專利名稱：使用腈水解酶突變體生產3-羥基羧酸的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子生物學和微生物學領域。更具體地說，本發(fā)明涉及具有改善的腈水解酶活性的突變的腈水解酶，所述腈水解酶用于將3-羥基腈轉化為3-羥基羧酸。
背景技術：
具有優(yōu)異性能、獨特性質、改善的成本效率、品質以及低生態(tài)影響的新聚合物正引起工業(yè)界的注意。特別是，需要具有支鏈、致密結構以及末端帶反應基的功能聚合物，因為與常規(guī)線型統(tǒng)計共聚物相比，它們具有更低的特性粘度和更高的活性。這樣優(yōu)異的聚合物可通過共聚高支化(hyperbranching)羥基羧酸共聚單體(高支化ABn型，其中A和B是具有羥基或羧基衍生的反應基部分，η是2或更大)(Hult等， pp.656-658 禾口 Voit 等，pp.658-659 in Concise Polymeric Materials Encyclopedia,編輯.J. C. Salomone, CRC Press, New York, 1999)和多種線型羥基羧酸共聚單體(線型AB 型)包括3-羥基戊酸(3-HVA)和3-羥基丁酸(3-HBA)得以制備。3-羥基羧酸用作為共聚單體用于制造線型聚酯。聚酯被用作為熱塑性、熱固性、半結晶、非晶形、剛性和彈性體材料。它們是纖維、薄膜、模制品和涂料的主要成分(Goodman， pp.793-799 in Concise Encyclopedia of Polymer Science and EnRineerinR, 編輯.J. I.Kroschwitz, John Wiley & Sons，New York,1990)。已在使用皺落假絲酵母(Candida rugosa)的發(fā)酵中通過戊酸的3_羥基化作用制備了 3-羥基戊酸(Hasegawa 等，J. Ferment. Technol. 59 :257-262(1981) JP 59053838 B4)，并且通過使用惡臭假單胞菌(I^seudomonas putida)、產藍色素熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、氧化節(jié)桿菌(Arthrobacter oxydans)禾口 Arthrobacter crystallopietes，經發(fā)酵的戊酸的3-羥基化作用，類似地制備了 3_羥基戊酸的單一對映體(U. S. 3，553，081)。這些用于戊酸發(fā)酵氧化的方法通常產生低產物濃度的3-羥基戊酸，并且從發(fā)酵培養(yǎng)基中分離3-羥基戊酸需要精心設計且費用昂貴。已通過化學降解 (Seekich 等，HeIv. CMm. Acta 77:2007-2034(1994))或聚(3-羥基丁酸酯/3-羥基戊酸酯)發(fā)酵自降解(W0 9929889)制備得到(R) _ (_) _3_羥基戊酸，但是羥基丁酸/羥基戊酸共聚物的降解同樣需要費力地將3-羥基丁酸與副產物3-羥基戊酸分離。還已通過酶促還原 3-氧代戊酸(Bayer 等，Appl. Microbiol. Biotechnol. 42 :543-547 (1994))或不對稱氫化甲基3-氧代戊酸酯接著皂化(Burk等，Organometallics 9 :2653-2655(1990))制備得到(R)-(-)-3-羥基戊酸。通過多種化學方法，腈容易地轉化為相應的羧酸。這些方法需要強的酸性和堿性反應條件和高反應溫度，且通常產生不需要的副產物和/或作為不需要的廢棄物的大量無機鹽。用于化學水解額外具有羥基的腈的反應條件，例如用于將3-羥基戊腈轉化為3-羥基戊酸的反應條件，通常會導致不期望的伯、仲或叔羥基消除，產生碳-碳雙鍵。腈酶催化水解為相應的羧酸是經常優(yōu)選的化學方法，因為該反應通常在環(huán)境溫度下進行，無需強的酸性或堿性反應條件，并以高轉化率產生高選擇性的所需產物。兩種酶——腈水合酶和酰胺酶的組合可用于在水溶液中將脂肪腈轉化為相應的羧酸。開始，通過腈水合酶將脂肪腈轉化為酰胺，接著，隨后通過酰胺酶將酰胺轉化為相應的羧酸。已知多種細菌菌屬具有不同的腈水合酶和酰胺酶活性譜(Sugai等，Biosci. Biotech. Biochem. 61 1419-1427(1997))，包括紅球菌屬(Rhodococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、產硫桿菌屬(Alcaligenes)、節(jié)核細菌屬(Arthrobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、無芽孢桿菌屬(Bacteridium) lifM (Brevibacterium)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)禾口微球菌屬(Micrococcus)。真菌節(jié)鐮孢(Fusarium merismoides) TG-I還已用作為催化劑用于水解脂肪腈和二腈(Asano 等，Agric. Biol. Chem. 44 =2497-2498 (1980)) 來自紅球菌 (Rhodococcus sp.)(來自Novo Industri的SP409)的固定化腈水合酶和酰胺酶被用于將 3-羥基丙腈、3-羥基庚腈和3-羥基壬腈水解為相應的3-羥基羧酸，產率分別為63%、62% 和 83% (de Raadt 等，J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1，137-140 (1992))。使用 TLC 也觀察到了相應的酰胺的形成。與此相反，蒼白芽孢桿菌(Bacillus pallidas)Dac521的純化的腈水合酶水解多種脂肪腈，但不水解3-羥基丙腈(Cramp等，Biochim. Biophys. Acta 1431 249-260(1999))。單種酶一腈水解酶在水溶液中也將腈轉化為相應的羧酸和氨，但沒有酰胺中間體形成(方程式1和2)。
權利要求
1.如SEQID NO :15所示的分離的核酸分子。
2.一種包含可操作地連接有合適的調節(jié)序列的權利要求1的分離的核酸分子的嵌合基因。
3.一種包含權利要求2的嵌合基因的表達盒。
4.一種包含權利要求2的嵌合基因的轉化的微生物。
5.一種包含權利要求3的表達盒的轉化的微生物。
6.權利要求4的轉化的微生物，其中所述微生物選自叢毛單胞菌(Comamonassp.)、 棒狀桿菌(Corynebacterium sp.)、fei|f菌(Brevibacterium sp·)、紅球菌(Rhodococcus sp·)、固氮菌(Azotobacter sp.)、梓樣酸桿菌(Citrobacter sp.)、腸桿菌(Enterobacter sp.)、梭狀芽孢桿菌(Clostridium sp.)、克雷白氏桿菌(Klebsiella sp.)、沙門氏菌 (Salmonella sp.)、乳酸桿菌(Lactobacillus sp.)、曲霄(Aspergillus sp·)、糖酵母 (Saccharomyces sp.)、接合酵母(Zygosaccharomyces sp.)、畢赤氏酵母(Pichia sp.)、 克魯維氏酵母(Kluyveromyces sp.)、假絲酵母(Candida sp.)、漢森氏酵母(Hansenula sp.)、杜氏藻(Dunaliella sp.)、德巴利氏酵母(Debaryomyces sp.)、毛霉(Mucor sp.)、球擬酵母(Torulopsis sp.)、甲基桿菌(Methylobacteria sp·)、芽孢桿菌(Bacillus sp.)、 埃希氏桿菌(Escherichia sp. )、/[段單胞菌(Pseudomonas sp. )、f艮瘤菌(Rhizobium sp.) 禾口鏈霉菌(Streptomyces sp.)。
7.權利要求6的轉化的微生物，其中所述轉化的微生物是一種大腸桿菌菌株，選自保藏號為 ATCC 47076 的MG1655、保藏號為 ATCC 53911 的 FM5、保藏號為 ATCC 27325 的 W3110、 保藏號為ATCC 35695的MC4100和保藏號為ATCC 12435的W1485。
8.一種用于將3-羥基腈水解為3-羥基羧酸的方法，包括步驟(a)將反應混合物水溶液中的3-羥基腈與腈水解酶催化劑接觸，由此所述3-羥基腈被水解為相應的3-羥基羧酸，所述腈水解酶催化劑為權利要求1的分離的核酸分子所編碼；和(b)任選地分離步驟 (a)中產生的3-羥基羧酸。
9.權利要求8的方法，其中所述3-羥基腈是3-羥基戊腈或3-羥基丁腈。
10.一種用于將3-羥基戊腈水解為3-羥基戊酸的方法，包括步驟(a)將反應混合物水溶液中的3-羥基戊腈與權利要求1的分離的核酸分子編碼的腈水解酶催化劑接觸，由此所述3-羥基戊腈被水解為3-羥基戊酸；和(b)任選地分離步驟(a)中產生的3-羥基戊酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用腈水解酶突變體生產3-羥基羧酸。本發(fā)明涉及具有改善的用于將3-羥基腈轉化為3-羥基羧酸的腈水解酶活性的腈水解酶突變體。更具體地說，使用易錯PCR和位點定向誘變突變敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)腈水解酶基因以產生具有改善的用于將3-羥基腈(如3-羥基丁腈或3-羥基戊腈)轉化為相應的3-羥基羧酸的腈水解酶活性的腈水解酶。也提供了一種使用所述改善的突變體生產3-羥基羧酸的方法。
文檔編號C12N15/63GK102260696SQ201110195589
公開日2011年11月30日 申請日期2005年8月16日 優(yōu)先權日2004年8月16日
發(fā)明者D·P·奧基夫, M·S·佩恩, R·迪科西莫 申請人:納幕爾杜邦公司