專利名稱：：乙肝病毒L基因和hGM-CSF的融合基因及其表達(dá)載體的構(gòu)建與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種乙型肝炎病毒全包膜蛋白L基因與人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落剌激因子hGM-CSF基因的融合基因及其表達(dá)載體的構(gòu)建與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：乙型肝炎病毒(H印atitisBvirus，HBV)的感染是一個(gè)非常嚴(yán)重的全球性健康問(wèn)題。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)公布的資料，目前全球60億人口中有20億人感染過(guò)乙型肝炎病毒，占全球人口三分之一。在乙肝病毒攜帶者中，約25%的人最終將轉(zhuǎn)化為慢性肝病，包括肝硬化和肝癌。到目前為止，仍然沒(méi)有特效藥物消除人體內(nèi)的乙肝病毒，一旦發(fā)病只能對(duì)癥治療?？刂埔腋蝹鞑サ闹饕侄问墙臃N有效的疫苗進(jìn)行預(yù)防和有效地阻斷傳播途徑，從而降低其發(fā)病率。目前應(yīng)用的乙肝基因工程疫苗主要由中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO細(xì)胞)和啤酒酵母表達(dá)的乙肝病毒表面抗原主蛋白(S蛋白)顆粒組成，在臨床上表現(xiàn)出了較好的免疫效果。但是，在應(yīng)用的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)仍有10%20%人群接種乙肝疫苗表現(xiàn)為無(wú)反應(yīng)或弱反應(yīng)，甚至根本不產(chǎn)生抗體，且僅有預(yù)防作用，而無(wú)治療作用。隨著年齡的上升，無(wú)反應(yīng)或弱反應(yīng)者增多，尤其是在艾滋病感染者、腎透析和免疫抑制病人中這種低反應(yīng)或不反應(yīng)的發(fā)生率會(huì)更高。另外，由于長(zhǎng)期推廣乙肝疫苗后，HBVS基因變異株以弱勢(shì)準(zhǔn)種形式廣泛存在，有可能在免疫后人群中流行而成為新的公共問(wèn)題。因此，目前使用的乙肝基因工程疫苗迫切需要得到改進(jìn)。研制新型免疫原性更好的乙肝疫苗是國(guó)內(nèi)學(xué)者迫切需要解決的課題。DNA疫苗具有亞單位疫苗或滅活疫苗的安全性，同時(shí)具有減毒疫苗或重組疫苗才具有的誘導(dǎo)保護(hù)性細(xì)胞免疫應(yīng)答的特點(diǎn)。目前，乙肝DNA疫苗應(yīng)用面臨的主要問(wèn)題是目的基因表達(dá)效率較低，安全性問(wèn)題沒(méi)有很好解決，發(fā)酵純化等下游工藝仍不成熟。然而，乙肝DNA疫苗的優(yōu)勢(shì)是顯而易見(jiàn)的其構(gòu)建方便、制備工藝簡(jiǎn)單、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、保存運(yùn)輸方便、價(jià)格低廉、可用于構(gòu)建多價(jià)疫苗及預(yù)防不同亞型的病毒感染。由于乙肝DNA疫苗可高效誘導(dǎo)包括體液免疫及細(xì)胞免疫的全身性免疫應(yīng)答，因而不僅可以預(yù)防而且還可以治療乙肝。HBV基因組是一部分雙鏈DNA分子，由約3200個(gè)堿基對(duì)組成，HBV基因組的全部順序均為蛋白編碼區(qū)，由相互重疊的4個(gè)基因S、C、P和X基因組成，分別編碼外膜蛋白(HBsAg)、核心蛋白(HBcAg)、聚合酶和X蛋白。本發(fā)明中選擇的乙肝抗原基因?yàn)榭梢员磉_(dá)乙肝包膜大蛋白(L蛋白)的S區(qū)全基因，即可表達(dá)PreSl、PreS2和S抗原三種抗原成分。許多實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明preSl肽段含有好幾個(gè)免疫原性比S蛋白更強(qiáng)的T細(xì)胞和B細(xì)胞表位，由preSl引起的細(xì)胞特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答可以幫助克服某些人對(duì)S蛋白的免疫無(wú)反應(yīng)狀態(tài)或同時(shí)對(duì)preSl和preS2蛋白雙重?zé)o反應(yīng)狀態(tài)，preS2中也含有多個(gè)抗原表位和病毒中和位點(diǎn)。在疫苗制劑中加入preSl和preS2的抗原表位后，人群對(duì)傳統(tǒng)的乙肝疫苗的不反應(yīng)和低反應(yīng)頻率大大降低。Geissler等將包含preSl、preS2的S區(qū)基因以及HBcAg編碼基因的重組質(zhì)粒接種小鼠，誘導(dǎo)產(chǎn)生了高滴度抗-HBs及抗-HBc，93%的小鼠不僅產(chǎn)生了強(qiáng)烈的針對(duì)病毒蛋白的CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫，而且產(chǎn)生了CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的CTL效應(yīng)，同時(shí)伴有Thl細(xì)胞因子的產(chǎn)生。因而含有乙肝病毒preS2和preSl抗原成分或HBVS基因變異株核心蛋白成分的各種新型重組乙肝疫苗具有更大的免疫原性，能誘導(dǎo)更高效的免疫應(yīng)答和抗體產(chǎn)生，中和乙肝病毒，保護(hù)機(jī)體免受病毒攻擊，并可打破免疫耐受，清除乙肝病毒。近年來(lái)，在針對(duì)乙肝的治療和乙肝疫苗的研制方面基因佐劑的作用越來(lái)越受到重視。人粒細(xì)胞_巨噬細(xì)胞集落刺激因子(humangranulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor，hGM-CSF)作為HBsAg的佐劑，能夠在早期對(duì)機(jī)體產(chǎn)生較高的抗體應(yīng)答并能夠增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞(DC)、抗原遞呈細(xì)胞(APC)的功能，增加細(xì)胞表面MHC分子、協(xié)同刺激分子(CM)和黏附分子的表達(dá)，以及促進(jìn)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子等，形成持續(xù)有效的免疫刺激，有利于機(jī)體產(chǎn)生遠(yuǎn)期的保護(hù)性免疫記憶。在對(duì)艾滋病患者以及健康人群、低應(yīng)答或無(wú)應(yīng)答健康人群、以及透析的腎衰患者等，采用不同HBsAg和GM-CSF的給藥劑量及給藥次數(shù)進(jìn)行的大量臨床試驗(yàn)中，GM-CSF快速、有效、持久地增加了受試者的抗體滴度。對(duì)于低應(yīng)答或無(wú)應(yīng)答人群，特別是接受透析的病人和艾滋病患者等，有直接感染風(fēng)險(xiǎn)的人群，能夠在早期形成對(duì)HBV較高水平的血清陽(yáng)轉(zhuǎn)率/血清保護(hù)率，GM-CSF能夠提高乙肝疫苗的效力，7起到很好的免疫調(diào)節(jié)劑的作用。因此，本發(fā)明選擇hGM-CSF為目的基因之一來(lái)構(gòu)建用于防治性乙肝的重組表達(dá)載體。分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為利用生物反應(yīng)器生產(chǎn)外源蛋白提供了許多方法和手段。到目前為止，已發(fā)展出了大腸桿菌、酵母、昆蟲、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等多種蛋白表達(dá)系統(tǒng)，其中酵母表達(dá)系統(tǒng)是最近發(fā)展起來(lái)的新型表達(dá)系統(tǒng)。最先使用的是釀酒酵母，1981年Hitzeman等用釀酒酵母成功地表達(dá)了人干擾素，但該系統(tǒng)具有一定的局限性，缺乏強(qiáng)有力的啟動(dòng)子，分泌效率差，質(zhì)粒不穩(wěn)定等。因此，人們?cè)诖嘶A(chǔ)上又尋找了新的酵母表達(dá)系統(tǒng)——畢赤酵母(PichiaPastoris)，即甲醇營(yíng)養(yǎng)型表達(dá)系統(tǒng)。此系統(tǒng)不僅具有高表達(dá)、高穩(wěn)定、高分泌的特點(diǎn)，而且其宿主甲醇酵母一巴斯德畢赤酵母具有高密度生長(zhǎng)的特性。甲醇酵母是可利用甲醇作為唯一碳源的酵母，主要有H.Polymorpha、CandidaBodinii、PichiaPastoris三禾中，其中PichiaPastoris作為基因表達(dá)系統(tǒng)使用得最多、最廣泛。目前美國(guó)H)A已能評(píng)價(jià)來(lái)自該系統(tǒng)的基因工程產(chǎn)品，最近來(lái)自該系統(tǒng)的C印helon制劑己獲得FDA批準(zhǔn)，所以該系統(tǒng)被認(rèn)為是安全的，Pichia.pastoris表達(dá)系統(tǒng)在生物工程領(lǐng)域?qū)l(fā)揮越來(lái)越重要的作用，促進(jìn)更多外源基因在該系統(tǒng)的高效表達(dá)，提供更為廣泛的基因工程產(chǎn)品，正是基于此，本研究采用該系統(tǒng)為新型乙肝疫苗的表達(dá)系統(tǒng)。畢赤酵母系統(tǒng)，除了具有一般酵母所具有的特點(diǎn)外，還有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)1)含有特有的強(qiáng)有力的AOX(醇氧化酶基因)啟動(dòng)子，這是目前最強(qiáng)，調(diào)控機(jī)理最嚴(yán)格的啟動(dòng)子之一，用甲醇可嚴(yán)格地調(diào)控外源基因的表達(dá)；2)表達(dá)水平高，即可在胞內(nèi)表達(dá)，又可分泌型表達(dá)，絕大多數(shù)外源基因比在細(xì)菌、釀酒酵母、動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)水平高，畢赤酵母酵母表達(dá)載體pPICZd帶有引導(dǎo)分泌的a信號(hào)肽序列，使表達(dá)的外源目的蛋白分泌到發(fā)酵液中，有利于分離純化；3)發(fā)酵工藝成熟，易放大；4)培養(yǎng)成本低，產(chǎn)物易分離；5)外源蛋白基因遺傳穩(wěn)定，一般外源蛋白基因整合到畢赤酵母染色體上，隨染色體復(fù)制而復(fù)制，不易丟失；6)作為真核表達(dá)系統(tǒng)，畢赤酵母具有真核生物的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，具有糖基化、脂肪?；?、蛋白磷酸化等翻譯后修飾加工功能。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種乙肝病毒全包膜L(HBV-L)基因和免疫佐劑人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(hGM-CSF)基因的融合基因。本發(fā)明的另一目的在于提供一種包含上述融合基因的真核表達(dá)載體的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。本發(fā)明的再一目的在于提供一種包含上述融合基因的酵母表達(dá)載體的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種乙肝病毒全包膜L基因和人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落剌激因子hGM-CSF融合基因，其序列如SEQIDNO.1所述。一種包含了權(quán)利要求1所述乙肝病毒全包膜L基因和人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子hGM-CSF融合基因的真核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)方法，包括以下歩驟(1)引物設(shè)計(jì)根據(jù)乙肝病毒全包膜L基因的編碼序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增乙肝病毒全包膜L基因的l對(duì)引物上游引物序列為PI5'-CAGCTAGCATAATGGGAGGTTGGTCT-3'含Nhel(GCTAGC)酶切位點(diǎn)和起始密碼子；下游引物序列為P25'-GGCGGAAGCTTAATGTATACCCAAAGAC-3';含HindIII(AAGCTT)酶切位點(diǎn)，并刪除終止密碼子；根據(jù)人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子hGM-CSF基因的編碼序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增hGM-CSF基因的1對(duì)引物上游引物序列為P35'-CCAAGCTTTCCGGTGGAGGTTCCATGTGGCTGCAGAGCC-3';含HindIII(AAGCTT)酶切位點(diǎn)和含TCCGGTGGAGGTTCC的Linker序列；下游引物序列為P45'-CGGAATTCATTCACTCCTGGACTGGCTC-3';含EcoRI(GAATTC)酶切位點(diǎn)和終止密碼子；(2)L基因的克隆與重組質(zhì)粒pVL的構(gòu)建將乙肝表面抗原陽(yáng)性患者血清采用苯酚/氯仿抽提法獲得DNA提取液，作為L(zhǎng)基因擴(kuò)增模板，用步驟(1)設(shè)計(jì)的引物P1和P2進(jìn)行常規(guī)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)，擴(kuò)增出乙肝病毒全包膜L基因片段，將純化后的乙肝病毒全包膜L基因片段和質(zhì)粒pVAXl分別用Nhel和HindlII進(jìn)行雙酶切，純化、連接、轉(zhuǎn)化獲得重組質(zhì)粒pVL;(3)重組質(zhì)粒pVAXl-L-hGM的構(gòu)建以質(zhì)粒pORF-hGMCSF作為模板，用步驟(1)設(shè)計(jì)的引物P3和P4進(jìn)行9常規(guī)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)，擴(kuò)增獲得hGM-CSF基因；將純化的hGM-CSF基因與歩驟(2)所得重組質(zhì)粒pVL分別用HindIII和EcoRI雙酶切，純化、連接、轉(zhuǎn)化獲得重組質(zhì)粒pVAXl-L-hGM;(4)重組質(zhì)粒pVAXl-L-hGM轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞及體外表達(dá)鑒定將酶切和測(cè)序鑒定正確的步驟(3)所得重組質(zhì)粒pVAXl-L-hGM轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，并通過(guò)免疫組織化學(xué)法和蛋白印跡法(West-blot)測(cè)融合基因的表達(dá)蛋白質(zhì)。步驟(2)所述常規(guī)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)具體步驟如下將混合液在94。C預(yù)變性5min，然后進(jìn)入下列循環(huán)94°C、45s，55。C、45s，72°C、lmin，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸10min，擴(kuò)增完畢后置4。C終止反應(yīng)；所述混合液組成如下濃度為10umo1/1的上游引物Pl1u1濃度為10咖o1/1的下游引物P21u1dATP、dTTP、dCTP、dGTP的濃度各為2.5mM的dNTP混合物4u1DNA提取液5u1含Mg2+的Ex耐熱性DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液5u1Ex耐熱性DNA聚合酶0.25u1滅菌水33.75p1歩驟(3)所述常規(guī)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)具體步驟如下將混合液在94。C預(yù)變性5min，然后進(jìn)入下列循環(huán)94°C、30s，59。C、30s，72°C、45s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72r延伸lOmin，擴(kuò)增完畢后置4"C終止反應(yīng)；所述混合液組成如下濃度為10umol/l的上游引物P31y1濃度為lOumol/1的下游引物P41u1dATP、dTTP、dCTP、dGTP的濃度各為2.5mM的dNTP混合物4u1質(zhì)粒pORF-hGMCSF1u1含Mg"的Ex耐熱性DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液5u1Ex耐熱性DNA聚合酶0.25u1滅菌水37.75n1上述方法構(gòu)建的真核表達(dá)載體可作為制備乙肝疫苗的用途。上述方法表達(dá)的融合基因的表達(dá)蛋白質(zhì)作為制備乙肝疫苗的用途。一種前述乙肝病毒全包膜L基因和人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子hGM-CSF基因的融合基因的酵母表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟(a)根據(jù)乙肝病毒全包膜L基因和人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(免疫佐劑)hGM-CSF基因的編碼序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增融合抗原基因L-linker-GM的l對(duì)引物上游引物序列為P55，-CCGGAATTCATGGGAGGTTGGTCTTCC-3，，含EcoRI酶切位點(diǎn)；下游引物序列為P65'-CGGGGTACCATCTCCTGGACTGGCTC-3'，含KpnI酶切位點(diǎn)；(b)以質(zhì)粒pVAXl-L-hGM為模板，用步驟(a)設(shè)計(jì)的引物P5和P6進(jìn)行常規(guī)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)擴(kuò)增L-linker-GM;(c)pPICZaC-L-GM酵母表達(dá)載體的構(gòu)建將酵母表達(dá)載體pPICZaC和歩驟(b)所得L-linker-GM分別用限制性內(nèi)切酶EcoRl和Kpnl進(jìn)行雙酶切處理，純化、連接、轉(zhuǎn)化獲得pPICZaC-L-GM酵母表達(dá)載體；(d)pPICZaC-L-GM酵母表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化取2025ug步驟(c)所得pPICZaC-L-GM酵母表達(dá)載體用BglII酶線性化消化，用苯酚、氯仿抽提，用10"1超純水溶解，得到線性化重組質(zhì)粒；將上述線性化重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌GS155，用PCR法篩選酵母菌。步驟(b)所述常規(guī)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)具體步驟如下將混合液在95'C預(yù)變性5min,然后進(jìn)入下列循環(huán)95°C、45s，57。C、45s，72°C、lmin,共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸10min，擴(kuò)增完畢后置4'C終止反應(yīng)；所述混合液組成如下濃度為10umo1/1的上游引物P51li1濃度為10umo1/1的下游引物P61u1dATP、dTTP、dCTP、dGTP的濃度各為2.5mM的dNTP混合物4u1質(zhì)粒pVAXl-L-hGM1u1Ex耐熱性DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液5u1Ex耐熱性DNA聚合酶0.25y1滅菌水37.75u1上述方法構(gòu)建的酵母表達(dá)載體可作為制備乙肝疫苗的用途。本發(fā)明的原理是采用基因工程技術(shù)，構(gòu)建了乙肝病毒全包膜蛋白L基因(包含PreSl，PreS2，S基因)和基人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因hGM-CSF融合基因的真核表達(dá)載體pVAXl-L-hGM，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞并通過(guò)免疫組織化學(xué)法和Westblot檢測(cè)融合蛋白L-hGM的表達(dá)，ELISA法檢測(cè)hGM-CSF蛋白表達(dá)水平，為開發(fā)具有防治作用的新型DNA乙肝疫苗奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)；在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建包含乙肝病毒包膜L基因和免疫佐劑hGM-CSF的融合基因的酵母表達(dá)載體pPICZaC-L-GM并轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌GS155;為開發(fā)具有防治作用的新型基因工程乙肝疫苗奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)中采用了被美國(guó)FDA批準(zhǔn)可用于人體的載體pVAXl克隆了編碼乙肝病毒全包膜蛋白與編碼hGM-CSF蛋白的融合基因，并通過(guò)一段由甘氨酸(glycine,G)和絲氨酸(serine,S)組成的五肽(G_S-G-G-S)連接到載體pVAXl上，由于G在所有氨基酸中分子量最小，沒(méi)有手性碳，柔性最好，位于融合蛋白之間不會(huì)影響兩邊蛋白的構(gòu)象和功能，而且空間位阻最小，S是親水性最強(qiáng)的氨基酸，能增加融合蛋白的親水性，因此，把Linker加入融合蛋白之間，目的在于盡可能使乙肝L蛋白和hGM-CSF折疊成天然三維結(jié)構(gòu)，保持原有的免疫原性，隨后我們將融合質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中通過(guò)免疫組化，Westernblot和ELISA分別檢測(cè)L蛋白和hGM-CSF在細(xì)胞中表達(dá)情況。試驗(yàn)結(jié)果表明，乙肝病毒L包膜蛋白和hGM均能在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，為研究新型乙肝疫苗奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明構(gòu)建的pVAXl-L-hGM，是一個(gè)包含4673個(gè)堿基對(duì)的閉環(huán)質(zhì)粒。它是將表達(dá)乙肝包膜大蛋白(L蛋白)的s區(qū)全基因與免疫佐劑hGM-CSF組成的融合基因插入到真核表達(dá)載體pVAXl中而構(gòu)建而成。本發(fā)明構(gòu)建的pPICZaC-L-GM，是一為5.2kb的酵母表達(dá)載體，可轉(zhuǎn)化于畢赤酵母中.本發(fā)明從目的基因的優(yōu)化、佐劑的運(yùn)用、載體選擇等全方位對(duì)乙肝疫苗進(jìn)行開發(fā)，相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及有益效果(1)乙肝病毒全包膜L基因(含Prel、Pre2、S基因)編碼的蛋白免疫原性強(qiáng)，能克服人們對(duì)傳統(tǒng)的啤酒酵母乙肝HBsAg疫苗S蛋白的免疫無(wú)反應(yīng)狀態(tài)或同時(shí)對(duì)preSl和preS2蛋白雙重?zé)o反應(yīng)狀態(tài)；(2)L蛋白基因和hGMCSF基因融合蛋白除蛋白分子量增大效應(yīng)外，hGM-CSF作為HBsAg的佐劑，能夠在早期對(duì)機(jī)體產(chǎn)生較高的抗體應(yīng)答它還能夠增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞(DC)、抗原遞呈細(xì)胞(APC)的功能，增加細(xì)胞表面MHC分子、協(xié)同剌激分子(CM)和黏附分子的表達(dá)，以及促進(jìn)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子等，形成持續(xù)有效的免疫剌激，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生遠(yuǎn)期的保護(hù)性免疫記憶；(3)本發(fā)明利用的真核表達(dá)載體為pVAXl載體，它是美國(guó)FDA認(rèn)可的安全性較高的并且可以用于人體研究的基因疫苗表達(dá)載體，本研究構(gòu)建的真核表達(dá)載體pVAXl-L-hGM可直接作為乙肝DNA疫苗，為后續(xù)的臨床前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)；(4)表達(dá)載體pPICZci帶有引導(dǎo)分泌的a信號(hào)肽序列，使表達(dá)的外源目的蛋白分泌到發(fā)酵液中，有利于分離純化，形成規(guī)?；a(chǎn)，該畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)已被認(rèn)為是最具有發(fā)展前景的生產(chǎn)蛋白質(zhì)的工具之一圖1為重組載體pVL示意圖。圖2為重組載體pVAXl-L-hGM示意圖。圖3為重組載體pVL構(gòu)建示意圖。圖4為重組載體pVAXl-L-hGM構(gòu)建示意圖。圖5為HBVL基因，hGM-CSF基因及L-linker-GM融合基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物圖，其中(自左至右)M:lkbDNAladdermarker;1:PCR擴(kuò)增的L產(chǎn)物；2:PCR擴(kuò)增的GM-CSF;3:PCR擴(kuò)增的L-GM;M:lOObpDNAladdermarker。圖6為重組質(zhì)粒pVAXl-L-hGM雙酶切瓊脂糖凝膠電泳圖，其中(自左至右)M:lOObpDNAladdermarker;1:pVAXl-L-hGM的Nhel和HindIII雙酶切產(chǎn)物；2:pVAXl-L-hGM的HindIII和EcoRl雙酶切產(chǎn)物；3:pVAXl-L-hGM的NheI和EcoRI雙酶切產(chǎn)物；M:lkbDNAladdermarker。圖7為免疫組織化學(xué)檢測(cè)L蛋白在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)圖，其中A:轉(zhuǎn)染pVAXl質(zhì)粒的293細(xì)胞的免疫組化染色結(jié)果(200X);B:轉(zhuǎn)染pVAXl-L-hGM質(zhì)粒的293細(xì)胞的免疫組化染色結(jié)果(200X)。圖8為pVAX卜L-hGM的表達(dá)產(chǎn)物的蛋白印跡，其中M:proteinmarker;1,2:樣品為轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pVAXl-L-hGM的293細(xì)胞的裂解液上清；3:樣品為293細(xì)胞的裂解液上清。圖9酵母表達(dá)載體pPICZaC-L-GM示意圖。圖10酵母表達(dá)載體pPICZaC-L-GM構(gòu)建示意圖。圖11為L(zhǎng)-linker-GM融合基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及酵母表達(dá)載體pPICZaC-L-GM限制性內(nèi)切酶鑒定圖，其中M:lkbDNAladdermarker;1:PCR擴(kuò)增的L-GM;2:pPICZaC-L-GM的EcoRl和KpnI雙酶切產(chǎn)物。圖12為pPICZaC-L-GM線性化結(jié)果圖，其中l(wèi)kbDNAladdermarker;1:pPICZaC的SacI酶切產(chǎn)物；2:pPICZaC_L-GM的SacI酶切產(chǎn)物。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。首先對(duì)實(shí)驗(yàn)材料的說(shuō)明如下質(zhì)粒pVAXl:美國(guó)FDA批準(zhǔn)可用于人體的DNA疫苗載體，購(gòu)自Invitrogen公司；pORF-hGMCSF:購(gòu)自InvivoGen公司；pPICZaC:購(gòu)自Invitrogen公司；乙肝表面抗原陽(yáng)性患者血清由廣州華僑醫(yī)院提供。大腸桿菌E.coliToplO，購(gòu)自天津天有利科技有限公司。畢赤酵母菌GS515購(gòu)自Invitrogen公司。細(xì)胞株HEK293細(xì)胞(人胚腎上皮細(xì)胞)購(gòu)自上海桑戈生物科技有限公司試劑HindIIIEcoRl酶，NhelKpnI酶BglII酶，T4DNA連接酶，ExTaq酶，DL-1kbmarker(大連寶生物公司)；試劑盒(質(zhì)粒DNA小提試劑盒，凝膠DNA純化回收試劑盒，OMEGA去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒)(OMEGA);PCR引物合成(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)；重組質(zhì)粒上目的基因的序列測(cè)定(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine-2000和配套液0pti-MEM購(gòu)自Invitrogen公司。鼠源抗HBsAg性單克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)即用型SABC試劑盒和DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。酵母提取物、胰蛋白胨、瓊脂糖粉(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)；瓊脂糖(美國(guó)Sigma公司)；簡(jiǎn)SO、青霉素鈉、硫酸鏈霉素、胰蛋白酶、H印es堿(廣州博理生物科技有限公司)；氨芐青霉素(北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)；謹(jǐn)EM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；6孔細(xì)胞培養(yǎng)、1.8ml凍存管板、0.22um—次性濾器(廣州普博公司)。培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基用于大腸桿菌的培養(yǎng)。YPD培養(yǎng)基、低鹽LB培養(yǎng)基:用于酵母菌培養(yǎng)于轉(zhuǎn)化。實(shí)施例1:基因克隆與真核表達(dá)載體pVAXl-L-hGM的構(gòu)建(1)引物設(shè)計(jì)根據(jù)Genbank公布的乙型肝炎病毒全包膜蛋白L基因序(GI:157091234)，參照其他adr亞型的基因序列，借助PremierPremier5.O軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增乙肝病毒全包膜蛋白L(HBV-L)基因的l對(duì)引物上游引物序列為PI5'-CAGCTAGCATAATGGGAGGTTGGTCT_3'含Nhel(GCTAGC)酶切位點(diǎn)和起始密碼子；下游引物序列為P25'-GGCGGAAGCTTAATGTATACCCAAAGAC-3';含HindIII(AAGCTT)酶切位點(diǎn)，并刪除終止密碼子；根據(jù)人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(hGM-CSF)基因的編碼序列，借助PremierPremier5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增hGM-CSF基因的1對(duì)引物上游引物序列為P35,-CCAAGCTTTCCGGTGGAGGTTCCATGTGGCTGCAGAGCC-3';含Hindlll(AAGCTT)酶切位點(diǎn)和含TCCGGTGGAGGTTCC的Linker序列；下游引物序列為P45'-CGGAATTCATTCACTCCTGGACTGGCTC-3';含EcoRI(GAATTC)酶切位點(diǎn)和終止密碼子。(2)重組質(zhì)粒pVL的構(gòu)建(如圖1和圖3所示)L基因擴(kuò)增模板取自乙肝表面抗原陽(yáng)性患者血清。血清抽提采用苯酚/氯仿抽提法。乙肝病毒DNA的提取具體步驟如下采集靜脈血，將100UL血清與蛋白酶K(PK)緩沖液1UL混勻，加人10ULpK(20mg/mL)，55。C過(guò)夜。與250UL飽和酚/氯仿(l:l)混勻，10000轉(zhuǎn)/min4。C離心5min，500UL冰乙醇沉淀15min，12000轉(zhuǎn)/min離心15min，20ULTE緩沖液(10ramol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(pH8.0)，1醒ol/L乙二胺四乙酸二鈉)溶解DNA后，一20。C保存以上述方法所得DNA提取液作為模板，用步驟(1)設(shè)計(jì)的引物Pl和P2進(jìn)行常規(guī)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)，擴(kuò)增獲得HBVL基因；常規(guī)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)具體步驟如下將混合液在94"C預(yù)變性5min，然后進(jìn)入下列循環(huán)94。C變性45s，55。C退火45s,72。C延伸lmin，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72'C再延伸lOmin，擴(kuò)增完畢后置4'C終止反應(yīng)；所述混合液組成如下濃度為lOumol/1的上游引物PI1u1濃度為lOumol/1的下游引物P21u1dATP、dTTP、dCTP、dGTP的濃度各為2.5mM的dNTP混合物4p1DNA提取液5iUEx耐熱性DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液(含Mg2+)5ii1Ex耐熱性DNA聚合酶0.25y1滅菌水33.75ul凝膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，(如圖5所示)將純化后的PCR產(chǎn)物HBVL基因和質(zhì)粒pVAXl分別用NheI和HindIII進(jìn)行雙酶切處理；酶切后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，用凝膠回收試劑盒純化回收酶切產(chǎn)物，利用T4DNA連接酶連接兩個(gè)回收片段，20h后，以CaC12法將其轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞T叩10，篩選鑒定陽(yáng)性克隆，進(jìn)行菌落PCR與酶切鑒定，從而獲得重組質(zhì)粒pVL。(2)重組質(zhì)粒pVAXl-L-hGM的構(gòu)建(如圖2和4所示)以質(zhì)粒pORF-hGMCSF作為模板，用步驟(1)設(shè)計(jì)的引物P3和P4進(jìn)行常規(guī)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)，擴(kuò)增獲得hGM-CSF基因。具體步驟如下將混合液在94。C預(yù)變性5min，然后進(jìn)入下列循環(huán)94。C變性30s，59。C退火30s，72"延伸45min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72匸再延伸10min，擴(kuò)增完畢后置4°C終止反應(yīng)；所述混合液組成如下濃度為lOumol/1的上游引物P31"1濃度為lOumol/1的下游引物P41u1dATP、dTTP、dCTP、dGTP的濃度各為2.5mM的dNTP混合物4u1pORF-hGMCSF1u1Ex耐熱性DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液(含Mg2+)5u1Ex耐熱性DNA聚合酶0.25u1滅菌水37.75u凝膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物(如圖5所示)，將純化的PCR產(chǎn)物hGM-CSF基因與步驟(2)所得重組質(zhì)粒pVL分別用HindIII和EcoRI雙酶切，酶切后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，用凝膠回收試劑盒純化回收酶切產(chǎn)物，利用T4DNA連接酶連接兩個(gè)回收片段，20h后，以CaC12法將其轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞Top10，篩選鑒定陽(yáng)性克隆，進(jìn)行菌落PCR與酶切鑒定，從而獲得重組質(zhì)粒pVAXl-L-hGM。感受態(tài)細(xì)胞的制備，重組質(zhì)粒篩選等方法參見(jiàn)《分子克隆》(Maniatis等，1989)。重組質(zhì)粒酶切鑒定如圖6所示。將篩選出的陽(yáng)性克隆產(chǎn)物的菌液進(jìn)行測(cè)序鑒定，測(cè)序采用Sanger雙脫氧鏈終止法，對(duì)插入序列的兩端進(jìn)行測(cè)定，測(cè)序工作由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。實(shí)施例2重組質(zhì)粒pVAXl-L-hGM轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞及體外表達(dá)鑒定(1)細(xì)胞轉(zhuǎn)染與觀察1)HEK293細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)染前1d，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用質(zhì)量體積比為0.25%的胰酶消化，制備成單細(xì)胞懸液，以每孔1X107ml接種6孔培養(yǎng)板，每孔加含體積百分比為20。/。胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基2ml，在37°C、體積百分比濃度為5%的0)2的飽和濕度培養(yǎng)箱中，細(xì)胞生長(zhǎng)至面積百分比為50%~60%。2)脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物制備A液為4ug去內(nèi)毒素的重組質(zhì)粒pVAXl-L-hGM稀釋于無(wú)血清OPTi-MEM培養(yǎng)基500u1，B液為L(zhǎng)ipofactamine200010u1稀釋于OPTi-MEM培養(yǎng)基500u1，輕輕混合AB液成脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物，室溫放置20min。3)轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備用2ml無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基漂洗3次。4)轉(zhuǎn)染:將脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物緩緩加入6孔培養(yǎng)板中，搖勻，37'C體積百分比濃度為5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中放置4h，加入體積百分比濃度為20%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，并置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(2)免疫組化檢測(cè)融合蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA48h后，吸出培養(yǎng)基，每孔細(xì)胞加入300ul質(zhì)量體積比濃度為4%的多聚甲醛，4'C固定過(guò)夜或37"C固定半小時(shí)，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗三次，每次5min。加過(guò)氧化物阻斷溶液(質(zhì)量體積比為3%的H202)孵育10min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，PBS洗三次，每次5min;再加稀釋后的一抗，4。C濕盒過(guò)夜；PBS沖洗三次，各5min;加生物素標(biāo)記的第二抗體，室溫孵育10min，PBS沖洗三次，各5min;加鏈親和素一過(guò)氧化酶溶液，室溫孵育10min;二氨基聯(lián)苯胺溶液(DAB)顯色，水洗終止，光鏡下觀察染色結(jié)果并拍照，如圖7所示。(3)免疫印記檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)1)細(xì)胞的裂解PBS預(yù)冷，冰上配細(xì)胞裂解緩沖液，倒掉培養(yǎng)基，將培養(yǎng)細(xì)胞在冰上用冰冷的PBS洗3次，甩凈；加0.7ml裂解緩沖液(含50mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(pH8.0)，150mmol/L氯化鈉，0.02%疊氮鈉，0.1%十二烷基磺酸鈉，100ug/ml異丙醇溶液，lug/ml抑肽酶，1%乙基苯基聚乙二醇，0.5%去氧膽酸鈉)，冰上放置20min隔一段時(shí)間搖一搖培養(yǎng)瓶；用細(xì)胞刮子將貼壁細(xì)胞刮離，移至1.5ml離心管中；12000Xg離心5min;取上清，-8(TC保存。2)蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳采用SDS-PAGE電泳，底層分離膠為8%(體積百分比)、上部積層膠為5%(體積百分比)；待測(cè)蛋白樣品與2XSDS加樣緩沖液按等體積混勻，100。C加熱3-5min。上樣，室溫下1XSDS電泳緩沖液中，開始電壓為130V，進(jìn)入分離膠后該為170V電泳至染料抵達(dá)分離膠底部，約lh(雙面兩個(gè)完全相同的SDS-PAGE電泳)。電泳完畢取下凝膠，在5倍體積的固定液中室溫緩慢搖動(dòng)2h，5倍體積的考馬斯亮藍(lán)染色液浸泡、室溫緩慢搖動(dòng)4h;50ml固定液沖洗、脫色液再緩慢搖動(dòng)至獲得藍(lán)色條帶及干凈的背景，期間換液3-4次；將脫色后的凝膠照像。3)蛋白印跡》去(Westernblotting)電泳后的另一凝膠置轉(zhuǎn)移緩沖液中室溫平衡30min;依次組裝轉(zhuǎn)印夾層海綿墊層、濾紙、凝膠、硝酸纖維素膜(NC膜)、濾紙、海綿墊層(NC膜和濾紙均與凝膠等大，并預(yù)先以轉(zhuǎn)移緩沖液濕潤(rùn))；排出所有氣泡；前后端用多孔有機(jī)玻璃板扣緊，在轉(zhuǎn)移緩沖液中冷卻條件下恒流350mA，電轉(zhuǎn)50min;轉(zhuǎn)印結(jié)束，取出轉(zhuǎn)印膜，膜上標(biāo)記定位；凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色以確定轉(zhuǎn)移效率；轉(zhuǎn)印膜置于平皿中，加lxPBST緩沖液，在水平搖床上緩慢搖動(dòng)lh;將NC膜浸入質(zhì)量體積比為5%的脫脂奶粉中，37'C于水平搖床緩和振蕩lh;lxPBST洗膜3次，每次10min;將NC膜封于雜交袋中，用MouseAnti-HBsAg單克隆抗體按照1:400的稀釋倍數(shù)用lxPBS稀釋，雜交袋中加入相應(yīng)的一抗稀釋液5ml，排盡袋中氣體，封口，水平搖床振蕩，4"C反應(yīng)過(guò)夜；將NC膜從雜交袋中小心取出，lxPBST(即將20mL滅菌磷酸鹽緩沖液中加入10uL0.05%吐溫20中)洗膜3次，每次10min;再將NC膜封于雜交袋中，用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠IgG二抗血清按照1:5000的稀釋倍數(shù)用lxPBS稀釋，雜交袋中加入相應(yīng)的二抗稀釋液5ml，排盡袋中氣體，封口，37。C水平搖床振蕩2-3h;取出NC膜，lxPBST洗膜3次，每次10min，用ECL試劑盒以發(fā)光法顯色，顯影l(fā)min，曝光5min;如圖8所示(4)ELISA法檢測(cè)hGM-CSF蛋白表達(dá)水平分別收集pVAXl和質(zhì)粒pVAXl-L-hGM轉(zhuǎn)染24h和48h的L-02細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)的上清液，采用ELISA雙抗體夾心法檢測(cè)hGM-CSF蛋白的表達(dá)量，按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。1)為了測(cè)定方便，把要使用的板條做好編碼，其他板條重新包裝好后放入冰箱以供將來(lái)使用；將200A標(biāo)準(zhǔn)緩沖液加入標(biāo)準(zhǔn)空白孔中；為測(cè)定色原體預(yù)留的空白孔保持空著。2)將標(biāo)準(zhǔn)樣品，萃取后的待測(cè)樣品以及對(duì)照樣品分別加入相應(yīng)的孔中(200叱/孔)。3)除色原體空白孔外，向其它每個(gè)孔中加入生物素化抗體工作液(50叱/孔)；輕敲板的側(cè)面使樣品混合均勻。封住板孔，并在室溫下孵育3小時(shí)。4)倒掉孔中的溶液，并徹底抽吸或傾倒孔中的殘留液，洗板4次。5)除色原體空白孔外，向其它每個(gè)孔中加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素(Str印tavidin-HRP)工作液(100叱/孔)。輕敲板的側(cè)面使樣品混合均勻。封住板孔，并在室溫下孵育30分鐘。6)倒掉孔中的溶液，并徹底抽吸或傾倒孔中的殘留液，洗板4次。7)加入顯色劑(IOOul/孔)?？字械囊后w將開始變藍(lán)。8)室溫下避光處孵育30分鐘。9)加入終止液(100ul/L)。輕敲板的側(cè)面使樣品混合均勻。溶液顏色由藍(lán)變黃。10)使用色原體空白孔(由顯色劑和終止液各IOO叱組成)作為參照，讀取每個(gè)孔在波長(zhǎng)為450nm處的吸光度。在加入終止液2小時(shí)之內(nèi)應(yīng)該讀取所有孔的吸光度值。11)在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)樣品相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)含量的吸光度曲線。將所有點(diǎn)連接成一條平滑曲線。12)從上述步驟ll)中繪出的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，讀出未知樣品和對(duì)照樣品的GM-CSF含量，結(jié)果如表l所示。表lELISA法檢測(cè)的hGM-CSF蛋白表達(dá)水平<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>實(shí)施例3酵母表達(dá)載體pPICZaC-L-GM的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化酵母菌(1)根據(jù)乙肝病毒包膜L基因和人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子hGM-CSF基因的編碼序列，借助PremierPremier5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增融合抗原基因L-linker-GM的1對(duì)引物上游引物序列為P55'CCGGAATTCATGGGAGGTTGGTCTTCC3，，含EcoRI酶切位點(diǎn)；下游引物序列為P65'CGGGGTACCATCTCCTGGACTGGCTC3'，含KpnI酶切位點(diǎn)；(2)以質(zhì)粒pVAX卜L-hGM為模板，用步驟(1)設(shè)計(jì)的引物P5和P6進(jìn)行常規(guī)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)擴(kuò)增L-linker-GM;具體步驟如下將混合液在95'C預(yù)變性5min,然后進(jìn)入下列循環(huán)95°C、45s,57°C、45s，72°C、1min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72'C延伸lOmin，擴(kuò)增完畢后置4。C終止反應(yīng)；所述混合液組成如下濃度為lOumol/1的上游引物P51u1濃度為10umol/l的下游引物P61u1dATP、dTTP、dCTP、dGTP的濃度各為2.5raM的dNTP混合物4u1pVAXl-L-hGM1u1Ex耐熱性DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液5u1Ex耐熱性DNA聚合酶0.25y1滅菌水37.75u1(3)pPICZaC-L-GM載體的構(gòu)建(如圖9和10所示)PCR產(chǎn)物上樣電泳分離，凝膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，將純化后的PCR產(chǎn)物和酵母表達(dá)載體pPICZaC分別用限制性內(nèi)切酶EcoRI和KpnI進(jìn)行雙酶切處理；酶切產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收試劑盒純化后，將兩純化的產(chǎn)物按照3:1的摩爾比混合，用T4DNA連接酶連接24h，以CaC12法將其轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞ToplO，涂布于含四環(huán)素和Zeocin雙抗的LB固體培養(yǎng)基中；次日，隨機(jī)挑取10個(gè)單菌落，分別接種于3niL含四環(huán)素和Zeocin的LB培養(yǎng)液中，37。C下150r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。將菌落PCR篩選呈陽(yáng)性的菌落用質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒DNA，將提取的質(zhì)粒DNA用EcoRI和KpnI雙酶切，進(jìn)行電泳檢測(cè)，以DL-1kbmarker為分子量參照(如圖11所示)，將篩選出的陽(yáng)性克隆產(chǎn)物的菌液進(jìn)行測(cè)序鑒定，測(cè)序采用Sanger雙脫氧鏈終止法，對(duì)插入序列的兩端進(jìn)行測(cè)定，測(cè)序工作由上海生物工程公司完成。(4)線性化重組質(zhì)粒的制備將步驟(3)測(cè)序正確的培養(yǎng)菌液，提取質(zhì)粒，取2025ugpPICZctC-L-GM重組質(zhì)粒用BglII酶線性化消化(如圖12所示)，酚、氯仿抽提，線性化的質(zhì)粒用lOix1超純水溶解，置冰上備用。(5)電轉(zhuǎn)化酵母菌取新鮮制備的(或一70。C凍存的)PichiapastorisGS115感受態(tài)細(xì)胞置于冰浴中，使其完全解凍；將100ul菌體移出至一新的無(wú)菌Eppendorf管中，加入5_20ng線性化質(zhì)粒(510u1)，輕彈混勻，盡數(shù)吸出轉(zhuǎn)移到0.2cm型的電穿孔轉(zhuǎn)化杯中；轉(zhuǎn)化杯置于冰浴中510分鐘，保持低溫；電穿孔轉(zhuǎn)化電擊條件電壓1500V;電阻400Q;電容25UF;脈沖時(shí)間10mS;一次電擊；電擊后，馬上在電擊轉(zhuǎn)化杯中加入lml4。C預(yù)冷的1M的山梨醇溶液，用微量移液槍吹打均勻，置于冰浴中；取30。C烘至表面半干的MD培養(yǎng)基平板，在超凈工作臺(tái)上無(wú)菌操作涂布平板，400ul/板。(6)PCR法篩選酵母菌上述YPD板3(TC保溫72h后，挑取15個(gè)菌落分別置于含5mlBMGY培養(yǎng)液(p朋.0)的50ml離心管中，于搖床30°C(225r/m)保溫30h。每個(gè)克隆收集發(fā)酵液lml，離心回收菌體，煮-凍-煮法提取酵母基因組DNA為模板做PCR鑒定。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。〈110〉〈120>〈130〉〈160〉〈170>〈210〉〈211〉〈212〉〈213〉〈400>atgggaggttcctctgggatcc卿ttgggggagcattcggctcagggcatcaggaagaccagtggaacttttcctgct.gatatcgtceiaggattcctagacaataccacacgtgtcctgccaatttgtcctgctgctattgtcctctaccctgctcaagtgcacttgtsttcagtccgtttcccccactgaacatcttgaaagctttccg序列表李君武乙肝病毒L基因與hGM-CSF的融合基因及其表達(dá)載體的構(gòu)建與應(yīng)用17Patentlnversion3.511660DNA人工序列1ggtcttccaaggcatggggacaaatctttctgttcccaat60tctttcccgatcaccagttggaccctgcgttcggagccaa120acttcaaccccaacaagg3tcactggccagaggca^atcaggtaggagcg180ggccagggttcacggaggtcttttggggtggagccctcag240agtgccagtagcccctcctcctgcctccaccaatcggcag300agcctactcccatctctccacctctaagagacagtcatcctcaggccatg360ccacaacattccaccaagctctgctagacccc卿gtgaggggcctatac420gtggctccagttccggaacagta犯ccctgttccgactactgcctcaccc■tcttctcgaggactggggaccctgcaccga540gacccctgctcgtgttacaggcggggUtttcttgttgacaagaatcctc600agagtctagactcgtggtggacttctctcaattttctagggggagcaccc660gccaaaattcgcagtccccaacctccaatcctcttgtcct720ctggctatcgttggatgtgtctgcggcgttttatcatattcctcttcatc780gcctcatcttcttgttggttcttctggact3CC^ggt3tgttgcccgtt840ttCC3gg33Catcaactaccagcacgggaccatgcaagacctgcacgatt■gaacctctatgtttccctcttgttgctgtaggacggaaac960ttcccatcccatcstcctgggctttcgcaagattcctatgggagtgggcc1020tctcctggctcaigtttactagtgccatttgttcagtggttcgtagggctt1080tttggctttcagttatatggatgatgtggtattgggggccaagtctgtac1140gtccctttttacctctattaccaattttcttttgtctttgggtatacatt1200gtggaggttccatgtggctgcagagcctgctgctcttgggcactgtggcc126022<image>imageseeoriginaldocumentpage23</image>〈213〉人工序列<400〉5cggaattcattcactcctggactggctc28〈210〉6〈211〉27〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>6ccggaattcatgggaggttggtcttcc27〈210〉7〈211〉26〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉7cggggtaccatctcctggactggctc2權(quán)利要求1、一種乙肝病毒全包膜L基因和人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子基因的融合基因，其特征在于其序列如SEQIDNO.1所述。2、一種包含了權(quán)利要求1所述乙肝病毒全包膜L基因和人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子基因的融合基因的真核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)方法，其特征在于包括以下步驟(1)引物設(shè)計(jì)根據(jù)乙肝病毒全包膜L基因的編碼序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增乙肝病毒全包膜L基因的l對(duì)引物上游引物序列為PI5'-CAGCTAGCATAATGGGAGGTTGGTCT-3'，含NheI酶切位點(diǎn)和起始密碼子；下游引物序列為P25'-GGCGGAAGCTTAATGTATACCCAAAGAC-3'，含HindIII酶切位點(diǎn)，并刪除終止密碼子；根據(jù)人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子基因的編碼序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子基因的1對(duì)引物上游引物序列為P35,-CCAAGCTTTCCGGTGGAGGTTCCATGTGGCTGCAGAGCC-3'，含HindIII酶切位點(diǎn)和含TCCGGTGGAGGTTCC的Linker序列；下游引物序列為P45'-CGGAATTCATTCACTCCTGGACTGGCTC-3'，含EcoRI酶切位點(diǎn)和終止密碼子；(2)L基因的克隆與重組pVL質(zhì)粒的構(gòu)建將乙肝表面抗原陽(yáng)性患者血清采用苯酚/氯仿抽提法獲得DNA提取液，作為L(zhǎng)基因擴(kuò)增模板，用步驟(1)設(shè)計(jì)的引物P1和P2進(jìn)行常規(guī)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)，擴(kuò)增出乙肝病毒全包膜L基因片段，將純化后的乙肝病毒全包膜L基因片段和質(zhì)粒pVAXl分別用Nhel和HindlII進(jìn)行雙酶切，純化、連接、轉(zhuǎn)化獲得重組質(zhì)粒pVL;(3)重組質(zhì)粒pVAX1-L-hGM的構(gòu)建以質(zhì)粒pORF-hGMCSF作為模板，用步驟(1)設(shè)計(jì)的引物P3和P4進(jìn)行常規(guī)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)，擴(kuò)增獲得人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子基因；將純化的人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子基因與步驟(2)所得重組質(zhì)粒pVL分別用HindIII和EcoRI雙酶切，純化、連接、轉(zhuǎn)化獲得重組質(zhì)粒pVAXl-L-hGM;(4)重組質(zhì)粒pVAXl-L-hGM轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞及體外表達(dá)鑒定將酶切和測(cè)序鑒定正確的步驟(3)所得重組質(zhì)粒pVAXl-L-hGM轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，并通過(guò)免疫組織化學(xué)法和蛋白印跡法檢測(cè)融合基因的表達(dá)蛋白質(zhì)。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述真核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)方法，其特征在于步驟(2)所述常規(guī)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)具體步驟如下將混合液在94'C預(yù)變性5min，然后進(jìn)入下列循環(huán)94°C、45s，55。C、45s，72°C、lmin，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72'C延伸10min，擴(kuò)增完畢后置4"C終止反應(yīng)；所述混合液組成如下濃度為10咖o1/1的上游引物Pl1"1濃度為lOumol/1的下游引物P21lUdATP、dTTP、dCTP、dGTP的濃度各為2.5mM的dNTP混合物4u1DNA提取液5u1含Mg"的Ex耐熱性DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液5p1Ex耐熱性DNA聚合酶0.25til滅菌水33.75u14、根據(jù)權(quán)利要求2所述真核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)方法，其特征在于歩驟(3)所述常規(guī)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)具體步驟如下將混合液在94'C預(yù)變性5min，然后進(jìn)入下列循環(huán)94°C、30s，59。C、30s，72°C、45s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸10min，擴(kuò)增完畢后置4。C終止反應(yīng)；所述混合液組成如下濃度為10umo1/1的上游引物P31y1濃度為10umo1/1的下游引物P41u1dATP、dTTP、dCTP、dGTP的濃度各為2.5mM的dNTP混合物4u1質(zhì)粒pORF-hGMCSF1u1含Mg"的Ex耐熱性DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液5"1Ex耐熱性DNA聚合酶0.25u1滅菌水37.75u15、根據(jù)權(quán)利要求2所述方法構(gòu)建的真核表達(dá)載體作為制備乙肝疫苗的用途。6、根據(jù)權(quán)利要求2所述方法表達(dá)的融合基因的表達(dá)蛋白質(zhì)作為制備乙肝疫苗的用途。7、一種包含了權(quán)利要求1所述乙肝病毒全包膜L基因和人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子基因的融合基因的酵母表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化方法，其特征在于包括以下步驟(a)根據(jù)乙肝病毒全包膜L基因和人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子基因的編碼序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增融合基因L-linker-GM的1對(duì)引物上游引物序列為P55，-CCGGAATTCATGGGAGGTTGGTCTTCC-3，，含EcoRI酶切位點(diǎn)；下游引物序列為P65'-CGGGGTACCATCTCCTGGACTGGCTC-3'，含KpnI酶切位點(diǎn)；(b)以質(zhì)粒pVAXl-L-hGM為模板，用步驟(a)設(shè)計(jì)的引物P5和P6進(jìn)行常規(guī)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)擴(kuò)增L-linker-GM;(c)pPICZaC-L-GM酵母表達(dá)載體的構(gòu)建將酵母表達(dá)載體PPICZaC和步驟(b)所得L-linker-GM分別用限制性內(nèi)切酶EcoRl和Kpnl進(jìn)行雙酶切處理，純化、連接、轉(zhuǎn)化獲得pPICZaC-L-GM酵母表達(dá)載體；(d)pPICZaC-L-GM酵母表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化取2025Pg步驟(c)所得pPICZaC-L-GM酵母表達(dá)載體用BglII酶線性化消化，用苯酚、氯仿抽提，用10ul超純水溶解，得到線性化重組質(zhì)粒；將上述線性化重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌GS155,用PCR法篩選酵母菌。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述酵母表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)方法，其特征在于步驟(b)所述常規(guī)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)具體步驟如下將混合液在95。C預(yù)變性5min，然后進(jìn)入下列循環(huán)95°C、45s，57。C、45s，72°C、lmin，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72'C延伸lOmin，擴(kuò)增完畢后置4t:終止反應(yīng)；所述混合液組成如下濃度為10umol/l的上游引物P51u1濃度為lOumol/1的下游引物P61u1dATP、dTTP、dCTP、dGTP的濃度各為2.5mM的dNTP混合物4u1質(zhì)粒pVAXl-L-hGM1u1Ex耐熱性DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液5ii1Ex耐熱性DNA聚合酶0.25li1滅菌水37.75ul9、根據(jù)權(quán)利要求7所述方法構(gòu)建的酵母表達(dá)載體作為制備乙肝疫苗的用途。全文摘要本發(fā)明公開了一種乙型肝炎病毒全包膜蛋白L基因與hGM-CSF基因的融合基因及其表達(dá)載體的構(gòu)建與應(yīng)用。該融合基因的真核表達(dá)載體pVAX1-L-hGM的構(gòu)建和表達(dá)設(shè)計(jì)擴(kuò)增乙肝病毒全包膜蛋白L基因的1對(duì)引物和擴(kuò)增hGM-CSF基因的1對(duì)引物；重組質(zhì)粒pVL的構(gòu)建；重組質(zhì)粒pVAX1-L-hGM的構(gòu)建；重組質(zhì)粒pVAX1-L-hGM轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞及體外表達(dá)鑒定。該融合基因的酵母表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化設(shè)計(jì)擴(kuò)增融合抗原基因L-linker-GM的1對(duì)引物；以質(zhì)粒PVAX1-L-GM為模板擴(kuò)增L-linker-GM；pPICZαC-L-GM酵母表達(dá)載體的構(gòu)建；pPICZαC-L-GM酵母表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化。文檔編號(hào)A61K39/39GK101509008SQ20091003775公開日2009年8月19日申請(qǐng)日期2009年3月11日優(yōu)先權(quán)日2009年3月11日發(fā)明者李君武申請(qǐng)人:李君武