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      血清高密度脂蛋白中膽固醇的測定試劑的制作方法

      文檔序號:9415947閱讀:648來源:國知局
      血清高密度脂蛋白中膽固醇的測定試劑的制作方法
      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)及生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域,尤其涉及血清高密度脂蛋白中膽固醇的測 定試劑。
      【背景技術(shù)】
      [0002] 血清膽固醇濃度可作為人體脂類代謝的標(biāo)志。高密度脂蛋白膽固醇(HDL)是體 積最小的脂蛋白,和其他脂蛋白相比,HDL含蛋白量最大(>50% ),其主要的載脂蛋白為 APOA- I、A- II、及少量的APO-C、E ;磷脂是其主要的脂質(zhì),還有少量的膽固醇、膽固醇酯 和甘油三酯在卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(LCAT)的作用下,游離膽固醇變成膽固醇酯,經(jīng)過 HDL將蓄積在組織的游離膽固醇運送到肝,減少血漿HDL中游離膽固醇的濃度,形成膽固醇 從細(xì)胞膜流向血漿脂蛋白的濃度梯度,降低組織膽固醇的沉積,從而限制動脈粥樣硬化的 發(fā)生、發(fā)展,起到抗動脈粥樣硬化作用。所以,血漿中HDL和動脈粥樣硬化的發(fā)生成負(fù)相關(guān), 臨床醫(yī)學(xué)可用HDL-C來評價患冠心病(CHD)的危險性。
      [0003] 對高密度脂蛋白膽固醇的傳統(tǒng)測定方法有超速離心法、電泳法以及沉淀法,超速 離心法是根據(jù)脂蛋白的比重不同,用超速離心器把脂蛋白進(jìn)行分類,再對膽固醇進(jìn)行測定, 該方法通過超速離心和膽固醇檢測兩個過程,費時費力,且費用較高;電泳法需要借用一些 如瓊脂糖凝膠等作為載體分離,操作及其繁雜,且準(zhǔn)確度偏低;沉淀法是使用多聚陰離子和 二價金屬離子試劑沉淀大顆粒的脂蛋白,然后離心,再用其上清液檢測其含量,該方法雖然 簡便,但僅限于個別或少數(shù)樣本檢測,而且對高甘油三酯血癥患者檢測時,會造成結(jié)果偏高 的誤差,影響最終判斷結(jié)果。
      [0004] 近年來,隨著臨床醫(yī)學(xué)的深入發(fā)展,高密度脂蛋白膽固醇檢測(HDL-C)已實現(xiàn)了 全自動化,而HDL-C試劑是實現(xiàn)全自動檢測的關(guān)鍵,其品質(zhì)高低直接影響了檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn) 確性。目前,有關(guān)HDL-C試劑的報道較多,如專利CN 1632541 A公開了高密度脂蛋白中膽固 醇的測定試劑及制備方法,披露了由"適量防腐劑、穩(wěn)定劑、色原、高親和性酶化合物和表面 活性劑"制成的HDL-C試劑,該試劑實現(xiàn)了高密度脂蛋白中膽固醇全自動檢測,解決了傳統(tǒng) 檢測方法存在的不足,并且提高了檢測準(zhǔn)確度,相關(guān)性達(dá)到0.98以上;CN 1696659 A公開 了一種測定低密度脂蛋白膽固醇試劑及制備方法,披露了由"適量緩沖液、穩(wěn)定劑、色原、高 親和性酶化合物和表面活性劑"制成的試劑,該試劑實現(xiàn)了低密度脂蛋白中膽固醇全自動 檢測,解決了傳統(tǒng)檢測方法存在的不足,并且提高了檢測準(zhǔn)確度,相關(guān)性達(dá)到〇. 98以上。上 述兩篇文件均公開了由高親和性酶化合物作檢測物質(zhì)的技術(shù)方案,但該兩篇文件中的高親 和性酶化合物制備方法簡單,制備時沒有對酶進(jìn)行活化處理,存在酶與化合物反應(yīng)時間長, 且反應(yīng)不充分,進(jìn)而影響了酶化合物的整體性能與產(chǎn)量。此外,有關(guān)高密度脂蛋白中膽固醇 的測定試劑的報道都采用高分子量化學(xué)成分制備,化合物制備價格高且純度低,進(jìn)而影響 檢測結(jié)果。如專利CN 102041296 A公開的一種血清低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)勻相法 體外診斷試劑;CN 101078729 A公開的高密度脂蛋白膽固醇的測定方法等。

      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0005] 本發(fā)明的目的在于:提供一種血清高密度脂蛋白中膽固醇的測定試劑,通過酶的 選擇、預(yù)培養(yǎng)、活化培養(yǎng)及脫水反應(yīng)等步驟提高酶的活性,再與經(jīng)催化活化處理的化合物混 合反應(yīng),提高測定試劑靈敏度,進(jìn)而提高檢測結(jié)果準(zhǔn)確性。
      [0006] 為了實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
      [0007] 血清高密度脂蛋白中膽固醇的測定試劑,包括適量防腐劑、穩(wěn)定劑、色原、高親和 性酶化合物、表面活性劑、牛血清白蛋白,其特征在于:所述的高親和性酶化合物是按照以 下方法制備得到:
      [0008] 1)酶的活化:
      [0009] ①酶的選擇:膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶和脂蛋白脂酶,三者按照5~1 :1~5 : 1~1. 5的比例混合;
      [0010] ②酶的預(yù)培養(yǎng):將上述混合酶置于溫度32~39°C、pH值5. 5~8的緩沖溶液中預(yù) 培養(yǎng)3~8小時,其中,所述的緩沖溶液是磷酸鹽緩沖溶液或檸檬酸緩沖溶液;
      [0011] ③酶的活化培養(yǎng):經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的混合酶轉(zhuǎn)入由牛血清白蛋白、甘油、環(huán)糊精、 EDTA-Na溶液、青霉素及無菌水混合液中,在溫度34~39°C條件下活化培養(yǎng)5~10小時, 得到活化酶混合緩沖液A ;
      [0012] ④脫水反應(yīng):采用吸水劑制備過濾柱,將上述活化酶混合緩沖液A緩慢流經(jīng)過濾 柱,除去活化酶混合緩沖液中加入的游離水,并隨時調(diào)節(jié)緩沖液pH值,使其維持在5. 5~ 8 ;
      [0013] 2)制備高親和性酶化合物
      [0014] ①化合物選擇:甾類糖苷、三萜烯糖苷、蛋白質(zhì)毒素和多烯類抗菌素中的一種或多 種組合化合物組合,并且化合物采用公知手段進(jìn)行催化活化,得到活化化合物組合物B ;
      [0015] ②混合反應(yīng):將步驟1)得到的活化酶混合緩沖液A和步驟2)得到的活化化合物 組合物B混合,并補(bǔ)充適量的緩沖溶液,在32~39°C條件下混合反應(yīng)3~10小時,得到高 親和性酶化合物。
      [0016] 進(jìn)一步,所述的血清高密度脂蛋白中膽固醇的測定試劑由以下百分比的組分制 成:高親和性酶化合物68~73%、牛血清白蛋白23~30%、表面活性劑2. 4~2. 7%、防 腐劑1. 3~1. 5%、穩(wěn)定劑I. 1~1. 5%、色原0. 2~0. 3%,以上組合總量為100%。
      [0017] 進(jìn)一步,所述的活化酶混合緩沖液A與活化化合物組合物B混合比例為:1~2 : 3 ~10〇
      [0018] 進(jìn)一步,在步驟③酶的活化培養(yǎng)中,所述的混合液組分配比為:牛血清白蛋白 50~60 %、甘油5~8%、β -環(huán)糊精1~3%、EDTA-Na溶液1~L 5 %、青霉素0· 5~ 0· 8%、無菌水34~37%。
      [0019] 與現(xiàn)有血清高密度脂蛋白中膽固醇的測定試劑相比,本發(fā)明的有益效果在于:
      [0020] 1、該試劑能夠在各種型號的全自動生化分析儀上對高密度脂蛋白中膽固醇進(jìn)行 檢測,無需樣本離心、沉淀等繁雜操作,大幅降低了檢測工作量,縮短了檢測時間,降低了檢 測成本。
      [0021] 2、該試劑性質(zhì)穩(wěn)定,在2~8°C條件下穩(wěn)定12個月以上,不會出現(xiàn)試劑渾濁,變質(zhì) 腐壞及凝聚現(xiàn)象,使用時僅需輕輕振蕩搖勻即可。
      [0022] 3、該試劑特異性好、靈敏度高,檢測準(zhǔn)確率高,與國家推薦的Friedewald公式檢 測結(jié)果比較,相關(guān)性達(dá)到0. 997以上。
      【具體實施方式】
      [0023] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步說明,旨在幫助同領(lǐng)域技術(shù)人 員理解。
      [0024] 實施例1
      [0025] 血清高密度脂蛋白中膽固醇
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