專利名稱：一種Factor II和Factor V基因多態(tài)性檢測特異性引物和液相芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體的是涉及一種Factor II和FactorV基因多態(tài)性檢測特異性引物和液相芯片。
背景技術(shù)：
凝血酶原基因(prothrombinfactor II, Factor II)和凝血因子 V (Factor V)基因多態(tài)性是研究熱點。目前，對FactorII和FactorV基因多態(tài)性進行檢測、分析的報道不多，其研究的方法主要是直接測序法和PCR-RFLP分析法。PCR-RFLP法是基于基因突變造成的限制性內(nèi)切酶識別位點的改變，如位點丟失或產(chǎn)生新位點，通過PCR擴增某一特定片段， 再用限制性內(nèi)切酶酶切擴增產(chǎn)物，電泳觀察片段的大小，這種方法用于檢測酶切位點改變的基因突變，可直接判斷基因型，但該法不能用于沒有產(chǎn)生新酶切位點的基因突變檢測。此夕卜，以上方法都存在著檢測通量的局限性，每次只能檢測一種突變類型，不能滿足實際應(yīng)用的需要。本發(fā)明目標(biāo)檢測的Factor II和Factor V基因突變位點，如表所示表I Factor II位點突變的內(nèi)容
序號 Factor II位點突變的內(nèi)容簡寫
1SEQ ID NO. 33的第140位核苷酸，發(fā)生A — G突變A140G
2SEQ ID NO. 34的第78位t亥苷酸，發(fā)生G — A突變G78A表2 Factor V位點突變的內(nèi)容
序號 FactorV位點突變的內(nèi)容簡寫
ISEQ ID NO. 35的第125位核苷酸，發(fā)生G — A突變G125A

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供FactorII和FactorV基因多態(tài)性檢測液相芯片，該液相芯片可用于檢測Factor II和Factor V基因3種常見基因型A140G、G78A和G125A的野生型和突變型。實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下一種Factor II和Factor V基因多態(tài)性檢測液相芯片，包括有(A).針對不同突變位點分別設(shè)計的野生型和突變型的ASPE引物每種ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對目的基因突變位點的特異性引物序列組成，所述特異性引物序列為針對Factor II基因A140G位點的SEQ ID NO. 7及SEQ ID NO. 8 ;針對FactorII基因G78A位點的SEQ ID NO. 9及SEQ ID NO. 10 ;和/或針對Factor V基因G125A位點的 SEQ ID NO. 11 及 SEQID NO. 12 ;所述 tag 序列選自 SEQ ID NO. I SEQ ID NO. 6 ；(B).有anti-tag序列包被的、具有不同顏色編碼的微球,所述anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；所述anti-tag序列選自SEQ ID NO. 13 SEQ ID NO. 18，且所述anti-tag序列能相應(yīng)地與(A)中所選的tag序列互補配對；(C).用于擴增出需要檢測的、具有相應(yīng)突變位點的目標(biāo)序列的引物。優(yōu)選地，所述擴增引物為針對FactorII基因A140G位點的SEQ ID NO. 19和SEQIDN0. 20 ;針對 Factor II 基因 G78A 位點的 SEQ ID NO. 21 和 SEQ ID NO. 22 ;和 / 或針對Factor V 基因 G125A 位點的 SEQ ID NO. 23 和 SEQ ID NO. 24。優(yōu)選地，所述ASPE弓丨物為針對Factor II基因A140G位點的由SEQ ID NO. I和SEQ IDN0. 7組成的序列及由SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 8組成的序列；針對Factor II基因G78A位點的由 SEQ ID NO. 3和 SEQ ID NO. 9 組成的序列及由 SEQ ID NO. 4和 SEQ ID NO. 10組成的序列；和/或針對Factor V基因G125A位點的由SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 11組成的序列及由SEQ IDN0. 6和SEQ ID NO. 12組成的序列。本發(fā)明的另一目的是提供用于Factor II和Factor V基因多態(tài)性檢測的特異性 引物。實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下用于Factor II和Factor V基因多態(tài)性檢測的特異性引物，其為針對Factor
II基因 A140G 位點的 SEQ ID NO. 7 及 SEQ ID NO. 8 ;針對 Factor II 基因 G78A 位點的 SEQID N0.9 及 SEQ IDN0. 10 ;和 / 或針對 Factor V 基因 G125A 位點的 SEQ ID NO. 11 及 SEQ IDNO. 12。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于I.本發(fā)明所提供的檢測液相芯片的檢測結(jié)果與測序法的吻合率高達(dá)100%。且檢測所需要的時間遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于常用的測序技術(shù)，特別符合實際應(yīng)用需要。所制備的Factor II和Factor V基因多態(tài)性檢測液相芯片具有非常好的信號_噪聲比，并且所設(shè)計的探針以及anti-tag序列之間基本上不存在交叉反應(yīng)，tag標(biāo)簽序列、anti-tag標(biāo)簽序列的選取以及tag標(biāo)簽序列與具體ASPE引物的結(jié)合，能夠避免交叉反應(yīng)，實現(xiàn)多個SNPs位點的并行檢測。2.本發(fā)明通過發(fā)明人長期積累的設(shè)計經(jīng)驗和大量的實驗操作，從眾多的特異性引物中選取了最優(yōu)的組合。本發(fā)明設(shè)計的ASPE引物特異性引物能夠靈敏特異地識別目標(biāo)檢測的突變位點，準(zhǔn)確區(qū)分各種型別的基因型；在同一個反應(yīng)體系中，不同的特異性引物之間、特異性引物與非目標(biāo)檢測的PCR擴增產(chǎn)物之間基本上不存在交叉反應(yīng)，檢測特異性好，交叉反應(yīng)率低于3% ;除了能夠檢測單個位點突變情況，也能夠同時并行檢測多個突變位點的多態(tài)性情況，檢測效果一致。3.本發(fā)明的檢測方法步驟簡單，3種多態(tài)性位點檢測可通過一步多重PCR即可完成3條含有SNP位點的目標(biāo)序列的擴增，避免了反復(fù)多次PCR等復(fù)雜操作過程中存在的諸多不確定因素，因而可大大提高檢測準(zhǔn)確率，體現(xiàn)了精確的同時定性、定量分析特征。4.本發(fā)明不僅克服了傳統(tǒng)固相芯片敏感性不高，檢測結(jié)果的可重復(fù)性差的缺陷，同時對現(xiàn)有的液相芯片技術(shù)進行改進，使得所制備微球能適用于不同的檢測項目，具有很強的拓展性。檢測的熒光信號值大大提高，從而使得檢測的靈敏度進一步得到提高，信噪比增強，檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。5.本發(fā)明中的Factor II和Factor V基因多態(tài)性檢測液相芯片為多個位點多種基因型的并行檢測提供了一種不同構(gòu)思的技術(shù)方案，并產(chǎn)生了顯著的技術(shù)效果。同時，由于高通量高特異性等技術(shù)特征，更加符合實際應(yīng)用的需求。本發(fā)明的液相芯片技術(shù)將代表著生物靶標(biāo)檢測的技術(shù)發(fā)展趨勢。
具體實施例方式實施例I Factor II和Factor V基因多態(tài)性檢測液相芯片，主要包括有一、ASPE 引物針對Factor II和Factor V基因3種常見基因型A140G、G78A和G125A的野生型和突變型，分別設(shè)計特異性引物序列。ASPE引物由“Tag序列+特異性引物序列”組成。ASPE引物序列如下表所示表3 Factor II和Factor V基因的ASPE引物序列(Tag序列+特異性引物序列)
權(quán)利要求
1.一種Factor II和Factor V基因多態(tài)性檢測液相芯片，其特征是，包括有 (A).針對不同突變位點分別設(shè)計的野生型和突變型的ASPE引物每種ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對目的基因突變位點的特異性引物序列組成，所述特異性引物序列為針對 Factor II 基因 A140G 位點的 SEQ ID NO. 7 及 SEQ ID NO. 8 ;針對 Factor II 基因G78A 位點的 SEQ ID NO. 9 及 SEQ ID NO. 10 ;和 / 或針對 Factor V 基因 G125A 位點的 SEQID NO. 11 及 SEQ IDN0. 12 ;所述 tag 序列選自 SEQ ID NO. 1 SEQ ID NO. 6 ； (B).有anti-tag序列包被的、具有不同顏色編碼的微球,所述anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；所述anti-tag序列選自SEQ ID NO. 13 SEQ ID NO. 18，且所述anti-tag序列能相應(yīng)地與(A)中所選的tag序列互補配對； (C).用于擴增出需要檢測的、具有相應(yīng)突變位點的目標(biāo)序列的引物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的FactorII和Factor V基因多態(tài)性檢測液相芯片，其特征是，所述擴增引物為:針對FactorII基因A140G位點的SEQ ID NO. 19和SEQ ID NO. 20 ;針對 Factor II 基因 G78A 位點的 SEQ ID NO. 21 和 SEQ ID NO. 22 ;和 / 或針對 Factor V 基因 G125A 位點的 SEQ IDN0. 23 和 SEQ ID NO. 24。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的FactorII和Factor V基因多態(tài)性檢測液相芯片，其特征是，所述ASPE引物為針對Factor II基因A140G位點的由SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 7組成的序列及由SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 8組成的序列；針對Factor II基因G78A位點的由SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 9組成的序列及由SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 10組成的序列；和/或針對Factor V基因G125A位點的由SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 11組成的序列及由SEQ ID NO. 6和SEQ IDN0. 12組成的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的FactorII和Factor V基因多態(tài)性檢測液相芯片，其特征是， (A).所述ASPE引物為針對FactorII基因A140G位點的由SEQ ID NO. I和SEQ IDNO. 7組成的序列及由SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 8組成的序列；針對Factor II基因G78A位點的由SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 9組成的序列及由SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 10組成的序列；和針對Factor V基因G125A位點的由SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 11組成的序列及由SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 12組成的序列； (B).有anti-tag序列包被的、具有不同顏色編碼的微球,所述anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；所述anti-tag序列選自SEQ ID NO. 13 SEQ ID NO. 18，且所述anti-tag序列能相應(yīng)地與(A)中所選的tag序列互補配對； (C).所述擴增引物為針對FactorII基因A140G位點的SEQID NO. 19和SEQ IDNO. 20 ;針對Factor II 基因 G78A位點的 SEQ ID NO. 21 和 SEQ ID NO. 22 ;和針對Factor V基因 G125A 位點的 SEQ ID NO. 23 和 SEQ ID NO. 24。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的FactorII和Factor V基因多態(tài)性檢測液相芯片，其特征是，所述間隔臂為5-10個T。
6.一種用于Factor II和Factor V基因多態(tài)性檢測的特異性引物，其特征是，所述特異性引物序列為針對Factor II基因A140G位點的SEQ ID NO. 7及SEQ ID NO. 8 ;針對 Factor II 基因 G78A 位點的 SEQ ID NO. 9 及 SEQ ID NO. 10 ;和 / 或針對 Factor V 基因G125A 位點的 SEQ IDN0. 11 及 SEQ ID NO. 12。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種Factor II和Factor V基因多態(tài)性檢測特異性引物和液相芯片，該液相芯片主要包括有每種由5’端的tag序列和3’端針對目的基因突變位點的特異性引物序列組成的ASPE引物，所述特異性引物序列為針對Factor II基因A140G位點的SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8；針對Factor II基因G78A位點的SEQ ID NO.9及SEQ ID NO.10；和/或針對FactorV基因G125A位點的SEQ ID NO.11及SEQ ID NO.12；有anti-tag序列包被的微球；擴增引物。本發(fā)明所提供的檢測液相芯片的檢測結(jié)果與測序法的吻合率高達(dá)100％，實現(xiàn)多個突變位點的野生型和突變型并行檢測。
文檔編號C12N15/11GK102888444SQ201110200940
公開日2013年1月23日 申請日期2011年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月18日
發(fā)明者許嘉森, 吳詩揚 申請人:廣州益善生物技術(shù)有限公司