專利名稱：一種定量檢測(cè)TRECs和KRECs基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒以及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于體外核酸診斷領(lǐng)域，涉及一種定量檢測(cè)游離T細(xì)胞受體切除環(huán)(T-cell receptor excision circles, TRECs)和 κ -刪除重組切除環(huán)(κ-deletingrecombinatio n excision circles, KRECs)基因的實(shí)時(shí)突光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
原發(fā)性免疫缺陷病(PrimaryImmunodeficiency Disease, PID)是因免疫系統(tǒng)遺傳缺陷或先天發(fā)育不全造成免疫功能障礙所致的免疫缺陷病，其總發(fā)病率為:美國1/10000，澳大利亞2.82/100000人，日本和瑞典1/5000人，我國香港地區(qū)1/8000人。國內(nèi)缺乏全面的統(tǒng)計(jì)資料，如果按照1/10000的發(fā)病率，我國每年出生的2500萬個(gè)新生兒中有2500個(gè)新發(fā)的PID病例，整個(gè)兒童期累計(jì)患者達(dá)到3萬-6萬例。原發(fā)性免疫缺陷病，與遺傳相關(guān)，常發(fā)生在嬰幼兒，可出現(xiàn)反復(fù)感染，嚴(yán)重的可威脅生命。因其中有些可能獲得有效的治療，因此及時(shí)診斷仍很重要。2001年11月，美國疾病控制和預(yù)防中心(Centers for DiseaseControland Prevention,⑶C)在喬治亞洲首府亞特蘭大召開專題研討會(huì)，建立針對(duì)新生兒篩查(Newborn Screening, NBS)實(shí)驗(yàn)和早期識(shí)別PID的方案，以便能早期診斷和治療PID患者。2009年美國⑶C在美國維斯康星州進(jìn)行重癥聯(lián)合免疫缺陷(SevereCombinedImmunodefieieney Disease, SCID)新生兒篩查。按免疫缺陷性質(zhì)的不同，原發(fā)性免疫缺陷病可分為體液免疫缺陷為主(即抗體缺乏為主的免疫缺陷)、細(xì)胞免疫缺陷為主以及兩者兼有的聯(lián)合性免疫缺陷三大類。此外，補(bǔ)體缺陷、吞噬細(xì)胞缺陷等非特異性免疫缺陷也屬于本組。重癥聯(lián)合免疫缺陷病是以T淋巴細(xì)胞缺乏或功能異常，伴或不伴有B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞數(shù)量減少或功能缺陷為特征的一組疾病，新生兒發(fā)病率大約在1/50000至1/100000，該病發(fā)病年齡早，臨床表現(xiàn)重，預(yù)后較差，如果沒有得到及時(shí)的診斷和治療，多在2歲內(nèi)死亡。SCID是一種嚴(yán)重的聯(lián)合免疫缺陷，患兒如果不進(jìn)行有效的免疫重建，往往在嬰兒期死亡，免疫重建的時(shí)間與預(yù)后的關(guān)系密切，如果在出生3個(gè)月內(nèi)進(jìn)行造血干細(xì)胞移植存活率接近95%，而3個(gè)月后進(jìn)行造血干細(xì)胞移植存活率降至76%，因此將SCID納入新生兒篩查非常必要。目前SCID主要分為T-B+SCID和T-B-SCID兩大類，其中T-B+SCID的致病原因有Y c基因缺陷、Janus Kinase 3( JAK3)基因缺陷、IL-7R α基因缺陷、CD45基因缺陷、CD3 δ /CD3 ε /CD3 ζ基因缺陷；T_B_SCID的致病原因有RAG1/2基因缺陷、DCLREIC基因缺陷、ADA基因缺陷、DNA PKcs基因缺陷、網(wǎng)狀組織發(fā)育不全。除此以外，SCID還包括Oemnn綜合征、DNA連接酶V1、Cemunnos/XLF缺陷、CD40配體缺陷、CD40缺陷、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)缺陷、CD3Y缺陷、CD8缺陷、ZAP-70缺陷、MHC I類分子缺陷、MHC II類分子缺陷、鈣離子通道缺陷等。導(dǎo)致SCID的原因繁多，診斷非常困難，但是所有SCID的共同特征是成熟T細(xì)胞的數(shù)量顯著降低。T細(xì)胞在胸腺中分化的過程是發(fā)生在T細(xì)胞受體基因的重排的時(shí)候，最終是V、D和J基因片段的結(jié)合；在每個(gè)V、D和J基因片段重排的過程中，都會(huì)有被切除的環(huán)狀DNA產(chǎn)物，被切割下來的DNA形成游離T細(xì)胞受體切除環(huán)(T-cell receptor excision circles,TRECs)，70%表達(dá)α β TCRs的T細(xì)胞在成熟晚期都產(chǎn)生5Rec-<pJa TREC。TRECs在T細(xì)胞中非常穩(wěn)定，并不隨著細(xì)胞的增殖而增加，而是不斷被稀釋，新生兒TRECs的水平最高，但在出生后5年TRECs的水平明顯降低。利用定量PCR檢測(cè)SRec-Vja TRECs可以反映外周血最新產(chǎn)生的T淋巴細(xì)胞數(shù)量，病人T細(xì)胞中TRECs缺乏或不同程度的減少，可以作為SCID的篩查方法，篩查出T細(xì)胞成熟缺陷的新生兒，有利于早診斷早治療，減少新生兒死亡。抗體缺乏為主的免疫缺陷病屬于細(xì)胞免疫缺陷類，是由于B細(xì)胞早期發(fā)育障礙引起的一組原發(fā)性免疫缺陷癥，由于體液免疫缺陷，容易反復(fù)發(fā)生細(xì)菌感染，表現(xiàn)為B細(xì)胞和免疫球蛋白不同程度的減少，是發(fā)病率最高的原發(fā)性免疫缺陷病。目前分為以下幾類:1)嚴(yán)重低丙種球蛋白血癥，致病原因有BTK基因缺陷、μ鏈缺乏、λ 5鏈缺乏、Ig a缺乏、Ig β缺乏、B細(xì)胞連接蛋白(BLNK)缺乏、骨髓發(fā)育不良等，其中X連鎖無丙種球蛋白血癥(XLA)是最常見的體液免疫缺陷癥，其病因是Bruton酪氨酸激酶(Bruton’s Tyrosine Kinase,BTK)缺陷，表現(xiàn)為B細(xì)胞和免疫球蛋白顯著低下；2)血清IgG和IgA的重度減少伴B細(xì)胞正常、減少或顯著減少，致病原因有普通變異型免疫缺陷病(Common Variable ImmunodeficiencyDisease, CVID)、可誘導(dǎo)共刺激分子(Inducible Co-Stimulator, IC0S)缺陷、CD19 缺陷、X連鎖淋巴組織增殖綜合癥(X-linked Lymph Proliferative Disease,XLP);3)血清 IgG 和IgA的重度減少，IgM正?；蛟龈?即高IgM綜合癥)，致病原因有⑶40配體缺陷、⑶40缺陷、活化誘導(dǎo)胞唳脫氨 基酶(Activation-1nduced Cytidine Deaminase, AICDA)缺陷、尿卩密唳N-糖基化酶(Uracil-N-Glycosylase，UNG)缺陷；4)同種型或輕鏈缺乏，致病原因有Ig重鏈缺乏、κ鏈缺乏、選擇性IgG亞類缺陷、選擇性IgA缺陷等?？贵w缺乏為主的免疫缺陷病病因繁多，診斷非常困難，但共同特征是B淋巴細(xì)胞缺乏或不同程度的減少。在B細(xì)胞成熟過程中，免疫球蛋白的λ鏈發(fā)生的基因重排時(shí)形成的κ -刪除重組切除環(huán)(κ -deleting recombination excision circles, KRECs), KRECs 也不隨著細(xì)胞的增殖而增加，而是不斷被稀釋。因?yàn)榭贵w缺乏為主的免疫缺陷病中的B細(xì)胞成熟缺陷發(fā)生在κ -刪除重組前，病人B細(xì)胞中KRECs缺乏或不同程度的減少，利用定量PCR法檢測(cè)KRECs可以作為抗體缺乏為主的免疫缺陷病的新生兒篩查方法，因此通過對(duì)KRECs的定量測(cè)定可以篩查出患有B細(xì)胞成熟缺陷的新生兒。聯(lián)合篩查新生兒原發(fā)性T細(xì)胞及B細(xì)胞免疫缺陷，能夠檢測(cè)新生兒T細(xì)胞和B細(xì)胞水平，不僅可以篩查SCID及抗體缺陷為主的免疫缺陷病，而且能夠?yàn)槠渌cT細(xì)胞和B細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的原發(fā)性免疫缺陷病或其他系統(tǒng)疾病提供臨床相關(guān)指征，有利于早期診斷及治療。但是，目前還缺乏可以聯(lián)合定量檢測(cè)TRECs和KRECs的方法和試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供一種通過定量檢測(cè)TRECs和KRECs基因的拷貝數(shù)，用來篩查新生兒原發(fā)性T細(xì)胞和B細(xì)胞免疫缺陷的實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒適用于目前存在市場(chǎng)上的所有類型的熒光定量基因擴(kuò)增儀。本發(fā)明能夠檢測(cè)新生兒T細(xì)胞和B細(xì)胞的水平，判斷新生兒免疫系統(tǒng)功能正常與否，在臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供了篩查新生兒T細(xì)胞和B細(xì)胞免疫缺陷中的應(yīng)用，上述試劑盒所需的樣本獲取、儲(chǔ)存方便，靈敏度和特異性高，檢測(cè)方法簡便、快速，實(shí)驗(yàn)
結(jié)果可靠。為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明提供:一種定量檢測(cè)TRECs和KRECs基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒其中包括DNA提取液、巢式PCR反應(yīng)液、包含TRECs基因插入序列的標(biāo)準(zhǔn)品1、包含KRECs基因插入序列的標(biāo)準(zhǔn)品I1、包含β _actin基因插入序列的標(biāo)準(zhǔn)品II1、陰性對(duì)照品、空白對(duì)照品、包含TRECs基因的實(shí)時(shí)熒光引物和探針的熒光PCR反應(yīng)液1、包含KRECs基因的實(shí)時(shí)熒光引物和探針的熒光PCR反應(yīng)液II和包含β -actin基因的實(shí)時(shí)熒光引物和探針的熒光PCR反應(yīng)液 III。在本發(fā)明的一個(gè)方案中，巢式PCR反應(yīng)液是由TRECs、KRECs和β-Actin的PCR正向引物、反向引物，2Xtaq PCR MasterMix，lmMMgC12和無菌的超純水組成。在本發(fā)明的一個(gè)具體方案中，TRECs基因的巢式PCR正向引物(SEQ NO:1)為5’ -GAGGGCAGCCCTCTCCAAGGCAAAATGG-3’，反向引物(SEQ NO:2)為 5’ -TGATCTTGTCTGACATTTGCTCCGTGGT-3’。KRECs 基因的巢式 PCR 正向引物(SEQN0:3)為 5，-GCTCAGCGCCCATTACGTTTCTG-3’，反向引物(SEQN0:4)為 5，-CTGTGAGGGACACGCAGCCTG-3，。β -actin 基因的巢式 PCR正向引物(SEQ NO:5)為 5’ -CTCATTTCCCTCTCAGGCATGG-3，，反向引物(SEQ NO:6)為5’ -CCACGTCACACTTCA TGATGGA-3’。在本發(fā)明的一個(gè)方案中，熒光PCR反應(yīng)液I是由TRECs熒光PCR引物和探針、2.5Xreal time Mix、牛血清白蛋白(BSA)、20xPCR Enhancer和無菌的超純水組成。在本發(fā)明的一個(gè)具體方案中，TRECs基因的熒光PCR正向引物(SEQ NO: 7)為5’ -TGAGAACGGTGAATGAAGAGC-3’，反向引物(SEQ NO:8)為 5’ -CCATGCTGACACCTCTGG-3’ 和探針(SEQ NO:9)為 FAM-ACGGTGATGCATAGGCACCTGCACC-TRAMA。在本發(fā)明的一個(gè)方案中，熒光PCR反應(yīng)液II是由KRECs熒光PCR引物和探針、2.5 Xreal time Mix、BSA、20xPCR Enhancer和無菌的超純水組成。在本發(fā)明的一個(gè)具體方案中，KRECs 基因的熒光 PCR 正向引物(SEQ NO: 10)為 5’-GTGGCATTATTTGTATCACTGTGC-3’，反向引物(SEQ NO: 11)為 5’-CAGCTCTTACCCTAGAGTTTCTGC-3’和探針(SEQ NO: 12)為 VIC-CACGGGAGCAGGTTGGCAGCGC-TRAMA。在本發(fā)明的一個(gè)方案中，熒光PCR反應(yīng)液III是由β-Actin熒光PCR引物和探針、2.5 Xreal time Mix、BSA、20xPCR Enhancer和無菌的超純水組成。在本發(fā)明的一個(gè)具體方案中，β-actin基因的熒光PCR正向引物(SEQ NO: 13)為 5’-CTCATTTCCCTCTCAGGCATGG-3’，反向引物(SEQ NO:14)為 5’ -CCACGTCACACTTCATGATGGA-3，和探針(SEQN0:15)為VIC-CTGTGGCATCCACGAAACT-TRAMA。在本發(fā)明的一個(gè)方案中，熒光PCR反應(yīng)液1、熒光PCR反應(yīng)液II和熒光PCR反應(yīng)液III中所述的TRECs、KRECs和β -actin基因的特異性探針均為Taqman探針，標(biāo)記探針5’端的為一種熒光報(bào)告基團(tuán)，是FAM、VIC、TET、JOE、ROX、CY3、CY5、HEX中的一種；3’端為熒光淬滅基團(tuán)，是TAMRA、DABCYL、NFQ中的一種。在本發(fā)明的反應(yīng)體系中，可以使用一個(gè)或者多個(gè)熒光探針，所標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)可以為一種或者兩種。在本發(fā)明的一個(gè)具體方案中，TRECs標(biāo)記探針5’端為FAM探針，3’端為TAMRA探針；KRECs標(biāo)記探針5’端為VIC探針，3’端為TAMRA探針；β -Actin標(biāo)記探針5’端為VIC探針，3’端為TAMRA探針。在本發(fā)明的一個(gè)方案中，標(biāo)準(zhǔn)品I是含有插入TRECs基因131個(gè)核苷酸片段連接入PUC57載體質(zhì)粒。在本發(fā)明的一個(gè)具體方案中，所述的TRECs基因的插入序列(SEQNO:16)為 5’ -TCGTGAGAACGGTGAATGAAGAGCAGACAGGGCCCGTGCCAGCTGCAGGGTTTAGGCACGGGGTGCAGGTGCCTATGCATCACCGTGCACAGGAGTGGGCACCTTTACAAMACCAGAGGTGTCAGCATGG-3，。標(biāo)準(zhǔn)品 I用分光光度計(jì)測(cè)A26tl定量，存放濃度為1.0Χ IO8拷貝/ul、1.0 X IO7拷貝/ul、1.0 X IO6拷貝/ul、1.0X105 拷貝 /ul、1.0X104 拷貝 /ul、1.0X103 拷貝 /ul 6 個(gè)濃度梯度。在本發(fā)明的一個(gè)方案中，標(biāo)準(zhǔn)品II是含有插入KRECs基因89個(gè)核苷酸片段連接入PUC57載體質(zhì)粒。在本發(fā)明的一個(gè)具體方案中，所述的KRECs基因的插入序列(SEQ NO: 17)為 5，-TCCCTTAGTGGCATTATTTGTATCACTGTGCACAGTGTGCGCTGCCAACCTGCTCCCGTGCAGAAACTCTAGGGTAAGAGCTGGCTCCT-3’。標(biāo)準(zhǔn)品II用分光光度計(jì)測(cè)A26tl定量，存放濃度為1.0X IO8拷貝/ul、1.0X107 拷貝 /ul、l.0XlO6 拷貝 /ul、l.0X IO5 拷貝 /ul、l.0X IO4 拷貝 /ul、1.0X103拷貝/ul 6個(gè)濃度梯度。在本發(fā)明的一個(gè)方案中，標(biāo)準(zhǔn)品熒光PCR反應(yīng)液III是含有插入β -actin基因70個(gè)核苷酸片段連接入PUC57載體質(zhì)粒。在本發(fā)明的一個(gè)具體方案中，所述的β-actin基因的插入序列(SEQ NO: 18)為:5’-ATTTCCCTCTCAGGCATGGAGTCCTGTGGCATCCACGAAACTACCTTCAACTCCATCATGAAGTGTGACG-3’。標(biāo)準(zhǔn)品III用分光光度計(jì)測(cè)A260定量，存放濃度為1.0X IO8拷貝 /ul、l.0XlO7 拷貝 /ul、l.0XlO6 拷貝 /ul、l.0XlO5 拷貝 /ul、l.0XlO4 拷貝 /ul、
1.0X IO3拷貝/ul 6個(gè)濃度梯度。在本發(fā)明的一個(gè)方案中，陰性對(duì)照品為TRECs、KRECs和β -actin重組質(zhì)粒，其濃度為5.0X IO5拷貝/ul。
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在本發(fā)明的一個(gè)方案中，空白對(duì)照品為無菌的超純水。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，還提供了一種定量檢測(cè)TRECs和KRECs基因的拷貝數(shù)，在篩查新生兒T細(xì)胞核B細(xì)胞免疫缺陷中的應(yīng)用，實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒對(duì)新生兒T細(xì)胞和B細(xì)胞免疫缺陷的檢測(cè)方法，該方法包括下列步驟:I)用DNA提取液對(duì)干血濾紙片DNA進(jìn)行提取:2)將標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品加入巢式PCR反應(yīng)液，用PCR檢測(cè)儀對(duì)TRECs、KRECs和β-actin基因進(jìn)行擴(kuò)增；3)將擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物加入實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系，用熒光定量檢測(cè)儀檢測(cè)進(jìn)行PCR檢測(cè)；4)通過比較待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品的起始TRECs、KRECs 和 β -actin 基因拷貝數(shù)。在提取的DNA量足夠時(shí)，也可不經(jīng)過巢式PCR反應(yīng)體系，直接加入實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系中去。本發(fā)明的有益效果:I)樣本獲取、儲(chǔ)存方便。本發(fā)明對(duì)新生兒干血濾紙片僅取3mm直徑的紙片提取DNA即可完成該項(xiàng)目的檢測(cè)，干血濾紙片為新生兒常規(guī)獲得，并且用血量很少，減少新生兒抽取的血量，同時(shí)干血濾紙片有利于長期保存，大大降低了樣本的獲得、儲(chǔ)存及運(yùn)輸?shù)葐栴}的出現(xiàn)。2)靈敏度和特異性高。采取特異性引物、探針及巢式PCR，并對(duì)樣本提取的DNA進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增18個(gè)循環(huán)，有效的提高了檢測(cè)基因的拷貝數(shù)，提高了對(duì)樣本檢測(cè)的靈敏性，而陽性樣本中的TRECs和KRECs幾乎沒有，使得樣本檢測(cè)結(jié)果的陰性與陽性很容易進(jìn)行判定。3)檢測(cè)方法簡單，檢測(cè)速度快，結(jié)果以拷貝數(shù)表示，定量結(jié)果準(zhǔn)確可靠。有利于在醫(yī)院及實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用。4)通過選擇樣本自身的管家基因β-actin作為內(nèi)參，若擴(kuò)增的內(nèi)參的拷貝數(shù)在正常范圍內(nèi)，TRECs和KRECs的拷貝數(shù)非常低，則陽性結(jié)果可靠，否則需重新測(cè)定，因此能更有效地減少假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，從而保證數(shù)據(jù)的可靠性。總之，本發(fā)明靈敏度高，特異性好，檢測(cè)方法簡單快速，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。本發(fā)明填補(bǔ)了原發(fā)性免疫缺陷病的普查及新生兒篩查的空白，不僅可以篩查SCID及抗體缺陷為主的免疫缺陷病，而且能夠?yàn)槠渌cT細(xì)胞和B細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的原發(fā)性免疫缺陷病或其他系統(tǒng)疾病提供臨床相關(guān)指征，有利于早期斷及治療。


圖1.TRECs標(biāo)準(zhǔn)品real time PCR擴(kuò)增曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖2.KRECs標(biāo)準(zhǔn)品real time PCR擴(kuò)增曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖3.β-actin標(biāo)準(zhǔn)品real time PCR擴(kuò)增曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖4.正常兒童DNA樣本的real time PCR TRECs的擴(kuò)增曲線。圖5.SCID陽性兒童DNA樣本的real time PCR TRECs的擴(kuò)增曲線。圖6.正常兒童DNA樣本的real time PCR KRECs的擴(kuò)增曲線。圖7.XLA陽性兒童DNA樣本的real time PCR KRECs的擴(kuò)增曲線。圖8.空白對(duì)照品的擴(kuò)增曲線。圖9.正常兒童DNA樣本的real time PCR β-actin的擴(kuò)增曲線。圖10.SCID和XLA陽性兒童DNA樣本的real time PCR β-actin的擴(kuò)增曲線。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍，下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件和方法，通常按照常規(guī)條件如:精編分子生物學(xué)指南，F(xiàn).M.奧斯柏等主編，科學(xué)出版社，1995，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版);D.L.斯佩克特等，科學(xué)出版社，2001，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南；呂鴻聲，科學(xué)出版社，1982，或接照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1:試劑盒的制備1.引物與探針的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)UCSC 網(wǎng)站上 UCSC Human Gene Sorter 查詢 TRECs、KRECs 和 β -actin 基因序列(http://genome, ucsc.edu/cg1-bin/hgNear),利用 Primer3.0 在 TRECs、KRECs和β -actin基因上設(shè)計(jì)巢式PCR的上下游引物和熒光定量PCR上下游引物和探針，其中TRECs、KRECs和β -actin的巢式PCR上游引物與其基因的結(jié)合位置在其實(shí)時(shí)熒光定量PCR上游引物與該基因結(jié)合位置的上游，TRECs、KRECs和β -actin的巢式PCR下游引物與其基因的結(jié)合位置在其實(shí)時(shí)熒光定量PCR下游引物與該基因結(jié)合位置的下游。所選引物對(duì)于基因的結(jié)合有很好的特異性，有較高的PCR擴(kuò)增效率。引物與探針均委托Life Technologies公司進(jìn)行合成，其中引物為PAGE純化，探針為HPLC純化。TRECs的探針5’端標(biāo)記為FAM熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記為TAMRA熒光基團(tuán)；KRECs的探針5’端標(biāo)記為VIC熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記為TAMRA熒光基團(tuán)；β -actin的探針5’端標(biāo)記為VIC熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記為TAMRA熒光基團(tuán)。引物序列如表I。表I插入基因、特異性引物以及探針序列
權(quán)利要求
1.一種定量檢測(cè)TRECs和KRECs基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，其中包括DNA提取液、巢式PCR反應(yīng)液、包含TRECs基因插入序列的標(biāo)準(zhǔn)品1、包含KRECs基因插入序列的標(biāo)準(zhǔn)品I1、包含β-actin基因插入序列的標(biāo)準(zhǔn)品II1、包含TRECs基因的實(shí)時(shí)熒光引物和探針的熒光PCR反應(yīng)液1、包含KRECs基因的實(shí)時(shí)熒光引物和探針的熒光PCR反應(yīng)液II和包含β -actin基因的實(shí)時(shí)熒光引物和探針的熒光PCR反應(yīng)液III。
2.權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述的巢式PCR反應(yīng)液包括: 1)巢式PCR擴(kuò)增TRECs基因的正向引物，其堿基序列如SEQNO:1所示； 2)巢式PCR擴(kuò)增TRECs基因的反向引物，其堿基序列如SEQNO:2所示； 3)巢式PCR擴(kuò)增KRECs基因的正向引物，其堿基序列如SEQNO:3所示； 4)巢式PCR擴(kuò)增KRECs基因的反向引物，其堿基序列如SEQNO:4所示； 5)巢式PCR擴(kuò)增β-actin基因的正向引物，其堿基序列如SEQN0:5所示； 6)巢式PCR擴(kuò)增β-actin基因的反向引物，其堿基序列如SEQNO:6所示。
3.權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述的熒光PCR反應(yīng)液I包括: O實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)TRECs基因的正向引物，其堿基序列如SEQ NO: 7所示； 2)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)TRECs基因的反向引物，其堿基序列如SEQNO:8所示； 3)用于檢測(cè)TRECs基因的探針，其堿基序列如SEQNO:9所示； 其中所述的熒光PCR反應(yīng)液II包括: O實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)KRECs基因的正向引物，其堿基序列如SEQN0:10所示； 2)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)KRECs基因的反向引物，其堿基序列如SEQN0:11所示； 3)用于檢測(cè)KRECs基因的探針，其堿基序列如SEQNO: 12所示； 其中所述的熒光PCR反應(yīng)液III包括: O實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)β-actin基因的正向引物，其堿基序列如SEQNO: 13所示； 2)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)β-actin基因的反向引物，其堿基序列如SEQN0:14所示； 3)用于檢測(cè)β-actin基因的探針，其堿基序列如SEQNO: 15所示。
4.權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述的標(biāo)準(zhǔn)品I，其堿基序列如SEQNO: 16所示；其中所述的標(biāo)準(zhǔn)品II，其喊基序列如SEQ NO: 17所不；其中所述的標(biāo)準(zhǔn)品III,其喊基序列如SEQ NO: 18 所示。
5.權(quán)利要求1至4所述的試劑盒，所述的特異性熒光探針為Taqman探針，標(biāo)記探針5’端的為一種熒光發(fā)光基團(tuán)，是FAM、VIC、TET、J0E、R0X、CY3、CY5、HEX中的一種；標(biāo)記探針3’端的為一種熒光淬滅基團(tuán)，是TAMRA、DABCYL, NFQ中的一種。
6.權(quán)利要求1至4所述的試劑盒，所述的Taqman探針5’端標(biāo)記FAM或者VIC，3’端標(biāo)記 TAMRA。
7.權(quán)利要求1至6所述的試劑盒在新生兒T細(xì)胞及B細(xì)胞免疫缺陷檢測(cè)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于定量檢測(cè)TRECs和KRECs基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用。本發(fā)明包括一個(gè)以巢式PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的PCR反應(yīng)體系和以實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的實(shí)時(shí)熒光定量(Realtime)PCR反應(yīng)體系。其中巢式PCR反應(yīng)體系包括針對(duì)TRECs、KRECs和β-actin基因的正、反向引物；熒光PCR反應(yīng)體系包括針對(duì)TRECs、KRECs和β-actin基因的正、反向引物和特異性熒光探針。該試劑盒可以快速地聯(lián)合篩查新生兒免疫系統(tǒng)T細(xì)胞水平和B細(xì)胞水平，具有高靈敏度和穩(wěn)定性，以及非常好的重現(xiàn)性，此方法適用于TRECs和KRECs的聯(lián)合定量檢測(cè)，能應(yīng)用于新生兒免疫系統(tǒng)功能篩查，具有實(shí)際的臨床應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)G01N21/64GK103173533SQ20121047071
公開日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2012年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月20日
發(fā)明者王曉川, 劉丹如, 王牧, 房聰 申請(qǐng)人:無錫聯(lián)合利康臨床檢驗(yàn)所有限公司