專利名稱：支持cho高密度懸浮生長的無血清無蛋白全化學(xué)成分界定的培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種支持動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基，尤其是一種支持CHO高密度懸浮生長的無血清無蛋白全化學(xué)成分界定的培養(yǎng)基，支持CHO細(xì)胞高密度懸浮培養(yǎng)的同時(shí)具有化學(xué)成分界定的特點(diǎn)，屬于細(xì)胞工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
基因工程蛋白的表達(dá)從上世紀(jì)80年代在國外興起，迄今已經(jīng)接近30年，并被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究、醫(yī)藥研究行業(yè)。尤其由于生物醫(yī)藥行業(yè)特別是以治療單抗為產(chǎn)品的生物技術(shù)公司在90年代后異軍突起，使得該行業(yè)每年以超過50%的復(fù)合增長率高速發(fā)展。世界范圍內(nèi)，在已經(jīng)獲批和正在報(bào)批的重組治療性蛋白中，超過70-80%基于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生 產(chǎn)，在所有基于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的蛋白藥物生產(chǎn)中，CHO(中國倉鼠卵巢細(xì)胞)的應(yīng)用最為廣泛，占到了已經(jīng)批準(zhǔn)蛋白藥物的70%以上，以及正在申報(bào)臨床項(xiàng)目的80%以上。CHO細(xì)胞與其他動(dòng)物細(xì)胞比，外源蛋白易于合成及分泌到培養(yǎng)基中；正確組裝和修飾翻譯后的蛋白使之和天然蛋白接近；易于放大，便于工業(yè)化高密度培養(yǎng)；應(yīng)用于臨床藥物生產(chǎn)的歷史長，安全性高；因此，CHO細(xì)胞的培養(yǎng)便變得十分重要，其中培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)與優(yōu)化又成為重中之重。從早期的有血清培養(yǎng)基過渡到無血清培養(yǎng)基及現(xiàn)在國際上至為推崇的化學(xué)成分界定培養(yǎng)基，無一不是將生產(chǎn)工藝中不安全、不穩(wěn)定、不經(jīng)濟(jì)和不夠有效的組分盡量調(diào)整為沒有病毒/外源因子污染，批次重復(fù)性高，成本低廉和支持更高的細(xì)胞密度及蛋白表達(dá)方向。國外在最近幾年隨著動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)與表達(dá)技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)出現(xiàn)了以LifeTehnologies, Thermofisher等公司為代表的一些試劑公司開發(fā)出用于CHO細(xì)胞高密度懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基，包括普通無血清培養(yǎng)基，無蛋白培養(yǎng)基及化學(xué)成分界定培養(yǎng)基，但由于屬于各公司的核心商業(yè)秘密，秘而不宣。國內(nèi)近些年來也開始陸續(xù)針對(duì)CHO細(xì)胞開發(fā)了多種無血清培養(yǎng)基，但大多數(shù)均是在已有基本培養(yǎng)基如DMEM，DMEM/F12，MDM等基礎(chǔ)上加入各種維生素，生長因子，轉(zhuǎn)鐵蛋白，蛋白水解物及微量元素，成份復(fù)雜，營養(yǎng)平衡程度差且基本上均含有蛋白或其水解產(chǎn)物類較難于質(zhì)控，影響下游純化的組分。同時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)表現(xiàn)一般，批次培養(yǎng)很少超過5百萬細(xì)胞每毫升的密度。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種支持CHO高密度懸浮生長的無血清無蛋白全化學(xué)成分界定的培養(yǎng)基，引入更多包括微量元素在內(nèi)的組分，替代一般培養(yǎng)基設(shè)計(jì)中所必需的生長因子如胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白，并通過代謝分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，讓各營養(yǎng)組分更加平衡。最終獲得一個(gè)沒有任何非界定成份的培養(yǎng)基，同時(shí)支持CHO細(xì)胞更好的生長和更短的細(xì)胞擴(kuò)增倍增時(shí)間。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下I)利用已有文獻(xiàn)報(bào)道設(shè)計(jì)簡化培養(yǎng)基骨架配方；2)選擇添加可以替代生長因子、轉(zhuǎn)鐵蛋白和提高細(xì)胞生長表現(xiàn)組分；3)利用統(tǒng)計(jì)學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)確定各個(gè)組分的最佳劑量；基于以上考慮，本發(fā)明的培養(yǎng)基主要由以下幾方面的組分構(gòu)成氨基酸作為蛋白/多肽合成的前體和合成其他生物大分子的中間體，同時(shí)也產(chǎn)生代謝能量；無機(jī)鹽NaC I維持滲透壓平衡，協(xié)調(diào)共同轉(zhuǎn)運(yùn)有機(jī)大分子進(jìn)入細(xì)胞；K+，Ca2+，Mg2+，Zn2+等離子則參予代謝與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及促進(jìn)貼壁和細(xì)胞增殖；各種陰離子(S0廣，N03_等)則主要用于調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)細(xì)胞膜勢能或作為含硫或氮元素有機(jī)分子的前體；維生素維生素在細(xì)胞代謝中主要作為以下細(xì)胞功能有機(jī)催化劑功能。如碳分子的代謝，轉(zhuǎn)氨作用，羧化與去羧基化作用，氧化磷酸化；
碳水化合物葡萄糖是細(xì)胞培養(yǎng)中需要的主要碳水化合物，用作細(xì)胞代謝的主要能量來源，及合成DNA等大分子的碳源；丙酮酸鈉和肌醇也常常用來縮短細(xì)胞的中間代謝；微量元素很多微量金屬離子在特定濃度范圍有很明顯的對(duì)細(xì)胞的生長和蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用和抑制作用。除此外，培養(yǎng)基中還加入了酚紅用作培養(yǎng)基pH的指示劑，和Pluroni c F-68作為懸浮細(xì)胞培養(yǎng)中用于保護(hù)細(xì)胞免受剪切力傷害的表面活性劑。根據(jù)將以上各類物質(zhì)對(duì)細(xì)胞生長的不同作用，本發(fā)明將以上類別的物質(zhì)按以下濃度進(jìn)行設(shè)置氨基酸的組分和用量
L-精氨酸120 290mg/L
L-天冬酰胺260 750mg/L
L-天冬氨酸40 250mg/L
L-胱氨酸10 140mg/L
L-谷氨酸60 370mg/L
L-組氨酸40 250mg/L
L-羥脯氨酸40 250mg/L
L-異亮氨酸90 210mg/L
L-亮氨酸150 390mg/L
L-賴氨酸150 390mg/L
L-蛋氨酸20 170mg/L
L-苯丙氨酸50 70mg/L
L-脯氨酸150 390mg/L
L-谷氨酰胺300 700mg/L
L-絲氨酸150 390mg/L
L-蘇氨酸90 210mg/L
L-色氨酸40 60mg/L
L-酪氨酸50 70mg/L
L-纈氨酸90 210mg/L無機(jī)鹽的組分和用量
權(quán)利要求
1.一種支持CHO高密度懸浮生長的無血清無蛋白全化學(xué)成分界定的培養(yǎng)基，其特征在于，所述無血清培養(yǎng)基含有以下組分氨基酸、無機(jī)鹽、微量元素和維生素， 其中，所述氨基酸的組分和用量為 L-精氨酸120 290mg/L L-天冬酰胺260 750mg/L L-天冬氨酸40 250mg/L L-胱氨酸10 140mg/L L-谷氨酸60 370mg/L L-組氨酸40 250mg/L L-羥脯氨酸40 250mg/L L-異亮氨酸90 210mg/L L-亮氨酸150 390mg/L L-賴氨酸150 390mg/L L-蛋氨酸20 170mg/L L-苯丙氨酸50 70mg/L L-脯氨酸150 390mg/L L-谷氨酰胺300 700mg/L L-絲氨酸150 390mg/L L-蘇氨酸90 210mg/L L-色氨酸40 60mg/L L-酪氨酸50 70mg/L L-纈氨酸90 210mg/L 所述無機(jī)鹽的組分和用量為 無水氯化鈣30 140mg/L 無水氯化鎂20 70mg/L 無水硫酸鎂20 IOOmgZL 氯化鉀100 450mg/L 碳酸氫鈉760 3330mg/L 氯化鈉1870 4970mg/L 磷酸氫二鈉100 430mg/L 所述微量元素的組分和用量為 六水氯化鋁0.210 0.90(^g/L 四水鉬酸銨2.000 8.00(^g/L 醋酸鋇0.455 2.00(^g/L 氯化鎘3.00 10.(^g/L 六水氯化鉻0.078 0.314pg/L 六水氯化鈷0.420 2.00(^g/L 二水氯化銅0.478 2.00(^g/L 九水硝酸鐵273.0 780.(^g/L 七水硫酸亞鐵35 lOOpg/L二氧化鍺0.095 0.378pg/L四水氯化錳0.053 0.21(^g/L六水氯化鎳0.032 0.126pg/L溴化鉀0.021 0.084pg/L碘化鉀0.032 0.126pg/L硝酸銀0.032 0.126pg/L檸檬酸鈉106 302pg/L氟化鈉0.735 3.00(^g/L氯化錫0.009 0.035pg/L四氯化鈦0.105 0.42(^g/L 七水硫酸鋅77 22(^g/L 八水氯化氧鋯0.560 2.00(^g/L 所述維生素的組分和用量為氫化可的松0.001 0.003mg/L生物素0.30 1.0mg/L 鹽酸吡哆醇0.3 l.Omg/L核黃素0.06 0.28mg/L 鹽酸硫胺0.3 1.0mg/L 維生素 B120.002 0.007mg/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種無血清培養(yǎng)基，其特征在于，所述無血清培養(yǎng)基還含有以下組分和用量的碳水化合物和其他有機(jī)分子D-葡萄糖2100 7000mg/LZiIf-Iic1.0 3.0mg/L還原型谷U光甘狀0.3 1.0mg/L丙酮酸納33 110mg/L抗壞血酸1.0 5.0mg/L葉酸0.3 l.Omg/L內(nèi)消旋肌醇ll 49mg/L煙酷胺1.0 3.0mg/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的一種無血清培養(yǎng)基，其特征在于，所述無血清培養(yǎng)基中還含有酚紅作為指示劑，所述酚紅的用量為2. O 7. Omg/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的一種無血清培養(yǎng)基，其特征在于所述無血清培養(yǎng)基中還含有P Iuron i c F-68作為表面活性劑，所述P Iuroni c F-68的用量為330 1540mg/L0
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種無血清培養(yǎng)基，其特征在于，所述碳水化合物為葡萄糖、丙酮酸鈉或肌醇。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種支持CHO高密度懸浮生長的無血清無蛋白全化學(xué)成分界定的培養(yǎng)基。該無血清培養(yǎng)基含有以下組分氨基酸、無機(jī)鹽、微量元素、維生素、碳水化合物及其他有機(jī)分子。該無血清培養(yǎng)基具有以下優(yōu)點(diǎn)該培養(yǎng)基不含任何提取或重組蛋白、多肽、水解產(chǎn)物；細(xì)胞生長時(shí)間短，密度高，代謝廢物累積低，細(xì)胞活力維持好，蛋白表達(dá)比同類產(chǎn)品高；由于為全化學(xué)成分界定，成本低廉。
文檔編號(hào)C12N5/02GK102876626SQ20111019641
公開日2013年1月16日 申請日期2011年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月14日
發(fā)明者陳宜頂 申請人:寧波安柯普頓生物技術(shù)有限公司