專利名稱：一種造血系統(tǒng)特異性表達(dá)Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于一種轉(zhuǎn)基因小鼠模型的制備方法，具體涉及利用PCR方法克隆人胚胎發(fā)育相關(guān)基因EDAG基因的大小為2. 3kb的5’端啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)域并利用該調(diào)控序列構(gòu)建表達(dá)載體以及制備造血系統(tǒng)特異性表達(dá)Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠的一種制備方法。
背景技術(shù)：
哺乳動(dòng)物造血是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過(guò)程。在小鼠胚胎期7. 5天，胚外中胚層來(lái)源細(xì)胞產(chǎn)生的內(nèi)皮和造血細(xì)胞共同組成血島，此時(shí)造血細(xì)胞主要是原始紅細(xì)胞,核圓、胞體大并表達(dá)胚胎型血紅蛋白，此過(guò)程歷時(shí)短暫，被稱為原始造血。胚胎期10. 5天，胚內(nèi)位點(diǎn)主動(dòng)脈-性腺-中腎區(qū)(AGM)開(kāi)始產(chǎn)生成體造血干細(xì)胞，在11. 5天達(dá)到高峰，此類細(xì)胞能向 多個(gè)造血細(xì)胞譜系分化。胚胎期11天，造血干細(xì)胞開(kāi)始通過(guò)已建立的血液循環(huán)遷移至胎肝，并繼續(xù)發(fā)育成熟，以紅系分化最為顯著。此時(shí)紅細(xì)胞無(wú)核、合成成體型珠蛋白，標(biāo)志著永久造血的建立。AGM區(qū)造血活動(dòng)于胚胎期13天結(jié)束，其后胎肝成為造血主要場(chǎng)所。臨近出生時(shí)，胎肝造血活動(dòng)消退，被骨髓取代，后者成為終生造血器官(Dzierzak E. Ontogenicemergence of definitive hematopoietic stem cells.Curr Opin Hematol，2003，10 229-234)o胚胎造血發(fā)育是特異性基因表達(dá)或沉默而獲得特定表型的過(guò)程，已發(fā)現(xiàn)多種與造血調(diào)控有關(guān)的基因或基因家族，如GATA、C/ΕΒΡ和AML/CBF/Runxl等，分別在造血發(fā)育的不同階段發(fā)生作用。這些核內(nèi)造血相關(guān)基因的協(xié)調(diào)性表達(dá)是在一系列錯(cuò)綜復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控下完成的，如Notch、Wnt、Sonic、hedgehog(Shh) >Smad等。隨著功能基因組時(shí)代的到來(lái)，對(duì)包括上述基因在內(nèi)的在造血系統(tǒng)尤其是早期造血系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用的基因功能和作用機(jī)理的研究顯得尤為迫切。傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)作為有效的研究手段在這個(gè)方面發(fā)揮了重要的作用，但是敲除與胚胎發(fā)育相關(guān)的基因常常導(dǎo)致小鼠胚胎畸形甚至在胚胎早期發(fā)生死亡而無(wú)法進(jìn)行后續(xù)性研究。采用Cre/Loxp的重組系統(tǒng)介導(dǎo)的組織特異性基因敲除技術(shù)則可以特異性控制某些重要基因在組織中的特異性表達(dá)，進(jìn)而研究其在不同發(fā)育階段的作用。EDAG基因是造血組織特異表達(dá)的新基因，研究表明，EDAG基因特異表達(dá)于造血組織(成年骨髓、胚胎肝)中的未成熟造血細(xì)胞(⑶34+細(xì)胞，即造血干細(xì)胞)，在心、肝、脾、肺、腎、腦、肌肉以及外周血單核細(xì)胞等成熟細(xì)胞中沒(méi)有表達(dá)(閭軍，等.EDAG-1，一種與造血調(diào)控密切相關(guān)新基因的分離和確認(rèn).生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)，2001，33 :641-646)。但在白血病人外周血細(xì)胞以及白血病細(xì)胞K562中高表達(dá)EDAG，在血紅素Hemin、美洲商陸PMA等誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅系或巨核系分化后，EDAG表達(dá)迅速下調(diào)；利用反義核酸抑制EDAG表達(dá)后，K562細(xì)胞增殖受阻，集落形成能力下降，細(xì)胞對(duì)誘導(dǎo)劑反應(yīng)更加敏感。研究CDlIa驅(qū)動(dòng)的造血特異表達(dá)EDAG轉(zhuǎn)基因鼠發(fā)現(xiàn)其胸腺發(fā)育異常，脾臟肥大；外周血淋巴細(xì)胞形態(tài)異常、比例下降，中性粒細(xì)胞比例上升；骨髓B220+細(xì)胞明顯下降，sca-l+c-kit+lin_細(xì)胞增加；脾DC細(xì)胞增多，B220+陽(yáng)性細(xì)胞減少；胸腺T細(xì)胞發(fā)育在早期受到阻滯，DN細(xì)胞增多；并且骨髓細(xì)胞體外分化能力明顯下降。這些結(jié)果提示EDAG高表達(dá)可能阻滯造血干細(xì)胞正常分化，其表達(dá)下調(diào)為造血細(xì)胞分化與發(fā)育所必需。這些研究表明EDAG/特異表達(dá)于早期造血細(xì)胞/造血干細(xì)胞并與造血分化調(diào)控密切相關(guān)(Li CY，et a I. EDAG regulates the proliferationand differentiation of hematopoietic cells and resists cell apoptosis throughthe activation of nuclear factor-kappa B.Cell Death Differ，2004，11 :1299-1308;Li CY, et al. Overexpression of a hematopoietic transcriptional regulator EDAGinduces myelopoiesis and suppresses lymphopoiesis in transgenic mice. Leukemia，2007,21 :2277-2286 ；Yang LV, et al. Hemogen is a novel nuclear factor specificallyexpressed in mouse hematopoietic development and its human homologue EDAG mapsto chromosome 9q22，a region containing breakpoints of hematological neoplasms.Mech Dev，2001，104:105-111)。因此我們?cè)谥苽湓煅到y(tǒng)特異性表達(dá)Oe重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠的過(guò)程中，應(yīng)用PCR方法克隆了人EDAGEDAG 5’端2. 3kb的調(diào)控序列用于指導(dǎo)Cre重組酶基因的造血系統(tǒng)中的特異性表達(dá)。 該轉(zhuǎn)基因小鼠的獲得為借助Cre/Loxp重組系統(tǒng)在造血系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)一系列基因重組操作、制備組織特異性表達(dá)動(dòng)物模型來(lái)研究發(fā)育相關(guān)基因在造血系統(tǒng)中不同發(fā)育階段中的生物學(xué)功能及其表達(dá)模式體哦國(guó)內(nèi)一個(gè)有力的研究工具。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種造血系統(tǒng)特異性表達(dá)Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型和制備方法。本發(fā)明的關(guān)鍵在于利用Cre重組酶的基因重組和敲除特異性與EDAG基因的早期造血特異性表達(dá)，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠，通過(guò)EDAG啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)對(duì)Cre重組酶在造血系統(tǒng)中特異性表達(dá)的調(diào)控。該轉(zhuǎn)基因小鼠的制備方法包括以下步驟一、人胚胎發(fā)育相關(guān)基因EDAG 5’端啟動(dòng)子的克??；二、利用得到的EDAG 5’端啟動(dòng)子序列構(gòu)建造血細(xì)胞特異性表達(dá)的Cre重組酶表達(dá)載體 pEDAG-Cre ；三、限制性內(nèi)切酶酶切線性化pEDAG-Cre表達(dá)載體，回收并純化約5. 6Kb的線性化片段；四、將線性化表達(dá)載體進(jìn)行顯微注射小鼠雄原核，成功制備了基因組中整合有該表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因小鼠。


圖I為轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體pEDAG-Cre的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為表達(dá)載體pEDAG-Cre的酶切鑒定電泳圖譜。其中左側(cè)核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000marker ;右側(cè)核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)DL15000Marker。圖3為PCR鑒定EDAG-Cre轉(zhuǎn)基因的首建者(H)代)小鼠的電泳鑒定結(jié)果。其中M :DL2000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 :陽(yáng)性對(duì)照；2 10 :經(jīng)過(guò)原核顯微注射后得到的首建鼠幼鼠基因組DNA PCR結(jié)果。圖4為RT-PCR方法鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠Cre重組酶的組織特異性表達(dá)的電泳鑒定結(jié)果圖譜。其中，M DL2000DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量；1 :陽(yáng)性對(duì)照；2 :骨髓；3 :胸腺；4 :外周血；5 :脾；6 :月干；7 :腎；8 :肺；9 :肌肉；10 :胎肝；11 :胎腦；12 :陰性對(duì)照。圖5EDAG_Cre轉(zhuǎn)基因小鼠和R0SA26小鼠交配情況。圖6為Cre重組酶在R0SA26小鼠骨髓和胸腺中的表達(dá)活性。其中A.骨髓細(xì)胞中LacZ的表達(dá)活性，B.脾臟細(xì)胞中LacZ的表達(dá)活性ΓΡ < O. 05，***Ρ < O. 001)。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。應(yīng)理解這些實(shí)施案例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。 材料和方法I.材料重組酶Cre表達(dá)質(zhì)粒Al. O-Cre由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所楊曉教授惠贈(zèng)。包含有EDAG啟動(dòng)子的質(zhì)粒pEDAG-GFP由本室構(gòu)建并保存。細(xì)菌菌株DH5a、JM109由本室制備保存。限制性內(nèi)切酶和T4連接酶等購(gòu)自NEB公司。C57B/6小鼠由本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。R0SA26報(bào)告基因小鼠由南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所提供。EDAG-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)建成功后在軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心保存。2. EDAG-Cre打靶載體構(gòu)建EDAG啟動(dòng)子區(qū)-2214到+96片段以pEDAG_GFP的質(zhì)粒DNA為模板，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后，以KpnI/Sall限制性內(nèi)切酶雙酶切后，克隆到Al. O-Cre載體中構(gòu)建EDAG驅(qū)動(dòng)的Cre重組酶打靶載體EDAG-Cre，經(jīng)過(guò)測(cè)序確認(rèn)序列正確。Cre PCR引物序列如下正向引物CGGGGT ACC TAC AGT CCC TCC ACA CTC TGC TTC反向引物CGGGTC GAC CTT CCT GCT ATT TTG GTC TGA CTT CC3. EDAG-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠的制備EDAG-Cre質(zhì)粒經(jīng)過(guò)KpnI/SacII線性化酶切，DNA片段回收，按常規(guī)進(jìn)行受精卵原核顯微注射和輸卵管胚胎移植，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所完成。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用C57B1/6 小鼠。4. EDAG-Cre首建鼠的鑒定剪取出生后10-14天的幼鼠尾尖約O. 3-0. 5cm，加入55ul組織裂解液，55°C孵育過(guò)夜后，100°C滅活5分鐘，加入IOOul蒸餾水后，離心取上清作為基因組PCR模板。Cre重組酶通用引物如下，擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)354bp 正向引物序列GGACAT GTT CAG GGA TCG CCA GGC G反向引物序列CCATGA GTG AAC GAA CCT GGPCR 條件預(yù)變性 94°C 3 分鐘；94°C變性 30s，58°C復(fù)性 30s，72°C延伸 30s，進(jìn)行42個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5分鐘。5. EDAG-Cre小鼠中重組酶基因的表達(dá)處死6周齡的EDAG-Cre陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠，取包括肝臟、脾臟、腎臟、肺、胸腺、骨髓、外周血、肌肉在內(nèi)的各種組織；另外將Cre轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性雄鼠與野生雌鼠交配，通過(guò)檢查雌鼠陰道栓確定交配日期，收集胚齡E13. 5天的小鼠胚胎，以卵黃囊基因組DNA PCR鑒定Cre陽(yáng)性胚胎，取陽(yáng)性小鼠胚胎的胎肝和腦，應(yīng)用Invitrogen公司的Trizol 試劑盒提取上述組織的總RNA,以Takara RNA PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA,用Takara rTaq和上述Cre引物進(jìn)行PCR鑒定，以GAPDH為內(nèi)參照基因，目的片段長(zhǎng)150bp 正向引物TGCCCC CAT GTT TGT GAT G反向引物TGTGGT CAT GAG CCC CTT TCC6. EDAG-Cre重組酶活性的組織分布EDAG-Cre小鼠和R0SA26小鼠交配后，取8周齡雙陽(yáng)性(EDAG-Cre+/LacZ+)小鼠和LacZ+小鼠骨髓和脾臟，分離成單細(xì)胞，取IXlO6細(xì)胞，應(yīng)用β_半乳糖苷酶試劑盒檢測(cè)半乳糖苷酶活性(LacZ染色)，于37°C孵育I 2h后，于酶標(biāo)儀檢測(cè)405nm波長(zhǎng)下的吸光度值。結(jié)果I. EDAG-Cre打靶載體構(gòu)建表達(dá)EDAG轉(zhuǎn)基因打靶載體由EDAG基因啟動(dòng)子區(qū)(2. 3kb)、Cre重組酶(I. 2Kb)和人 生長(zhǎng)激素調(diào)控序列(hGH,2. Ikb)組成,全長(zhǎng)約5. 6kb ;該打祀載體經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶KpnI/SacII酶切后，成為線性DNA片段，用于隨后的受精卵顯微原核注射。2.轉(zhuǎn)基因首建鼠的鑒定EDAG-Cre轉(zhuǎn)基因打靶載體被限制性內(nèi)切酶KpnI和SacII酶切線性化，經(jīng)過(guò)受精卵原核顯微注射后，出生幼鼠經(jīng)鼠尾基因組DNA PCR鑒定以后，共獲得6只陽(yáng)性Cre轉(zhuǎn)基因首建鼠。3. Cre重組酶基因的造血系統(tǒng)組織特異性表達(dá)陽(yáng)性首建鼠經(jīng)過(guò)傳代建系后，Cre重組酶基因在成年小鼠以及胚胎各種各組織中的表達(dá)見(jiàn)圖3。RT-PCR結(jié)果顯示，在成年小鼠的體內(nèi)，Cre重組酶基因僅在骨髓、胸腺、外周血、脾臟等造血系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)，其中骨髓和胸腺等組織中的表達(dá)高于外周血和脾臟；在胚胎組織中，擔(dān)負(fù)胚胎早中期造血的胎肝中有明顯表達(dá)，而在胎腦中則未見(jiàn)表達(dá)。4. Cre重組酶的組織表達(dá)活性為檢測(cè)EDAG-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠的重組酶表達(dá)活性，我們將EDAG-Cre小鼠與R0SA26小鼠進(jìn)行了交配，取8周齡EDAG-CreYLacZ+雙陽(yáng)性小鼠的骨髓和脾臟組織，以LacZ+小鼠為對(duì)照，進(jìn)行β_半乳糖苷酶活性檢測(cè)。結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組小鼠的脾臟和骨髓半乳糖苷酶活性均高于對(duì)照組，差異明顯(P < O. 05)，表明重組酶在這兩種組織中有表達(dá)活性。
權(quán)利要求
1.一種重組酶轉(zhuǎn)基因小鼠模型，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型的基因組整合有DNA片段，包含有人EDAG (Embryonic development associated gene 1，胚胎發(fā)育相關(guān)基因-1，簡(jiǎn)稱EDAG)基因5’端啟動(dòng)子區(qū)域，以及來(lái)源于噬菌體的Cre重組酶基因片段。
2.如權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，其特征在于，所述小鼠EDAG5’端調(diào)控區(qū)域包括該調(diào)控序列、Cre重組酶基因、人生長(zhǎng)激素poly A在內(nèi)的序列。
3.如權(quán)利要求I和2所述的轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型，其特征在于，所述人胚胎發(fā)育相關(guān)基因(EDAG) 5，端啟動(dòng)子具有SEQ ID No. I所示的序列。
4.如權(quán)利要求I和2所述的轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型，其特征在于，所述Cre重組酶基因具有SEQ ID No. 2所示的序列。
5.一種重組酶轉(zhuǎn)基因小鼠的動(dòng)物模型的制備方法，其特征在于包括以下步驟 A.人胚胎發(fā)育相關(guān)基因EDAG5’端啟動(dòng)子的克??； B.利用得到的EDAG5’端啟動(dòng)子序列構(gòu)建造血細(xì)胞特異性表達(dá)的Cre重組酶表達(dá)載體pEDAG-Cre ； C.限制性內(nèi)切酶酶切線性化pEDAG-Cre表達(dá)載體，回收并純化約5.6Kb的線性化片段； D.將線性化表達(dá)載體進(jìn)行顯微注射小鼠雄原核，成功制備了基因組中整合有該表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因小鼠。
6.權(quán)利要求I的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，其特征在于，轉(zhuǎn)基因小鼠基因組中整合的Cre重組酶基因只在造血系統(tǒng)包括成年小鼠的骨髓、脾臟和外周血中有表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種造血系統(tǒng)特異性表達(dá)Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠的制備方法。本發(fā)明公開(kāi)了一種轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型，該轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型的基因組整合有DNA片段pEDAG-Cre，所述DNA片段包括有人胚胎發(fā)育相關(guān)基因(EDAG)5’端啟動(dòng)子與Cre重組酶基因以及人生長(zhǎng)素基因polyA片段。本發(fā)明還公開(kāi)了該轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型的制備方法，包括應(yīng)用PCR方法克隆2.3kb的EDAG基因5’端啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體pEDAG-Cre，以顯微注射方法將5.6kb的轉(zhuǎn)基因片段引入小鼠雄原核，并應(yīng)用PCR方法鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠。RT-PCR方法和ROSA26LacZ報(bào)告小鼠鑒定結(jié)果表明，EDAG-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠只在造血系統(tǒng)中特異性表達(dá)重組酶。
文檔編號(hào)C12N15/85GK102860282SQ20111018744
公開(kāi)日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2011年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月6日
發(fā)明者葛常輝, 許望翔, 李長(zhǎng)燕, 楊曉明 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所