專利名稱：基于多個基因輔助診斷多發(fā)性骨髓瘤患者的定量檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于多個基因輔助診斷多發(fā)性骨髓瘤患者的定量檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)是威脅生命的漿細(xì)胞性惡性腫瘤，在血液惡性腫瘤中發(fā)病率位于第二位。盡管干細(xì)胞移植以及新型藥物治療可以使病情得到有效控制，但很少有患者能夠取得完全緩解甚至治愈，復(fù)發(fā)和死亡的結(jié)局仍不可避免。分子生物學(xué)的發(fā)展使越來越多的腫瘤相關(guān)基因?yàn)槿藗兯J(rèn)知，這些重要的分子標(biāo)志已在血液系統(tǒng)惡性腫瘤的診斷和治療中發(fā)揮了極大的作用，在MM中雖然已發(fā)現(xiàn)涉及免疫球蛋白基因重排、C-MYC、RAS癌基因突變及人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶mRNA過度表達(dá)等，但缺乏公認(rèn)的腫瘤相關(guān)的特異性診斷、微小殘留病檢測和預(yù)后評估的分子靶標(biāo)。癌睪丸抗原(Cancer testis antigen，CT抗原)基因是與惡性腫瘤相關(guān)的基因家族，編碼免疫原性蛋白質(zhì)，在過去15年間已鑒定了 40多個家族，表達(dá)特點(diǎn)是限制性表達(dá)于正常組織睪丸、卵巢和胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞，其他正常組織幾乎不表達(dá)，而在多種腫瘤組織中有不同頻率的表達(dá)，且可誘導(dǎo)抗體介導(dǎo)和T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。基于其在腫瘤患者及正常組織中的表達(dá)特點(diǎn)和免疫原性，CT抗原已被認(rèn)為是有應(yīng)用前景的人類惡性腫瘤免疫治療的靶標(biāo)，并有可能成為重要的診斷和預(yù)后標(biāo)志。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基于多個基因輔助診斷多發(fā)性骨髓瘤患者的定量檢測試齊U盒。本發(fā)明提供了一種輔助診斷多發(fā)性骨髓瘤患者的試劑盒，包括引物探針組合物甲、引物探針組合物乙和引物探針組合物丙；所述引物探針組合物甲由特異性引物對甲和探針甲組成；所述引物探針組合物乙由特異性引物對乙和探針乙組成；所述引物探針組合物丙由特異性引物對丙和探針丙組成；所述特異性引物對甲為序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對；所述探針甲的核苷酸序列如序列表的序列3所示； 所述特異性引物對乙為序列表的序列4所示DNA和序列表的序列5所示DNA組成的引物對； 所述探針乙的核苷酸序列如序列表的序列6所示；所述特異性引物對丙為序列表的序列7 所示DNA和序列表的序列8所示DNA組成的引物對；所述探針丙的核苷酸序列如序列表的序列9所示。所述試劑盒具體可由所述引物探針組合物甲、所述引物探針組合物乙和所述引物探針組合物丙組成。所述試劑盒還可包括引物探針組合物丁 ；所述引物探針組合物丁由特異性引物對丁和探針丁組成；所述特異性引物對丁為序列表的序列10所示DNA和序列表的序列11所示DNA組成的引物對；所述探針丁的核苷酸序列如序列表的序列12所示。
所述試劑盒具體可由所述引物探針組合物甲、所述引物探針組合物乙、所述引物探針組合物丙和所述弓I物探針組合物丁組成。所述試劑盒還可包括陽性質(zhì)粒甲、陽性質(zhì)粒乙和陽性質(zhì)粒丙；所述陽性質(zhì)粒甲為含有MAGE-C1/CT7基因(NCBI基因庫序列號匪_00546幻或其片段的重組質(zhì)粒；所述陽性質(zhì)粒乙為含有MAGE-A3基因(NCBI基因庫序列號匪_00536幻或其片段的重組質(zhì)粒；所述陽性質(zhì)粒丙為含有MAGE-C2/CT10基因(NCBI基因庫序列號匪_016對鍆或其片段的重組質(zhì)粒。所述試劑盒還可可包括陽性質(zhì)粒丁 ；所述陽性質(zhì)粒丁為含有SSX-2基因(NCBI基因庫序列號NM_175698/003147)或其片段的重組質(zhì)粒。所述陽性質(zhì)粒甲可為含有序列表的序列13所示的MAGE-C1/CT7基因片段的重組質(zhì)粒。所述陽性質(zhì)粒乙可為含有序列表的序列14所示的MAGE-A3基因片段的重組質(zhì)粒。所述陽性質(zhì)粒丙可為含有序列表的序列15所示的MAGE-C2/CT10基因片段的重組質(zhì)粒。所述陽性質(zhì)粒丁可為含有序列表的序列16所示的SSX-2基因片段的重組質(zhì)粒。所述陽性質(zhì)粒甲具體可為將pMDIS-T載體與序列表的序列13所示的MAGE-C1/CT7 基因片段連接得到的重組質(zhì)粒。所述陽性質(zhì)粒乙具體可為將PMD18-T載體與序列表的序列 14所示的MAGE-A3基因片段連接得到的重組質(zhì)粒。所述陽性質(zhì)粒丙具體可為將pMD18_T載體與序列表的序列15所示的MAGE-C2/CT10基因片段連接得到的重組質(zhì)粒。所述陽性質(zhì)粒丁具體可為將PMD18-T載體與序列表的序列16所示的SSX-2基因片段連接得到的重組質(zhì)粒。所述試劑盒還可包括針對內(nèi)參基因的內(nèi)參引物對和內(nèi)參探針；所述內(nèi)參基因?yàn)?ABL基因(NCBI基因庫序列號NM_005157)。所述內(nèi)參引物對具體可為序列表的序列17所示DNA和序列表的序列18所示DNA 組成的引物對；所述內(nèi)參探針的核苷酸序列具體可如序列表的序列19所示。所述試劑盒還可包括內(nèi)參質(zhì)粒；所述內(nèi)參質(zhì)粒為含有ABL基因或其片段的重組質(zhì)粒。所述內(nèi)參質(zhì)?？蔀楹行蛄斜淼男蛄?0所示的ABL基因片段的重組質(zhì)粒。所述內(nèi)參質(zhì)粒具體可為將PMD18-T載體與序列表的序列20所示的ABL基因片段連接得到的重組質(zhì)粒。所述引物探針組合物甲、所述引物探針組合物乙和所述引物探針組合物丙可用于制備輔助診斷多發(fā)性骨髓瘤的試劑盒。所述引物探針組合物甲、所述引物探針組合物乙、所述引物探針組合物丙和所述引物探針組合物丁可用于制備輔助診斷多發(fā)性骨髓瘤的試劑盒。對42例匪患者跟蹤樣本的檢測發(fā)現(xiàn)，在表達(dá)某一 CT抗原基因且治療無效患者中其MAGE-C1/CT7、MAGE-A3、MAGE-C2/CT10基因皆100%持續(xù)表達(dá)，在治療有效患者中仍有 50%持續(xù)表達(dá)至少這三種基因之一，而SSX-2基因的表達(dá)則不穩(wěn)定。MAGE-C 1/CT7.MAGE-A3 和MAGE-C2/CT10基因的陽性率、表達(dá)水平以及共表達(dá)的陽性基因數(shù)均與MM患者骨髓漿細(xì)胞數(shù)顯著相關(guān)，基因的表達(dá)變化與患者臨床病程一致，其中MAGE-C1/CT7基因的變化有統(tǒng)計學(xué)意義。MAGE-C1/CT7、MAGE-A3及MAGE-C2/CT10基因表達(dá)水平和共表達(dá)的陽性基因數(shù)與多項(xiàng)有預(yù)后意義的臨床指標(biāo)顯著相關(guān)，且基因的高水平表達(dá)與患者生存時間縮短，總體生存率下降有關(guān)。SSX-2基因雖然與多項(xiàng)臨床指標(biāo)沒有直接關(guān)聯(lián)，但可以作為以上三種基因的補(bǔ)充，增加檢測MM病人的靈敏性。 MAGE-C 1/CT7、MAGE-A3、MAGE-C2/CT 10 和 SSX-2 基因的表達(dá)水平是潛在的 MM 輔助診斷、預(yù)后評估及療效監(jiān)測的有意義的臨床指標(biāo)。本發(fā)明對于深入了解MM的發(fā)病機(jī)制，認(rèn)識其發(fā)生發(fā)展規(guī)律，提高我國MM診治水平具有重要的價值，也為尋求新的MM靶向治療策略奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明的試劑盒，不僅可以應(yīng)用于定性輔助診斷多發(fā)性骨髓瘤，還可以通過內(nèi)參基因，測定患者各個基因的表達(dá)水平。本發(fā)明為多發(fā)性骨髓瘤的診斷提供了一條快速、可靠、準(zhǔn)確的新途徑，為療效觀察、微小殘留病的動態(tài)觀察提供依據(jù)。本發(fā)明將在醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。


圖1為內(nèi)參對照質(zhì)粒RQ-PCR熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖2為陽性對照質(zhì)粒甲的RQ-PCR熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖3為陽性對照質(zhì)粒乙的RQ-PCR熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖4為陽性對照質(zhì)粒丙的RQ-PCR熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖5為高表達(dá)MAGE-C1/CT7基因的多發(fā)性骨髓瘤患者(志愿者)的cDNA的RQ-PCR 熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖6為各個基因表達(dá)量與漿細(xì)胞數(shù)和⑶38+/⑶138+漿細(xì)胞數(shù)的相關(guān)性結(jié)果。圖7為各個基因的表達(dá)量與患者生存時間的相關(guān)性結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。TRIzol kits 購自hvitrogen公司。RNAsin 購自華美生物技術(shù)公司。dNTP 購自Pharmecia公司。Mo-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、5 X標(biāo)準(zhǔn)緩沖液購自Promega公司。DNA連接酶 購自TakaRa公司。Universal PCR Master mix 購自天根生物技術(shù)有限公司。Phusion High-fidelity PCR Kit 購自 New England Biolabs 公司。Dami細(xì)胞購自上海坤肯生物化工有限公司，中國細(xì)胞庫典藏細(xì)胞中心細(xì)胞目錄QK10058。K562細(xì)胞購自上海坤肯生物化工有限公司，中國細(xì)胞庫典藏細(xì)胞中心細(xì)胞目錄QK1(^69。MEG-Ol細(xì)胞購自上海坤肯生物化工有限公司，中國細(xì)胞庫典藏細(xì)胞中心細(xì)胞目錄QK10748。RPMI82^細(xì)胞購自美國ATCC (美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心)，產(chǎn)品目錄號為CCL-155。U266細(xì)胞購自美國ATCC，產(chǎn)品目錄號為TIB-196。KM3細(xì)胞購自上海拜力生物科技有限公司。KG-I細(xì)胞購自中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫，產(chǎn)品目錄號為KCB 200552YJ。 HL60細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，產(chǎn)品目錄號為TCHu 23。Nalm-6細(xì)胞購自北京大學(xué)疾病基因研究中心。CEM細(xì)胞購自美國ATCC，產(chǎn)品目錄號為CCL-119。多發(fā)性骨髓瘤診斷及分期標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)Greipp PR, San Miguel J, Durie BG, et al. International Staging System for Multiple Myeloma. Journal of Clinical Oncology，2005，15 :3412-3420.。療效的評價標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)Durie BG, Harousseau JL, Miguel JS, et al. International uniform response criteria for multiple myeloma.Leukemia. 2006,20 :1467-1473.。統(tǒng)計分析應(yīng)用SPSS軟件v. 13. 0。計量資料采用方差分析，計數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)。臨床資料與CT抗原基因表達(dá)間的相關(guān)性用直線相關(guān)分析。ρ < 0. 05被認(rèn)為是有統(tǒng)計學(xué)意義。通過單因素和多因素分析評價因素與生存的相關(guān)性，采用 Log-rank檢驗(yàn)鑒定生存相關(guān)因素，ρ < 0. 05的變量納入Cox回歸分析，ρ < 0. 2定義為與生存預(yù)后相關(guān)的因素。 實(shí)施例3至9中的PCR參數(shù)均如下PCR反應(yīng)體系(10 μ 1)上游引物0. 9 μ Μ，下游引物0. 9 μ Μ，探針0. 25 μ Μ, 2 X TaqMan通用PCR公共體系5 μ 1 (ABI公司，美國)，質(zhì)粒1 ；其余為去離子水。PCR 反應(yīng)條件50°C 2min, 1 個循環(huán)；95°C IOmin, 1 個循環(huán)；95°C 15s,60°C lmin, 50 個循環(huán)。實(shí)施例1、特異性引物對和探針的設(shè)計MAGE-C1/CT7基因(NCBI基因庫序列號NM 005462)位于人染色體Xq26，針對 MAGE-C1/CT7基因設(shè)計特異性引物對甲(由上游引物MAG-FPl和下游引物MAG-RPl組成，擴(kuò)增產(chǎn)物為79bp)和探針甲(探針MAG-T-probel)上游引物MAG-FP1(序列表的序列 1) :5，-TTGTCTTCTGGGAACCTTGACTC-3，；下游引物MAG-RPl (序列表的序列幻5，-TGAGGGACACATACATCCTAAAAGC-3，；探針MAG-T-probel (5，— 3，)FAM-ACTGCCTGGGCCTCCTCTGCTGT-BHQ(核苷酸序列為序列表的序列 3)。MAGE-A3基因(NCBI基因庫序列號匪005362)位于人染色體Xq28，針對MAGE-A3 基因的特異性引物對乙(由上游引物MAG-FP2和下游引物MAG-RP2組成，擴(kuò)增產(chǎn)物為 172bp)和探針乙(探針 MAG-T-pr。be2)上游引物MAG-FP2(序列表的序列 4) 5，-GGTGAGGAGGCAAGGTTCTGA-3，；下游引物MAG-RP2(序列表的序列幻5，-GTGCTGACTCCTCTGCTCAAGAG-3，；探針MAG-T_probe2(5，一 3，)FAM-AGATCTGCCAGTGGGTCTCCATTGCC-BHQ(核苷酸序列為序列表的序列 6)。MAGE-C2/CT10基因(NCBI基因庫序列號匪016M9)位于人染色體Xq27，針對 MAGE-C2/CT10基因設(shè)計特異性引物對丙(由上游引物MAG-FP3和下游引物MAG-RP3組成， 擴(kuò)增產(chǎn)物為137bp)和探針丙(MAG-T-probe3)上游引物MAG-FP3(序列表的序列 7) 5，-GTGTGAGGCACACAGCCTAAAG-3，；下游引物MAG-RP3(序列表的序列 8) 5，-GGAGGCATGACGACTTCTTCA-3，；探針MAG-T_probe3(5，— 3，)FAM-AGGAGTCAAGGCCTGTTGGATCTCATCA-BHQ(核苷酸序列為序列表的序列 9)。SSX-2基因(NCBI基因庫序列號NM_175698/003147)位于人染色體Xpll. 22，針對SSX-2基因設(shè)計特異性引物對丁(由上游引物SSX-FP和下游引物SSX-RP組成，擴(kuò)增產(chǎn)物為IlObp)和探針丁(探針SSX-T-probe)上游引物SSX-FP (序列表的序列 10) :5，-TAACCGTGGGAATCAGGTTGA-3，下游引物SSX-RP (序列表的序列 11) :5，-CCTCCGAATCATTTCCTTCCT-3，探針SSX-T-probe (5，— 3，)FAM-CCGAAGATCATGCCCAAGAAGCCAG-BHQ(核苷酸序列為序列表的序列 12)。
針對ABLl基因(內(nèi)參基因；NCBI基因庫序列號匪005157)設(shè)計內(nèi)參引物對 (由上游引物ABLl-F和下游引物ABLl-R組成，擴(kuò)增產(chǎn)物為124bp)和內(nèi)參探針(探針 ABLl-T-probe)上游引物ABLI-F (序列表的序列 17) 5，-TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3， 下游引物ABL1-R(序列表的序列 18) :5，-GATGTAGTTGCTTGGGACCCA-3，；探針ABLl-T_probe(5，— 3，)FAM-CCATTTTTGGTTTGGGCTTCACACCATT-TAMRA(核苷酸序列為序列表的序列 19)。分別合成特異性引物對甲和探針甲，特異性引物對乙和探針乙，特異性引物對丙和探針丙，特異性引物對丁和探針丁，內(nèi)參引物對和內(nèi)參探針。(可參考文獻(xiàn)合成 Gabert J, Beillard E, van der Velden VH, et al.Standardization and quality control studies of， real-time' quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia—a Europe Against Cancer program. Leukemia. 2003,17 :2318-57.)。實(shí)施例2、相關(guān)質(zhì)粒的制備一、陽性對照質(zhì)粒甲(含有MAGE-C1/CT7基因片段的質(zhì)粒)的制備以MAGE-C1/CT7基因表達(dá)陽性的多發(fā)性骨髓瘤患者(志愿者)的骨髓單個核細(xì)胞的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表的序列13(632bp)所示， 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后，克隆入PMD18-T質(zhì)粒(PMD18-T載體系統(tǒng)，上海皓嘉公司，產(chǎn)品目錄號 D101A)，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci (天根生化公司，產(chǎn)品目錄號⑶101-02)感受態(tài)， 篩選陽性克隆提取質(zhì)粒并純化后進(jìn)行測序，結(jié)果表明得到了陽性對照質(zhì)粒甲(骨架質(zhì)粒為 PMD18-T質(zhì)粒，在ECOR V位點(diǎn)插入序列13所示cDNA)。PCR擴(kuò)增所用的引物對如下CT7FP :5，-ACATCCTCACCCTCAGGAGGG-3，；CT7RP :5，-GACGAGGATCGTCTCAGGTCAGC-3，。二、陽性對照質(zhì)粒乙(含有MAGE-A3基因片段的質(zhì)粒)的制備以MAGE-A3基因表達(dá)陽性的多發(fā)性骨髓瘤患者(志愿者)的骨髓單個核細(xì)胞的 cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表的序列14所示(42!3bp)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后，克隆入PMD18-T質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)，篩選陽性克隆提取質(zhì)粒并純化后進(jìn)行測序，結(jié)果表明得到了陽性對照質(zhì)粒乙(骨架質(zhì)粒為PMD18-T質(zhì)粒，在ECOR V位點(diǎn)插入序列14所示cDNA)。PCR擴(kuò)增所用的引物對如下上游引物5，-GAAGCCGGCCCAGGCTCG-3，；下游引物5，-GGAGTCCTCATAGGATTGGCT-3，。三、陽性對照質(zhì)粒丙(含有MAGE-C2/CT10基因片段的質(zhì)粒)的制備以MAGE-C2/CT10基因表達(dá)陽性的多發(fā)性骨髓瘤患者(志愿者)的骨髓單個核細(xì)胞的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表的序列15所示(884bp)， 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后，克隆入PMD18-T質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)，篩選陽性克隆提取質(zhì)粒并純化后進(jìn)行測序，結(jié)果表明得到了陽性對照質(zhì)粒丙(骨架質(zhì)粒為PMD18-T質(zhì)粒，在ECOR V位點(diǎn)插入序列15所示cDNA)。PCR擴(kuò)增所用的引物對如下上游引物5，-CGGATCGGAGGCATTTGTGAG-3，；下游引物5，-ATGAACTCACGGGCTCTCTTGAG-3，。四、陽性對照質(zhì)粒丁(含有SSX-2基因片段的質(zhì)粒)的制備以SSX-2基因表達(dá)陽性的多發(fā)性骨髓瘤患者(志愿者)的骨髓單個核細(xì)胞的cDNA 為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表的序列16所示G35bp)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后，克隆入PMD18-T質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)，篩選陽性克隆提取質(zhì)粒并純化后進(jìn)行測序，結(jié)果表明得到了陽性對照質(zhì)粒丁(骨架質(zhì)粒為PMD18-T質(zhì)粒，在 ECOR V位點(diǎn)插入序列16所示cDNA)。PCR擴(kuò)增所用的引物對如下上游引物5，-GTGCTCAAATACCAGAGAAGATC-3，；下游引物5，-TTTTGGGTCCAGATCTCTCGTG-3，。五、內(nèi)參對照質(zhì)粒(含有ABL基因片段的質(zhì)粒)的制備以正常人(志愿者)的骨髓單個核細(xì)胞的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表的序列8所示(124bp)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后，克隆入pMDIS-T質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)，篩選陽性克隆提取質(zhì)粒并純化后進(jìn)行測序，結(jié)果表明得到了內(nèi)參對照質(zhì)粒(骨架質(zhì)粒為PMD18-T質(zhì)粒，在ECOR V位點(diǎn)插入序列20所示cDNA)。PCR擴(kuò)增所用的弓丨物對如下上游引物5，-TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3，；下游引物5，-GATGTAGTTGCTTGGGACCCA-3，。六、陰性對照質(zhì)粒pMD18-T 質(zhì)粒。實(shí)施例3、檢測陽性對照質(zhì)粒的靈敏度檢測將實(shí)施例2得到的陽性對照質(zhì)粒甲用滅菌雙蒸注射用水進(jìn)行梯度稀釋得到各個稀釋液(稀釋液的濃度范圍為每微升含有10°至IO5個拷貝的MAGE-C1/CT7基因片段)； 將實(shí)施例2得到的陽性對照質(zhì)粒乙用滅菌雙蒸注射用水進(jìn)行梯度稀釋得到各個稀釋液(稀釋液的濃度范圍為每微升含有10°至IO7個拷貝的MAGE-A3基因片段)；將實(shí)施例2得到的陽性對照質(zhì)粒丙用滅菌雙蒸注射用水進(jìn)行梯度稀釋得到各個稀釋液(稀釋液的濃度范圍為每微升含有10°至IO7個拷貝的MAGE-C2/CT10基因片段)；將實(shí)施例2得到的內(nèi)參對照質(zhì)粒用滅菌雙蒸注射用水進(jìn)行梯度稀釋得到各個稀釋液(稀釋液的濃度范圍為每微升含有10°至IO6個拷貝的ABL基因片段)；通過測定吸光度值計算MAGE-C1/CT7基因片段、 MAGE-A3基因片段、MAGE-C2/CT10基因片段、SSX-2基因片段或ABL基因片段的拷貝數(shù))。將各個陽性對照質(zhì)粒甲稀釋液采用實(shí)施例1得到的特異性引物對甲和探針甲在熒光實(shí)時定量PCR儀上進(jìn)行RQ-PCR。將各個陽性對照質(zhì)粒以稀釋液采用實(shí)施例1得到的特異性引物對乙和探針乙在熒光實(shí)時定量PCR儀上進(jìn)行RQ-PCR。將各個陽性對照質(zhì)粒丙稀釋液采用實(shí)施例1得到的特異性引物對丙和探針丙在熒光實(shí)時定量PCR儀上進(jìn)行RQ-PCR。 將各個陽性對照質(zhì)粒丁稀釋液采用實(shí)施例1得到的特異性引物對丁和探針丁在熒光實(shí)時定量PCR儀上進(jìn)行RQ-PCR。將各個內(nèi)參對照質(zhì)粒采用實(shí)施例1得到的內(nèi)參引物對和內(nèi)參探針在熒光實(shí)時定量PCR儀上進(jìn)行RQ-PCR。均采用美國ABI公司7500-FAST型熒光實(shí)時定量 PCR 儀。將ABLl基因片段、MAGE-A3基因片段、MAGE-C2/CT10基因片段和SSX-2基因片段擴(kuò)增曲線的閾值定為0. 082，MAGE-C1/CT7擴(kuò)增曲線的閾值定為0. 2。內(nèi)參對照質(zhì)粒RQ-PCR熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1 (閾值為0. 082)，函數(shù)為Io^1ABLl = (Ct-38. 46)/-3. 22，相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.99以上，檢測內(nèi)參基因的靈敏度達(dá)10個拷貝。陽性對照質(zhì)粒甲的RQ-PCR熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2(閾值為0. 2)，函數(shù)為log1QMAGECl/CT7 = (Ct-31. 232)/-3. 281，相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0. 99以上，檢測MAGE-C1/CT7基因片段的靈敏度可達(dá)1個拷貝。陽性對照質(zhì)粒乙的RQ-PCR熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3 (閾值為0. 082)，函數(shù)為 log10MAGE-A3 = (Ct-41. 83)/-3. 57，相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0. 99以上，檢測MAGE-A3基因片段的靈敏度可達(dá)10個拷貝。陽性對照質(zhì)粒丙的RQ-PCR熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4 (閾值為0. 082)，函數(shù)為 log10MAGE-C2/CT10 = (Ct-40. 41)/-3. 43，相關(guān)系數(shù)均達(dá)到 0. 99 以上，檢測 MAGE-C2/ CTlO基因片段的靈敏度可達(dá)10個拷貝。將一例多發(fā)性骨髓瘤患者(志愿者)的cDNA，用滅菌雙蒸注射用水1 :10梯度稀釋，采用實(shí)施例1得到的特異性引物對丁和探針丁在熒光實(shí)時定量PCR儀上進(jìn)行 RQ-PCR(美國ABI公司7500-FAST型)。擴(kuò)增曲線顯示Ct值和SSX-2啟始模板量的對數(shù)存在線性相關(guān)(相關(guān)系數(shù)大于0. 99，檢測靈敏度達(dá)10_4，閾值為0. 082 ；見圖5)，其擴(kuò)增效率與 ABL基因相近，為減少實(shí)驗(yàn)誤差，均用ABL標(biāo)準(zhǔn)曲線計算基因拷貝數(shù)，檢測SSX-2基因片段的靈敏度可達(dá)10個拷貝。將7位MAGEC1/CT7基因陽性的多發(fā)性骨髓瘤患者cDNA，用滅菌雙蒸注射用水1 10稀釋，制備成6個系列的稀釋樣品(10-1，ΙΟ"2, ΙΟ"3, ΙΟ"4, ΙΟ"5,10_6稀釋樣本)，采用實(shí)施例 1得到的特異性引物對甲和探針甲在熒光實(shí)時定量PCR儀上進(jìn)行RQ-PCR。結(jié)果見表1。結(jié)果表明，應(yīng)用本發(fā)明提供的特異性引物對甲和探針甲通過RQ-PCR檢測7例MAGEC1/CT7基因陽性的多發(fā)性骨髓瘤患者，靈敏度可達(dá)10_4或10_5稀釋度。表1多發(fā)性骨髓瘤患者cDNA標(biāo)本10倍系列稀釋的擴(kuò)增曲線特征
權(quán)利要求
1.一種輔助診斷多發(fā)性骨髓瘤患者的試劑盒，包括引物探針組合物甲、引物探針組合物乙和引物探針組合物丙；所述引物探針組合物甲由特異性引物對甲和探針甲組成；所述引物探針組合物乙由特異性引物對乙和探針乙組成；所述引物探針組合物丙由特異性引物對丙和探針丙組成；所述特異性引物對甲為序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對；所述探針甲的核苷酸序列如序列表的序列3所示；所述特異性引物對乙為序列表的序列4所示DNA和序列表的序列5所示DNA組成的引物對；所述探針乙的核苷酸序列如序列表的序列6所示；所述特異性引物對丙為序列表的序列7所示DNA和序列表的序列8所示DNA組成的引物對；所述探針丙的核苷酸序列如序列表的序列9所示。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括引物探針組合物?。凰鲆锾结樈M合物丁由特異性引物對丁和探針丁組成；所述特異性引物對丁為序列表的序列10所示DNA和序列表的序列11所示DNA組成的引物對；所述探針丁的核苷酸序列如序列表的序列12所示。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括陽性質(zhì)粒甲、陽性質(zhì)粒乙、陽性質(zhì)粒丙和陽性質(zhì)粒丁 ；所述陽性質(zhì)粒甲為含有MAGE-C1/CT7基因或其片段的重組質(zhì)粒；所述陽性質(zhì)粒乙為含有MAGE-A3基因或其片段的重組質(zhì)粒；所述陽性質(zhì)粒丙為含有 MAGE-C2/CT10基因或其片段的重組質(zhì)粒；所述陽性質(zhì)粒丁為含有SSX-2基因或其片段的重組質(zhì)粒。
4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述陽性質(zhì)粒甲為含有序列表的序列13 所示的MAGE-C1/CT7基因片段的重組質(zhì)粒；所述陽性質(zhì)粒乙為含有序列表的序列14所示的 MAGE-A3基因片段的重組質(zhì)粒；所述陽性質(zhì)粒丙為含有序列表的序列15所示的MAGE-C2/ CTlO基因片段的重組質(zhì)粒；所述陽性質(zhì)粒丁為含有序列表的序列16所示的SSX-2基因片段的重組質(zhì)粒。
5.如權(quán)利要求1至4中任一所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括針對內(nèi)參基因的內(nèi)參引物對和內(nèi)參探針；所述內(nèi)參基因?yàn)锳BL基因。
6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述內(nèi)參引物對為序列表的序列17所示 DNA和序列表的序列18所示DNA組成的引物對；所述內(nèi)參探針的核苷酸序列如序列表的序列19所示。
7.如權(quán)利要求5或6所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括內(nèi)參質(zhì)粒；所述內(nèi)參質(zhì)粒為含有ABL基因或其片段的重組質(zhì)粒。
8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于所述內(nèi)參質(zhì)粒為含有序列表的序列20所示的ABL基因片段的重組質(zhì)粒。
9.引物探針組合物甲、引物探針組合物乙和引物探針組合物丙在制備輔助診斷多發(fā)性骨髓瘤的試劑盒中的應(yīng)用；所述引物探針組合物甲由特異性引物對甲和探針甲組成；所述引物探針組合物乙由特異性引物對乙和探針乙組成；所述引物探針組合物丙由特異性引物對丙和探針丙組成；所述特異性引物對甲為序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對；所述探針甲的核苷酸序列如序列表的序列3所示；所述特異性引物對乙為序列表的序列4所示DNA和序列表的序列5所示DNA組成的引物對；所述探針乙的核苷酸序列如序列表的序列6所示；所述特異性引物對丙為序列表的序列7所示DNA和序列表的序列8所示DNA組成的引物對；所述探針丙的核苷酸序列如序列表的序列9所示。
10.引物探針組合物甲、引物探針組合物乙、引物探針組合物丙和引物探針組合物丁在制備輔助診斷多發(fā)性骨髓瘤的試劑盒中的應(yīng)用；所述引物探針組合物甲由特異性引物對甲和探針甲組成；所述引物探針組合物乙由特異性引物對乙和探針乙組成；所述引物探針組合物丙由特異性引物對丙和探針丙組成；所述引物探針組合物丁由特異性引物對丁和探針丁組成；所述特異性引物對甲為序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對；所述探針甲的核苷酸序列如序列表的序列3所示；所述特異性引物對乙為序列表的序列4所示DNA和序列表的序列5所示DNA組成的引物對；所述探針乙的核苷酸序列如序列表的序列6所示；所述特異性引物對丙為序列表的序列7所示DNA和序列表的序列 8所示DNA組成的引物對；所述探針丙的核苷酸序列如序列表的序列9所示；所述特異性引物對丁為序列表的序列10所示DNA和序列表的序列11所示DNA組成的引物對；所述探針丁的核苷酸序列如序列表的序列12所示。
全文摘要
本發(fā)明公開了基于多個基因輔助診斷多發(fā)性骨髓瘤患者的定量檢測試劑盒。本發(fā)明提供了包括引物探針組合物甲(序列1和2所示核苷酸序列組成的引物對甲和序列3所示探針甲)、引物探針組合物乙(序列4和5所示核苷酸序列組成的引物對乙和序列6所示探針乙)、引物探針組合物丙(序列7和8所示核苷酸序列組成的引物對丙和序列9所示探針丙)和引物探針組合物丁(序列10和11所示核苷酸序列組成的引物對丁和序列12所示探針丁)的試劑盒。本發(fā)明為多發(fā)性骨髓瘤的診斷提供了一條快速、可靠、準(zhǔn)確的新途徑，為療效觀察、微小殘留病的動態(tài)觀察提供依據(jù)。本發(fā)明將在醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。
文檔編號C12Q1/68GK102242209SQ201110187368
公開日2011年11月16日 申請日期2011年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月5日
發(fā)明者劉開彥, 張瑤, 江濱, 阮國瑞, 陳珊珊, 黃曉軍 申請人:北京大學(xué)人民醫(yī)院