進行后續(xù)的雜交，這樣可提高芯片捕獲miRNA的準確性。本領域人員可方便地分離出具有一定片段長度的RNA，比如可采用凝膠電泳法來分離。對RNA進行標記也是本領域技術人員熟知的方法，其可通過在雜交時加入與RNA特異性結(jié)合的標記物的方法實現(xiàn)，所述標記物比如是標記基團。所述的標記基團包括但不限于地高辛分子(DIG)、生物素分子(Bio)、熒光素及其衍生生物分子(FITC等)、其它熒光分子(如Cy3、Cy5等)、堿性磷酸酶(AP)、辣根過氧化物酶(HRP)等。這些標記及其標記方法都已是本領域眾所周知的常規(guī)技木。將上述的RNA與miRNA芯片進行雜交時，可以先將miRNA芯片與預雜交緩沖液進行預雜交。本發(fā)明所述的RNA與miRNA芯片之間的固相雜交按照本領域的經(jīng)典方法進行，本領域一般人員依據(jù)經(jīng)驗容易確定有關緩沖液、探針和樣本濃度、預雜交溫度、雜交溫度以及時間等的最適條件?；蛘咭部梢詤⒄铡斗肿涌寺嶒炛改稀分兴龅?。然后根據(jù)標記信號在miRNA芯片上的位置、強度等信息獲取待測信息。若擴增產(chǎn)物用熒光基團標記，也可直接用熒光檢測設備(如激光共聚焦掃描儀Scanarray 3000等)獲取待測信息。檢測試劑盒本發(fā)明還提供了ー種試劑盒，所述的試劑盒中含有本發(fā)明的芯片。所述的試劑盒可用于檢測miRNA的表達譜；或用于區(qū)分原發(fā)性肺癌癌組織及癌旁組織。更優(yōu)選的，所述的試劑盒中還含有用于標記RNA樣品的標記物，以及與所述標記物相對應的底物。此外，所述的試劑盒中還可包括用于提取RNA、PCR、雜交、顯色等所需的各種試劑，包括但不限干抽提液、擴增液、雜交液、酶、對照液、顯色液、洗液、抗體等。
此外，所述的試劑盒中還可包括使用說明書和/或芯片圖像分析軟件。本發(fā)明的主要優(yōu)點在干(a)本發(fā)明提供了ー類可用于區(qū)分原發(fā)性肺癌癌組織及癌旁組織的、新的microRNA標志物。(b)由本發(fā)明新的microRNA標志物所構(gòu)成的分類器，可非常有效地區(qū)分原發(fā)性肺癌癌組織及癌旁組織。下面結(jié)合具體實施例，進ー步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆實驗室手冊' (New York Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。
實施例I RNA樣本的制備I.組織樣本46對癌和癌旁組織來自于原發(fā)性肺癌患者的手術切除標本，這些標本來自于上海胸科醫(yī)院。上述所有標本的取得均通過上海市政府授權的WHO合作組織倫理委員會的同意。組織樣本的臨床資料包括性別、年齡、腫瘤大小、病理分級( m分期)、轉(zhuǎn)移與否、復發(fā)與否等。2.基因芯片microRNA表達譜芯片,采用博奧生物有限公司的晶芯 miRNA表達譜芯片(單通道芯片)。3.組織總RNA提取3. I樣品的收集和保存離體組織切割成小塊后立即置于液氮中速凍，然后可以移至_80°C冰箱保存。3. 2組織塊破碎組織塊放于液氮中研磨成粉，每克組織加入ImlTrizol (Invitrogen 公 ロJ )。3. 3總RNA抽提按每毫升Trizol加O. 2ml的氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫孵育2_3分鐘；4°C，IOOOOg離心15分鐘；將無色上清液移入新的離心管中，加O. 5ml異丙醇，室溫孵育10分鐘，IOOOOg 4°C離心10分鐘;倒掉上清，0. 75ml75%こ醇洗滌，4°C，7500g離心5分鐘；倒掉上清，室溫干燥RNA沉淀5-10分鐘(勿使RNA完全干燥)，用DEPC處理后的無RNA酶H2O溶解沉淀。3. 4分光光度計法定量RNA，并取少量總RNA進行電泳，檢查RNA是否降解。實施例2 microRNA的提取和標記用Ambion公司的miRNAs抽提試劑盒抽提獲得miRNA,具體操作按照相應說明書。樣品用T4RNA連接酶標記步驟依照Thomson的方法。簡而言之，方法如下I. 4 μ g 小 RNA 和 500ng 5 '-憐酸鹽-胞卩密唳-尿卩密唳-cy3_3 ' (Dharmacon,Chicago,USA)及 2 單位 T4RNA ligase (NEB，Ipswich，USA)，于 4°C孵育 2 小時，對 miRNA 進行標記。每份miRNA樣品均設等量的相應陰性對照。2.標記的RNA用O. 3M醋酸鈉和2. 5體積こ醇進行沉淀，再用15 μ I含3XSSC、O. 2% SDS和15%甲酰胺的雜交液重懸，所有的雜交重復兩次，雜交用LifterSlipTM(Erie，PA USA)以保證雜交液在芯片和蓋片之間均勻流動。3.將雜交室放在雜交儀 BioMixer II 上(CapitalBio Corp,Beijing, China)于42°C水浴雜交過夜,之后用洗液洗兩遍。實施例3篩選差異顯著的microRNAI. 46例癌樣本和46例癌旁樣本分別經(jīng)熒光染料標記后，與microRNA表達譜芯片上的探針競爭性雜交。雜交后的芯片用晶芯 LuxScaiTlOK微陣列芯片掃描儀掃描獲得結(jié)果圖像，再通過其隨機附帯的LuxScan 3. O通用微陣列圖像分析軟件對雜交結(jié)果定量。由此，得到46對癌樣本(癌，Cancer, C)和癌旁樣本(癌旁，Pericancerous, P)的microRNA表達譜數(shù)據(jù)。將上述46張癌芯片結(jié)果和46張癌旁芯片結(jié)果首先用LOWESS (局部加權回歸分祈)歸ー化。之后，經(jīng)歸ー化后的癌、癌旁的芯片結(jié)果取以2為底的對數(shù)(Iog2X),使用經(jīng)配 對T檢驗方法(因為癌組織和癌旁組織來源于同一個病人)校正后的隨機方差模型(RVM)篩選得到癌/癌旁(C/P)的顯著性差異microRNA。為驗證microRNA差異的顯著性不是由巧合引起的，本發(fā)明人引入上述T檢驗方法后再對數(shù)據(jù)隨機重排1000次,檢測ー個microRNA在通過前述方法篩選后被檢定為顯著性差異 microRNA 的假陽性率(FDR, False Discovery Rate)。在上述統(tǒng)計學方法中，只有P值< O. 05的microRNA才會被篩選為顯著性差異microRNAο2.分類器(可區(qū)分兩類組織的miCToRNA)的篩選與驗證在分子標志物篩選過程中采用了共五種模型貝葉斯網(wǎng)絡(BayesNet)、支持向量機(IibSVM)、前饋神經(jīng)網(wǎng)絡(RBFnetwork)和支持向量回歸模型(SMO)，其中SVM模型采用了兩種核函數(shù)進行計算，在此基礎上采用了不同的算法對分子標志物進行計算篩選。為檢驗分類器的分類準確度，本發(fā)明人選用在所有的交叉檢驗方法中最穩(wěn)定的10乘10折交叉檢驗法。10折交叉檢驗法，是將樣本總體分成10個子份，每次選I個子份作為測試數(shù)據(jù)集，其余9個子份作為訓練數(shù)據(jù)集，重復10次(每次以不同的一個子份作為測試數(shù)據(jù)集)。如此得到的10個檢驗結(jié)果相結(jié)合形成對分類器分類準確度的ー個評估值。為直觀地顯示同組樣本間的相似以及不同組樣本間的相異，本發(fā)明人在3維視效中引入多維標度法(multidimensional scaling, MDS)。MDS算法以被分類器(ー組microRNA)定義的樣本-樣本間相似度矩陣為基礎，確定姆ー個樣本在低維空間內(nèi)的位置，并使之適應于3維視效。在此3維空間中，兩樣本越接近，則它們越相似；反之，若兩樣本相距越遠，則它們之間越不同。3.結(jié)果癌組織與癌旁組織間共篩選到155個差異microRNA。以這些差異microRNA作為分類器候選。套入上述分類器算法并使用前述的10乘10折的交叉檢驗來驗證分類器的分類準確度。經(jīng)1000次數(shù)據(jù)置換的10乘10折交叉驗證得到分類器后，為測試該分類器的預測能力，本發(fā)明人隨機挑選一部分樣本對全體樣本計算得到的結(jié)果進行測試檢驗。這幾種分類器中準確率最高的為93. 42%，即由SMO-BestFirst (支持向量回歸模型-最優(yōu)結(jié)果優(yōu)先搜索)模型計算得到的38個microRNA組成的分類器(見表I)，其分類準確度可達到93. 42%。使用該模型對18對獨立樣本來源地未知樣本進行預測，準確率達到94. 4444%。為便于直觀顯示分類器的分類效果，本發(fā)明人使用MDS算法將各個樣本的38個microRNA信號值轉(zhuǎn)換為3維的本征矢量，并將它們在3維空間中定位，繪制成癌和癌旁兩類樣本的三維散點圖(見圖I)。由圖I可判斷異組的任意兩個樣本間的距離是否比同組的任意兩個樣本間的距離要大。

表I
權利要求
1.一種分離的miRNA,其特征在于,所述的miRNA選自 ⑴序列如SEQ ID NO n所示的miRNA，其中n為選自1_38的正整數(shù)；或 (ii)與SEQ ID NO n所示序列互補的miRNA。
2.—種miRNA集，其特征在于，所述的miRNA集由序列如SEQ ID NO : 1_38所示的38種miRNA所構(gòu)成。
3.一種分離的或人工構(gòu)建的前體miRNA，其特征在于，所述的前體miRNA能在人細胞內(nèi)剪切并表達成權利要求I所述的miRNA。
4.一種分離的多核苷酸,其特征在于,所述的多核苷酸能被人細胞轉(zhuǎn)錄成前體miRNA,所述的前體miRNA能在人細胞內(nèi)被剪切且表達成權利要求I所述的miRNA。
5.如權利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸具有式I所示的結(jié)構(gòu) Seq正向_x_Seq反向 式I中， Seq1^1為能在人細胞中表達成所述的miRNA的核苷酸序列； Seq&@為與Seq1^1基本上互補或完全互補的核苷酸序列； X為位于Seqtt和Seq&^^間的間隔序列，并且所述間隔序列與Seqtt和Seqg不互補； 并且式I所示的結(jié)構(gòu)在轉(zhuǎn)入人細胞后，形成式II所示的二級結(jié)構(gòu)
6.一種載體，其特征在于，它含有權利要求I所述的miRNA，或權利要求4所述的多核苷酸。
7.權利要求I所述的miRNA的用途，其特征在于，用于制備區(qū)分原發(fā)性肺癌癌組織及癌旁組織的芯片或試劑盒。
8.一種miRNA芯片，其特征在于，所述的miRNA芯片包括 固相載體；以及 有序固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述的寡核苷酸探針特異性地對應于SEQ ID NO :1-38所示的部分或全部序列。
9.如權利要求8所述的miRNA芯片的用途，其特征在于，用于制備區(qū)分原發(fā)性肺癌癌組織及癌旁組織的試劑盒。
10.一種試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中含有權利要求8所述的miRNA芯片。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于區(qū)分原發(fā)性肺癌與癌旁組織的microRNA標志物。具體地，本發(fā)明涉及38個可用于區(qū)分原發(fā)性肺癌癌組織及癌旁組織的microRNA標志物。經(jīng)檢驗證明，這些特異性的microRNA標志物可非常有效地區(qū)分原發(fā)性肺癌癌組織及癌旁組織。本發(fā)明還涉及檢測所述microRNA標志物的芯片和試劑盒。
文檔編號C12N15/113GK102851282SQ201110182978
公開日2013年1月2日 申請日期2011年6月30日 優(yōu)先權日2011年6月30日
發(fā)明者何祥火, 梁琳慧, 陸舜, 陳智偉, 虞永峰 申請人:上海市腫瘤研究所